Высокоэффективная жидкостная хроматография

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. HPLC, High performance liquid chromatography) — один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии.

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент).

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих других.

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, лигандообменную и другие.

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное — распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации, основности или кислотности, по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

Нормально-фазовая ВЭЖХ[править | править вики-текст]

Неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель:

  • Гексан:изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)
  • Хлороформ:метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)
  • Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

Обращённо-фазовая ВЭЖХ[править | править вики-текст]

Неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента почти всегда присутствует вода. В этом случае всегда можно обеспечить полное растворение БАС в подвижной фазе, почти всегда возможно использовать УФ-детектирование, почти все подвижные фазы взаимно смешиваются, можно использовать градиентное элюирование, можно быстро переуравновесить колонку, также колонку можно регенерировать.

Обычными элюентами для обращенно-фазовой ВЭЖХ являются:

  • Ацетонитрил:вода
  • Метанол:вода
  • Изопропанол:вода

Матрицы для ВЭЖХ[править | править вики-текст]

В качестве матриц в ВЭЖХ используются неорганические соединения, такие как оксид кремния (силикагель) или оксид алюминия, либо органические полимеры, такие как полистирол (сшитый дивинилбензолом) или полиметакрилат. Силикагель, конечно, в настоящее время общепризнан.

Основные характеристики матрицы:

  • Размер частиц (мкм);
  • Размер внутренних пор (Å, нм).

Получение силикагеля для ВЭЖХ:

  1. Формование микросфер поликремневой кислоты;
  2. Сушка частиц силикагеля;
  3. Воздушное сепарирование.

Частицы сорбента:

  • Регулярные (сферические): выше устойчивость к давлению, выше стоимость;
  • Несферические: ниже устойчивость к давлению.

Размер пор в ВЭЖХ — один из наиболее важных параметров. Чем меньше размер пор, тем хуже их проницаемость для молекул элюируемых веществ. А следовательно, тем хуже сорбционная емкость сорбентов. Чем крупнее поры, тем, во-первых, меньше механическая устойчивость частиц сорбента, а, во-вторых, тем меньше сорбционная поверхность, следовательно, хуже эффективность.

Прививки неподвижной фазы[править | править вики-текст]

Нормально-фазовая ВЭЖХ:

  • Неподвижная фаза с пропилнитрильной прививкой (нитрильной);
  • Неподвижная фаза с пропиламинной прививкой (аминной).

Обращенно-фазовая ВЭЖХ:

  • Неподвижная фаза с алкильной прививкой;
  • Неподвижная фаза с алкилсилильной прививкой.

Энд-кэппирование — защита непривитых участков сорбента дополнительной прививкой «маленькими» молекулами. Гидрофобный энд-кэппинг (С1, С2): выше селективность, хуже смачиваемость; гидрофильный энд-кэппинг (диол): ниже селективность, выше смачиваемость.

Детекторы для ВЭЖХ[править | править вики-текст]

  • Ультрафиолетовый
  • Фотодиодно-матричный
  • Флуориметрический
  • Электрохимический
  • Рефрактометрический
  • Масс-селективный