Культура клеток

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Окрашенная культура клеток эпителия. На фото кератин (красный) и ДНК (зеленая)

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.

История[править | править исходный текст]

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор[1], содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней[2]. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыпленка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa.

Основные принципы культивирования[править | править исходный текст]

Выделение клеток[править | править исходный текст]

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс[3]. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными[4]. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом не утратить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации, но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путем активации гена теломеразы[5].

Культивирование клеток[править | править исходный текст]

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур[6][7]. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др[8]. Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование зараженных ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста[9].

Клетки можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно измененных таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяются органотипические культуры клеток, которые представляют собой трехмерную среду, в отличие от обычной лабораторной посуды. Этот система культивирования физически и биохимически наиболее сходна с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии).

Перекрестное загрязнение клеточных линий[править | править исходный текст]

При работе с клеточными культурами ученые могут столкнуться с проблемой перекрестного загрязнения.

Особенности выращивания клеток[править | править исходный текст]

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего могут возникнуть следующие проблемы:

  • Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
  • Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
  • Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
  • По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассажирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты(амфотерицин Б).

Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH. Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассажирование клеток[править | править исходный текст]

Пассажирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма. Суспензивные культуры пассажировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, ее обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.

Трансфекция и трансдукция[править | править исходный текст]

В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путем трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.

ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла[10]. Этот метод называется трансдукция.

Линии клеток человека[править | править исходный текст]

Одна из самых ранних культур клеток человека, полученная от Генриетты Лакс, которая умерла от рака шейки матки. Культура клеток HeLa окрашена по Хойсту. Измененные ядра окрашены в синий цвет.

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики, поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета», согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удаленных с их согласия[11].

Гибридома[править | править исходный текст]

Гибридома — это линия клеток, полученная в результате слияния нормальных лимфоцитов с «бессмертными» раковыми клетками. Используется для получения моноклональных антител. Лейкоциты, выделенные из селезенки или крови иммунизированных животных, производят антитела с необходимой специфичностью, но как у любой первичной культуры, их способность к пролиферации ограничена лимитом Хейфлика. Для иммортализации их искусственно сливают с «бессмертной» линией клеток миеломы, в результате чего происходит рекомбинация признаков. После этого линию клонируют и отбирают клоны, способные одновременно к неограниченной пролиферации и производящие антитела против избранного антигена.

Использование клеточных культур[править | править исходный текст]

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.

Продукты биотехнологии[править | править исходный текст]

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты, синтетические гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.

Тканевые культуры[править | править исходный текст]

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.

Вакцины[править | править исходный текст]

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого штаммом вируса H5N1, в настоящий момент правительство Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих[править | править исходный текст]

Культуры клеток растений[править | править исходный текст]

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определенного баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов.

Бактериальные, дрожжевые культуры[править | править исходный текст]

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара. Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры[править | править исходный текст]

Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих, растений, грибов или бактерий, в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов. Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Виды клеточных линий[править | править исходный текст]

Краткий перечень клеточных линий[править | править исходный текст]

Приведенный здесь список наиболее распространенных клеточных линий не является полным и исчерпывающим.

Линия клеток Расшифровка сокращения Организм Ткань Морфология Примечания и ссылки
293-T человек почка(эмбриональная) Производная от HEK-293 ECACC
3T3 cells "3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells" мышь эмбриональные фибробласты Известна также как NIH 3T3 ECACC
721 человек меланома
9L крыса глиобластома
A2780 человек яичник рак яичника ECACC
A2780ADR человек яичник производное A2780 с резистентностью к адриамицину ECACC
A2780cis человек яичник производное A2780 с резистентностью к цисплатину ECACC
A172 человек глиобластома злокачественная глиома ECACC
A431 человек кожный эпителий плоскоклеточная карцинома ECACCCell Line Data Base
A-549 человек карцинома легких эпителий DSMZECACC
B35 крыса нейробластома ATCC
BCP-1 человек периферические лейкоциты HIV+ лимфома ATCC
BEAS-2B bronchial epithelium + adenovirus 12-SV40 virus hybrid (Ad12SV40) человек легкие эпителий ATCC
bEnd.3 brain endothelial мышь кора головного мозга эндотелий ATCC
BHK-21 "Baby Hamster Kidney" хомяк почка фибробласты ECACCOlympus
BR 293 человек молочная железа рак
BxPC3 Biopsy xenograph of pancreatic carcinoma line 3 человек панкреатическая аденокарцинома эпителий ATCC
C3H-10T1/2 мышь эмбриональные мезенхимальные клетки ECACC
C6/36 Кусака бело-пёстрый (комар) ткани личинки ECACC
CHO Chinese hamster ovary серый хомячок (Cricetulus griseus) яичник эпителий ECACCICLC
COR-L23 человек легкие ECACC
COR-L23/CPR человек легкие ECACC
COR-L23/5010 человек легкие ECACC
COR-L23/R23 человек легкие эпителий ECACC
COS-7 Cercopithecus aethiops, origin-defective SV-40 обезьяна Cercopithecus aethiops почка фибробласты ECACCATCC
CML T1 Chronic Myelod Leukaemia T-lymphocyte 1 человек хроническая миелоидная лейкемия T-клеточная лейкемия Blood
CMT canine mammary tumor собака молочная железа эпителий
D17 собака остеосаркома ECACC
DH82 собака гистиоцитоз моноциты/макрофаги ECACC

J Vir Meth

DU145 человек карцинома простата
DuCaP Dura mater Cancer of the Prostate человек метастазирующий рак простаты эпителий 11317521
EL4 мышь T-клеточная лейкемия ECACC
EMT6/AR1 мышь молочная железа эпителий ECACC
EMT6/AR10.0 мышь молочная железа эпителий ECACC
FM3 человек метастазы в лимфатический узел меланома
H1299 человек легкие рак
H69 человек легкие ECACC
HB54 гибридома гибридома секретирует L243 mAb (против HLA-DR) Human Immunology
HB55 гибридома гибридома секретирует MA2.1 mAb (против HLA-A2 и HLA-B17) Journal of Immunology
HCA2 человек фибробласты Journal of General Virology
HEK-293 human embryonic kidney человек почка(эмбриональная) эпителий ATCC
HeLa Henrietta Lacks человек рак шейки матки эпителий DSMZECACC
Hepa1c1c7 clone 7 of clone 1 hepatoma line 1 мышь гепатома эпителий ECACC

ATCC

HL-60 human leukemia человек миелобласты клетки крови ECACCDSMZ
HMEC human mammary epithelial cell человек эпителий ECACC
HT-29 человек эпителий толстого кишечника аденокарцинома ECACC

Cell Line Data Base

Jurkat человек T-клеточная лейкемия белые клетки крови ECACC

DSMZ

JY человек лимфобласты В-клетки, иммортализованные EBV
K562 человек лимфобласты хроническая миелоидная лейкемия ECACC
Ku812 человек лимфобласты эритролейкемия ECACC

LGCstandards

KCL22 человек лимфобласты хроническая миелоидная лейкемия
KYO1 Kyoto 1 человек лимфобласты хроническая миелоидная лейкемия DSMZ
LNCap Lymph node Cancer of the Prostate человек аденокарцинома простаты эпителий ECACCATCC
Ma-Mel 1, 2, 3....48 человек линии клеток меланомы
MC-38 мышь аденокарцинома
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 человек молочная железа инвазивная карцинома протоков молочной железы ER+, PR+
MCF-10A Michigan Cancer Foundation человек молочная железа эпителий ATCC
MDA-MB-231 M.D. Anderson - Metastatic Breast человек молочная железа рак ECACC
MDA-MB-468 M.D. Anderson - Metastatic Breast человек молочная железа рак ECACC
MDA-MB-435 M.D. Anderson - Metastatic Breast человек молочная железа меланома или карцинома (единого мнения нет) Cambridge Pathology ECACC
MDCK II Madin Darby canine kidney собака почка эпителий ECACC ATCC
MOR/0.2R человек легкие ECACC
NCI-H69/CPR человек легкие ECACC
NCI-H69/LX10 человек легкие ECACC
NCI-H69/LX20 человек легкие ECACC
NCI-H69/LX4 человек легкие ECACC
NIH-3T3 National Institutes of Health, 3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells мышь эмбрион фибробласты ECACCATCC
NALM-1 периферическая кровь хроническая миелоидная лейкемия Cancer Genetics and Cytogenetics
NW-145 меланома ESTDAB
OPCN / OPCT Onyvax[1] Prostate Cancer.... линии клеток рака простаты Asterand
Peer человек T-клеточная лейкемия DSMZ
PNT-1A / PNT 2 линии клеток рака простаты ECACC
RenCa Renal Carcinoma мышь карцинома почки
RIN-5F мышь поджелудочная железа
RMA/RMAS мышь T-клеточный рак
Saos-2 человек остеоксаркома ECACC
Sf-9 Spodoptera frugiperda бабочка Spodoptera frugiperda яичник DSMZECACC
SkBr3 человек карцинома молочной железы
T2 человек гибридома В-клеток и Т-клеточной лейкемии DSMZ
T-47D человек молочная железа карцинома протоков
T84 человек карцинома толстого кишечника/ метастазы в легкое эпителий ECACCATCC
THP1 человек моноциты острая миелоидная лейкемия ECACC
U373 человек глиобластома-астроцитома эпителий
U87 человек глиобластома-астроцитома эпителий Abcam
U937 человек лейкемическая моноцитарная лимфома ECACC
VCaP Vertebra Prostate Cancer человек метастазирующий рак простаты эпителий ECACC ATCC
Vero 'Vera Reno' ('почка зеленой') / 'Vero' ('истина') африканская зеленая мартышка эпителий почки ECACC
WM39 человек кожа первичная меланома
WT-49 человек лимфобласты
X63 мышь меланома
YAC-1 мышь лимфома Cell Line Data Base ECACC
YAR человек B-лимфоциты трансформированы EBV [2] Human Immunology

См. также[править | править исходный текст]

Ссылки и примечания[править | править исходный текст]

  1. Раствор Рингера
  2. http://caat.jhsph.edu/pubs/animal_alts/appendix_c.htm
  3. Клетки можно выделить из тканей и разделить на различные типы
  4. ЛабоRUтория. Культивирование клеток и тканей. www.primer.ru(недоступная ссылка — история) (2003). Проверено 27 марта 2010. Архивировано из первоисточника 10 мая 2003.
  5. Теломераза. Тёмная материя (15 сентября 2006). Проверено 27 марта 2010. Архивировано из первоисточника 28 марта 2012.
  6. Инкубаторы СО2 Binder (Германия). Техсервис. Проверено 27 марта 2010. Архивировано из первоисточника 8 июня 2012.
  7. Лабораторное оборудование и расходные материалы. Инкубаторы (2007). Проверено 27 марта 2010. Архивировано из первоисточника 8 июня 2012.
  8. С помощью сред определенного химического состава можно идентифицировать специфические факторы роста
  9. LipiMAX purified lipoprotein solution from bovine serum. Selborne Biological Services (2006). Проверено 27 марта 2010. Архивировано из первоисточника 8 июня 2012.
  10. Механизм инфицирования вируса
  11. В.Богомолова. Кому принадлежит наше тело?. Arcanus (3 августа 2009). Проверено 27 марта 2010. Архивировано из первоисточника 8 июня 2012.