Двугибридный анализ

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Двугибридный анализ — молекулярно биологический метод для исследования белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействий.

История[править | править вики-текст]

В статье[1] , опубликованной в 1989 году, впервые был описан новый метод для обнаружения белок-белковых взаимодействий с помощью активатора транскрипции GAL4 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Однако, еще за 2 года до этого был нарисован первый набросок, описывающий идею практического применения разделения ДНК связывающего и активационного доменов белка GAL4[2]. С тех пор данный метод активно развивался и адаптировался. С помощью него стало возможно исследовать не только пары белков, но и мульти-белковые комплексы и белково-нуклеотидные взаимодействия. Помимо Saccharomyces cerevisiae стало возможным использовать Escherichia coli.[3]

Идея метода[править | править вики-текст]

Базовый компонент дрожжевой двугибридной системы это активатор транскрипции GAL4, эндогенно экспрессируемый белок длинной в 881 а.о. Содержит ДНК-связывающий (1-147 а.о.) и активирующий (771—881 а.о.) домены. Для проверки взаимодействия между белком А и Б делают химеры А-ДНК-связывающий домен (СД) и Б-активирующий домен (АД). В составе химерных белков домены сохраняют свои функции. Находясь в непосредственной близости, возможно обусловленной взаимодействием между белками А и Б, воссоздается исходная функция белка GAL4, и происходит активация репортерного гена.[4]

При дрожжевом двугибрином скрининге часто используются генетически модифицированные штаммы дрожжей, в которых биосинтез некоторых питательных веществ (как правило, аминокислот или нуклеиновых кислот) отсутствует. При выращивании на средах, где не хватает этих питательных веществ, дрожжи не в состоянии выжить. В мутантный штамм дрожжей вводится чужеродная ДНК в форме плазмид. Как правило, плазмиды, кодирующие АД- и СД- химерные белки вводятся в клетку раздельно. Чаще всего, слитый с СД белок является заранее известным белком, к которому ищется потенциально новый партнер, и плазмида, кодирующая данный химерный белок, изначально вводится во все клетки. Слитый с АД белок является либо единичным белком, либо целой библиотекой возможный партнеров, которая может быть представлена всеми белками, экспрессируемыми в конкретном организме, или же может быть получена путем синтеза случайных последовательностей ДНК. Независимо от источника, будет получен набор плазмид, которые позже будут трансфицированы в клетки. Методы с использованием библиотеки предполагают попадание всего одной пары плазмид в исследуемую клетку, тем самым каждая клетка выражает не более одного белка из библиотеки. [3]

При успешном взаимодействии А и Б, АД и СД факторы становятся опосредованно связаны, и АД оказывается в непосредственной близости от сайта начала транскрипции репортерного гена. При отсутствии взаимодействия нет и транскрипции. Следовательно, успешное взаимодействие связано с изменением клеточного фенотипа.[4]

Вариации двугибридной системы[править | править вики-текст]

Одногибридная система представляет собой способ для идентификации ДНК-белковых взаимодействий. АД заранее связан с СД, одако участок для посадки СД является случайным набором нуклеотидов. Кроме того, СД может быть представлен библиотекой ДНК-связывающих доменов. Если ДНК-связывающий домен взаимодействует с потенциальным участком связывания целевой ДНК, то АД будет активировать транскрипцию репортерных генов. Выбор ДНК-связывающих доменов, не ограничивается использованием одногибридной системы, и может быть выполнен с использованием двугибридной системы, в которой ДНК-связывающий домен различен, а А, Б белки и АД постоянны.[4]

Исследование РНК-белковых взаимодействий привело к появлению «тригибридных систем». В данной системе белки А и Б являются РНК-связывающими белками и вовсе не обязаны взаимодействовать между собой. Молекулы РНК используются в качестве линкера РНК-связывающих белков или доменов, тем самым обеспечивая близость активационного и ДНК-связывающего доменов.[4]

Так же прогрессивные исследования породили новый «одно-дву-гибридный» подход для скрининга библиотек для выявления новых факторов транскрипции. Одновременное использование одногибридной и двугибридной системы увеличивает точность получаемых результатов, и уменьшит количество ложных срабатываний[4].

Клеточные линии, пригодные для двугибридного анализа[править | править вики-текст]

В принципе, любая живая клетка может быть использована для двугибридой системы, однако имеются практические соображения о дешевизне и устойчивости выбранной клеточной линии.[5]

Дрожжи[править | править вики-текст]

Исторически первым для двугибридной системы организмом являются дрожжи. Дрожжи стабильный, простой и хорошо изученный модельный организм. Дрожжевые клетки поддерживают нейтральные значения pH внутри клетки, несмотря на кислые pH во внешней среде. Так же дрожжи слабочувствительны к внеклеточным токсинам, ими можно манипулировать не используя малекуляных методов.[4] Важно отметить необходимость сигналов ядерной локализации, так как весь генетический аппарат дрожжей локализован в ядре. При их отсутствии потенциально взаимодействующая пара белков не будет транслирована и не провзаимодействует.

Escherichia coli[править | править вики-текст]

Бактериальные системы могут быть использованы аналогично дрожжевым. Они имеют заведомо больший потенциал и являются более предпочтительными для использования двугибридной системы. Бактериальные системы позволяют использовать и анализировать библиотеки размером больше 108, имеют более быстрый темп роста и больший потенциал для проницаемости небольших молекул. Так же отсутствует необходимость в сигналах ядерной локализации, и появляется возможность изучать белки, токсичные для дрожжей. Ввиду более быстрых селективных методов обеспечивается низкий уровень ложных результатов (3·10−8)[5]

Применение двугибридной системы[править | править вики-текст]

Определение функции белка[править | править вики-текст]

При исследовании взаимодействия белков, возможно выявление новых функций. С помощью одного известного белка А0, библиотеки неизвестных белков Вn, и последующего сравнения с предварительно известной парой взаимодействующих белков A0B0 можно получить информацию о схожести Bn и B0. Похожие данные можно получить путем исследования взаимодействий известной библиотеки белков с одним белком с неизвестной функцией.[4]

Определение важных для взаимодействия аминокислотных остатков[править | править вики-текст]

Одна из наиболее популярных областей применения двугибридной системы. У заранее известной и взаимодействующей пары белков зачастую необходимо определить аминокислотные остатки, формирующие данное взаимодействие. При формировании библиотеки с точечными изменении аминокислотных остатков и использованием двугибридной системы появляется возможность определить их важность для взаимодействия с белком-партнером.[4]

Практическое применение[править | править вики-текст]

При создании лекарств часто возникает проблема побочных эффектов. Двугибридная система может использоваться для тестирования специфичности и точности доставки лекарств. Аналогичный подход используется и для токсинов и ядов.[4]

Цинковые пальцы[править | править вики-текст]

Для выбора цинковых пальцев (ZPF) с успехом применяется метод двугибридного анализа[3]. Основой подхода является создание библиотеки случайных ZPF (случайное изменение определенных аминокислотных остатков) и выбор тех, которые осуществляют связывание с UAS областью. Каждый ZFP обычно распознает только 3-4 пары оснований, поэтому для точного, локального связывания используется система из заранее известных ZPF, которые связываются по краям необходимой области и предотвращают связывание вне UAS.[3]

Заключение[править | править вики-текст]

Сильные стороны[править | править вики-текст]

  • Двугибридный анализ не требует специального дорогостоящего оборудования и может быть выполнены в любой лаборатории.
  • Двугибридный анализ является основным предварительным методом идентификации партнеров по взаимодействию.[4]
  • Двугибридный анализ можно проводить с целыми библиотеками, что говорит о масштабности и одновременно возможности автоматизации метода.

Недостатки[править | править вики-текст]

Основным и почти единственным недостатком является возможность большого количества ложных положительных и ложных отрицательных результатов. Существует большое количество причин, которые могут вызвать неспецифическое связывание или, наоборот, подавить экспрессию. Вероятность получения ложных результатов означает, что все полученные данные должны быть подтверждены более точными методами анализа, например коиммунопреципитацией белков. Так же возможно использование нескольких двугибридных систем или параллельный биоинформатический анализ.

Ссылки[править | править вики-текст]