Эта статья входит в число добротных статей

Вложенная полимеразная цепная реакция

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схема вложенной ПЦР

Вложенная полимеразная цепная реакция (англ. nested PCR — «вложенная» ПЦР) — двухстадийная вариация ПЦР, используемая для снижения количества неспецифичных продуктов реакции[1]. На первой стадии амплифицируется участок, включающий в себя целевой фрагмент ДНК и фланкирующие его последовательности (то есть расположенные по краям фрагмента), к которым отжигается первая пара праймеров. На второй стадии добавляются праймеры, комплементарные концам целевого фрагмента. Так как продукт первого этапа содержит в себе целевой фрагмент (то есть конечный продукт внутри продукта первой стадии), данная вариация ПЦР называется вложенной[1].

Полимеразная цепная реакция[править | править код]

Основная статья: Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это процесс амплификации ДНК с использованием фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. Такая реакция нашла широкое применение в генетических лабораториях для выявления наличия в образцах определённого участка ДНК или РНК (во втором случае необходимо предварительно перевести РНК в ДНК реакцией обратной транскрипции). Также ПЦР используется в генной инженерии для получения необходимого фрагмента и его дальнейшего использования в клонировании, in vitro транскрипции и других целях. Важным этапом подготовки реакции является выбор праймеров, отжигаемых на концах целевого фрагмента. Нередко при этом праймеры отжигаются и на другие участки ДНК, приводя к смеси продуктов. Вероятность такого произойти возрастает с увеличением количества циклов ПЦР[1].

Праймеры[править | править код]

Во вложенной ПЦР используются две пары праймеров, добавляемые на двух последовательных этапах реакции. Первая пара называется внешней и служит для начальной амплификации участка, включающего в себя целевой фрагмент ДНК, при этом на данном этапе используется небольшое число температурных циклов (от 15 до 30). Вторая пара, называемая внутренней, отжигается на продукт первой и используется на втором этапе ПЦР с большим числом температурных циклов. Так как после первой стадии количество ДНК, содержащей целевой фрагмент, экспоненциально возрастает, а праймеры, используемые на каждом этапе, комплементарны разным последовательностям вокруг целевого участка ДНК, итоговая специфичность реакции увеличивается. Такой подход часто используется для получения редких фрагментов или участков низкой сложности (например, GC-богатых последовательностей)[2].

Этапы реакции и протокол[править | править код]

Протокол проведения вложенной ПЦР был впервые описан в 1993 году Kamolvarin и коллегами для диагностики бешенства[3]. С тех пор последовательность действий сохранилась практически без изменений[4]. Ниже описан оригинальный протокол из статьи.

Первый этап[править | править код]

После выделения РНК была проведена обратная транскрипция с использованием 50 пкмоль каждого из пары внешних праймеров для 1 мкг материала. После смесь, содержащая РНК/кДНК-гибрид и праймеры, была доведена до 50 мкл с помощью ПЦР буфера, содержащего 1,25 ед. Taq-ДНК-полимеразы и 62,5 мкмоль/л дДНФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат). На смесь наслоили сверху 50 мкл минерального масла и провели 30 циклов ПЦР (94 °С, 1 мин (плавление); 45 °С, 2 мин (отжиг); 72°С, 2,5 мин (элонгация))[3].

На первом этапе внешняя пара праймеров, комплементарная участкам вокруг целевого фрагмента ДНК, используется для амплификации данного фрагмента. Помимо целевого участка праймеры также могут отжечься и на другие участки. Итоговая смесь продуктов первого этапа включает в себя как целевую ДНК, так и примеси[3].

Второй этап[править | править код]

Для проведения второго этапа вложенной ПЦР отобрали аликвоту в 2 мкл из первой смеси и добавили к 23 мкл смеси, содержащей по 20 пкмоль внутренних праймеров, комплементарных участкам самого целевого фрагмента, 25 ммоль/л дДНФ и 1 ед Taq ДНК полимеразы. Провели 30 циклов амплификации с той же программой, что и в первом этапе[3].

При этом вероятность отжига праймеров на другие продукты первого этапа крайне низка и в большинстве случаев амплифицируется лишь целевой фрагмент ДНК[2][3].

Примеры использования[править | править код]

Вложенная ПЦР широко используется в задачах, требующих высокой специфичности, как-то: тест-системы[5], работа с малыми количествами материала[6], очистка образцов ДНК для их дальнейшего анализа и использования[7].

Конкретные случаи применения вложенной ПЦР:

Примечания[править | править код]

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Amplification of Nucleic Acids (англ.) // Diagnostic Molecular Biology. — 2019. — P. 215—247. — ISBN 9780128028230. — doi:10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2. [исправить]
  2. ↑ 1 2 Haff L A. Improved quantitative PCR using nested primers. (англ.) // Genome Research. — 1994. — 1 June (vol. 3, no. 6). — P. 332—337. — ISSN 1088-9051. — doi:10.1101/gr.3.6.332. [исправить]
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N., Tirawatnpong T., Rattanasiwamoke R., Tirawatnpong S., Panpanich T., Hemachudha T. Diagnosis of Rabies by Polymerase Chain Reaction with Nested Primers (англ.) // Journal of Infectious Diseases. — 1993. — 1 January (vol. 167, no. 1). — P. 207—210. — ISSN 0022-1899. — doi:10.1093/infdis/167.1.207. [исправить]
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. Principles and technical aspects of PCR amplification. — [Dordrecht]: Springer, 2008. — 1 online resource (325 pages) с. — ISBN 978-1-4020-6241-4, 1-4020-6241-9, 978-1-4020-6240-7, 1-4020-6240-0, 1-281-24237-3, 978-1-281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan, Chen Jiajun, Li Jia, Xu Yawei, Jin Hui, Xu Na, Yin Rui, Hu Guohua. Novel approach based on one-tube nested PCR and a lateral flow strip for highly sensitive diagnosis of tuberculous meningitis (англ.) // PLOS ONE. — 2017. — 30 October (vol. 12, no. 10). — P. e0186985. — ISSN 1932-6203. — doi:10.1371/journal.pone.0186985. [исправить]
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra, Mangano Andrea, Gastaldello René, Sen Luisa, Medeot Silvia. Usefulness of a Nested-polymerase chain reaction for molecular diagnosis of human T-cell lymphotropic virus type I/II (англ.) // Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. — 2004. — June (vol. 99, no. 4). — P. 377—380. — ISSN 0074-0276. — doi:10.1590/S0074-02762004000400006. [исправить]
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z., Britanova Olga V., Zvyagin Ivan V., Turchaninova Maria A., Bolotin Dmitriy A., Putintseva Ekaterina V., Lebedev Yuriy B., Chudakov Dmitriy M. Preparing Unbiased T-Cell Receptor and Antibody cDNA Libraries for the Deep Next Generation Sequencing Profiling (англ.) // Frontiers in Immunology. — 2013. — Vol. 4. — ISSN 1664-3224. — doi:10.3389/fimmu.2013.00456. [исправить]
  8. ↑ Llop Pablo, Bonaterra Anna, Peñalver Javier, López María M. Development of a Highly Sensitive Nested-PCR Procedure Using a Single Closed Tube for Detection of Erwinia amylovorain Asymptomatic Plant Material (англ.) // Applied and Environmental Microbiology. — 2000. — 1 May (vol. 66, no. 5). — P. 2071—2078. — ISSN 1098-5336. — doi:10.1128/AEM.66.5.2071-2078.2000. [исправить]
  9. ↑ Yang Xue, Hameed Uzma, Zhang Ai-Fang, Zang Hao-Yu, Gu Chun-Yan, Chen Yu, Xu Yi-Liu. Development of a nested-PCR assay for the rapid detection of Pilidiella granati in pomegranate fruit (англ.) // Scientific Reports. — 2017. — 20 January (vol. 7, no. 1). — ISSN 2045-2322. — doi:10.1038/srep40954. [исправить]
  10. ↑ Guo Ping, Yu Yongxin, Pan Yingjie, Yan Shuling, Wang Yongjie. Design and evaluation of nested PCR primers for specific detection of genogroup I noroviruses in oysters (англ.) // Molecular and Cellular Probes. — 2018. — August (vol. 40). — P. 40—43. — ISSN 0890-8508. — doi:10.1016/j.mcp.2018.06.002. [исправить]
  11. ↑ Lin Chao, Ying Furong, Lai Yanan, Li Xiaolong, Xue Xiangyang, Zhou Tieli, Hu Dongwei. Use of nested PCR for the detection of trichomonads in bronchoalveolar lavage fluid (англ.) // BMC Infectious Diseases. — 2019. — 10 June (vol. 19, no. 1). — ISSN 1471-2334. — doi:10.1186/s12879-019-4118-9. [исправить]
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Вложенная_полимеразная_цепная_реакция&oldid=112600496