Клонирование ДНК

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Клонирование ДНК (клонирование генов) — процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий in vitro. Клонирование ДНК часто применяют для амплификации фрагментов, содержащих гены, а также любые другие последовательности — например, промоторы, некодирующие последовательности, химически синтезированные олигонуклеотиды и случайные участки ДНК.

Рестрикция — лигирование[править | править вики-текст]

В классических методиках рестрикции и лигирования, клонирование фрагмента ДНК включает четыре стадии: разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование ДНК с вектором, трансфекция и последующий скрининг (отбор).

Выделение вставки[править | править вики-текст]

Первоначально необходимо выделить участок ДНК для клонирования. Часто препарат ДНК для клонирования получают при помощи полимеразной цепной реакции, а также разрезания ДНК рестриктазами, обработкой ДНК ультразвуком, фракционированием при помощи агарозного электрофореза ДНК. Выделение вставки может быть сделано технологией клонирования шотган, комплементарной ДНК, искусственным химическим синтезом.

Трансформация[править | править вики-текст]

После лигирования плазмидой трансформируют бактерии для наращивания. Бактерии далее выращивают на селективной среде для отбора колоний, содержащих встройку. Индивидуальные колонии отбирают и изучают на наличие встройки.

Трансфекция[править | править вики-текст]

После лигирования реакционную смесь со встроенным в требуемой ориентации вектором помещают в клетки. В зависимости от типа клеток используют химическую сенситизацию клеток, электропорацию или генные пушки. Для химической сенситизации не требуется специальное оборудование. Электропорацию используют в случае необходимости высокой эффективности трансфекции. Генные пушки применяют в случае растительных клеток и тканей, так как клеточная стенка растений не дает чужеродной ДНК проникать в цитоплазму и ядро.

Отбор[править | править вики-текст]

Получают культуры трансфецированных клеток. Так как описанные выше процедуры часто имеют низкую эффективность, требуются способы выявления клеток, содержащих требуемую вставку в правильной ориентации и отделение таких клеток от не содержащих вставки. Современные векторы для клонирования содержат селективные маркеры (как правило, гены устойчивости к антибиотикам) которые дают возможность расти только клеткам с правильной вставкой расти на селективной среде (с антибиотиком). Векторы для клонирования также часто содержат маркеры, обуславливающие окраску колоний, например при выращивании на среде, содержащей X-gal. Для точного подтверждения успешного клонирования, требуется проверка при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) или секвенирования ДНК.

Генная терапия[править | править вики-текст]

Генная терапия подразумевает введение работающего гена в клетки, в которых он отсутствует, что приводит к излечению болезни, связанной с отсутствием или неправильным функционированием гена. Генную терапию классифицируют на две категории. В первом случае мутации содержатся в стволовых или половых клетках, тогда весь организм и все потомки имеют дефект. Во втором случае мутация возникает в соматических клетках, возможна пересадка модифицированных клеток или тканей. Клинические испытания генной терапии соматическими клетками начались в конце 1990-х, для лечения рака крови, печени и легких.

Литература[править | править вики-текст]

  • Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. — 2. — Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. — 496 с. — 2000 экз. — ISBN 5940870988.
  • Жимулев И. Ф. Общая и молекулярная генетика. — 1. — Новосибирск: Издательство Новосибирского университета, 2002. — 459 с. — 2000 экз. — ISBN 5761505096.
  • Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.