ДНК-микрочип

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Микрочип, содержащий около 40 000 проб

ДНК-микрочип (англ. DNA microarray) — это технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. Современный ДНК-микрочип состоит из тысяч дезоксиолигонуклеотидов (зондов, или проб), сгруппированных в виде микроскопических точек и закреплённых на твёрдой подложке. Каждая точка содержит несколько пикомолей ДНК с определённой нуклеотидной последовательностью. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа могут быть короткими участками генов или других функциональных элементов ДНК и используются для гибридизации с кДНК или мРНК (кРНК). Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно характеризуется при помощи флюоресценции или хемилюминесценции, что позволяет определять относительное количество нуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.

В обычном ДНК-микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твёрдой поверхности — стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твёрдых поверхностей.

ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.

История[править | править вики-текст]

Технология ДНК-микрочипов берёт начало от Саузерн блоттинга — методики, в которой фрагментированную ДНК переносят на подходящий носитель и затем с помощью зонда с известной нуклеотидной последовательностью определяют содержание целевой последовательности в образце. Впервые набор различных ДНК, объединённых в чип, был использован в 1987 году для определения особенностей регуляции экспрессии генов интерферонами[1]. Ранние ДНК-микрочипы были сделаны путём «раскапывания» микроколичеств кДНК на фильтровальную бумагу. Использование миниатюрных чипов для определения особенностей экспрессии генов было осуществлено в 1995 году[2] и полный эукариотический геном (Saccharomyces cerevisiae) был размещён на микрочипе в 1997 году[3].

Типы микрочипов[править | править вики-текст]

Printed (spotted) microarrays[править | править вики-текст]

"В этих ДНК-чипах пробы были изготовлены с помощью химического синтеза олигонуклеотидов и затем крепится к элементам массива. Пробы наносились иглой в наперед заданные точки подложки или печатались на мелкую сетку подложки принтером, который использовал ту же технологию печати, что и струйный принтер, но вместо капель чернил использовались капли проб нано- или пиколитрового объема."[4][5]

In-situ synthesized[править | править вики-текст]

"Такие микрочипы сделаны с использованием фотолитографии. Процесс выглядит следующим образом: на подложке находятся ковалентные молекулы-линкеры с защитной группой на свободном конце, которая может быть удалена с помощью света. УФ-свет направляется через фотолитографическую маску, снимает защиту и активирует выбранные сайты с гидроксильными группами, которые инициируют сцепление с защищенными нуклеотидами, которые крепятся к активированным сайтам. Маска разработана таким образом, что можно выбрать сайты экспозиции, и, таким образом, определить координаты в массиве, в которых нуклеотид будет прикреплена. Процесс повторяется, применяется новая маска, активизируя различные наборы сайтов и различные основания, позволяющих необходимым ДНК-пробам быть синтезированным на каждом сайте. Каждая проба на чипе требует четыре маски за раунд синтеза: одну маску для синтеза и три другие маски, чтобы предотвратить снятие защиты в том же месте в то время, как добавляются три других три нуклеотида. В среднем, каждая проба длиной в 25 нуклеотидов требует около 100 масок на чип. Такие микрочипы, как правило, используют несколько проб для каждого гена для повышения специфичности и поиска снипов."[4][5]

High-density bead arrays[править | править вики-текст]

«Технология Illumina BeadArray основана на цветокодированных 3-мкм кварцевых бусинах, которые случайным образом распределяются на слайде из кварцевого стекла или субстрате из волоконно-оптических пучков, который собираются в массив. Бусины расположены друг от друга на расстоянии 5.7 мкм и, таким образом, достигается с плотностью упаковки в 40000 элементов массива на квадратный миллиметр. Каждая бусина покрыта сотнями тысяч копий специфической олигонуклеотидной последовательности, с которой гибридизуется анализируемая последовательности. Каждый шарик имеет адрес из 23 олигонуклеотидов и пробу длиной в 50 олигонуклеотидов.

В процессе производства массива бусины случайным образом распределяются по субстрату таким образом, что в каждый массив попадает 50000 бусин. Каждый ген представлен двумя последовательностями проб. Серия декодирующей гибридизации используются, чтобы определить, какие олигонуклеотиды присутствуют в каких координатах для каждого массива.»[4][5]

Декодирование BeadArray[править | править вики-текст]

Стеклянным шарикам в массиве присвоены адреса. Адрес состоит из последовательности флуоресцентно-помеченных олигонуклеотидов, каждый из которых может иметь три значения — 0 (OFF), 1 (ON — FAM), 2 (ON — Cy3). Самыми частыми ошибками являются ошибке перехода одного из состояний ON в состояние OFF, более редкими — состояния OFF в состояние ON. Самыми редкими являются ошибки перехода одного состояния ON в другое, так как они являются сочетанием двух ошибок — неправильного распознавания одного из состояний ON на одном канале и, в то же время, неправильным распознаванием сигнала ON как сигнала OFF. Для проверки корректности используется код, схожий с кодом Хэмминга. Например, для адреса длиной восемь олигонуклеотидов, в расшифрованном адресе должно быть ровно шесть состояний ON и два состояния OFF. Таким образом, существует 1520 корректных и используемых адресов, 272 корректных и не используемых адресов (они используются для распознавания редких двойных ошибок) и 4769 некорректных адресов.[6]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Kulesh DA, Clive DR, Zarlenga DS, Greene JJ (1987). «Identification of interferon-modulated proliferation-related cDNA sequences». Proc Natl Acad Sci USA 84: 8453–8457. DOI:10.1073/pnas.84.23.8453. PMID 2446323.
  2. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO (1995). «Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray». Science 270: 467–470. DOI:10.1126/science.270.5235.467. PMID 7569999.
  3. Lashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath AF, Gentile C, Hwang SY, Brown PO, Davis RW (1997). «Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis». Proc Natl Acad Sci USA 94: 13057–13062. DOI:10.1073/pnas.94.24.13057. PMID 9371799.
  4. 1 2 3 Miller, M. B., & Tang, Y.-W. (2009). «Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology.». Clinical Microbiology Reviews 22(4): 611–633. DOI:10.1128/CMR.00019-09.
  5. 1 2 3 How DNA Microarrays are Built
  6. Gunderson, K. L., Kruglyak, S., Graige, M. S., Garcia, F., Kermani, B. G., Zhao, C., … Chee, M. S. (2004). «Decoding randomly ordered DNA arrays.». Genome Research 14(5): 870–877. DOI:10.1101/gr.2255804.

Литература[править | править вики-текст]

  • Peterson, L.E. (2013) Classification Analysis of DNA Microarrays. John Wiley and Sons. ISBN 978-0-470-17081-6