Метод Циля — Нельсена

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Изображение Mycobacterium tuberculosis, полученное с помощью метода Циля — Нельсена

Метод окраски по Цилю — Нельсену — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат карболовый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.

Метод назван именами немецких медиков — микробиолога Франца Циля (18571926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (18541898), которые разработали его в 18821883 гг.

Приготовление[править | править вики-текст]

Реактивы[править | править вики-текст]

  • спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
  • кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
  • кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;
  • фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
  • фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;
  • метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
  • глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;
  • вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов[править | править вики-текст]

  • Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 — 3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96- этилового спирта.

  • Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5 % водный раствор):

расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола 41 °C). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100 мл.

  • Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:

в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (1).

  • Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:

а) Раствор серной кислоты

К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл

концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам

сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.

Никогда не добавляйте воду в кислоту!

б) Раствор солянокислого спирта

Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно

использовать 3% солянокислый спирт: Этиловый спирт 96- 97 мл Концентрированная соляная кислота 3 мл. К 97 мл спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот.
  • Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:

растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Этапы окраски[править | править вики-текст]

1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё карболовый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2—3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 25%-го раствора серной кислоты или 3 % солянокислого спирта в течение 3-х минут, и промывают несколько раз водой[1][2].

3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 1 минуту, промывают водой и высушивают.

При окраске по методу Циля — Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет[2].

Техника микроскопического исследования препарата[править | править вики-текст]

Морфологические характеристики кислотоустойчивых микобактерий при окраске по методу Циля-Нельсена[править | править вики-текст]

Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза имеют в длину примерно 1 — 10 мкм, в ширину — 0,2 — 0,6 мкм. Обычно они видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул. Микроорганизмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры «V».

Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки более интенсивного окрашивания, в результате чего они похожи на «бусы», а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде «полос». В препарате могут выявляться также измененные коккоподобные кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или мицелиеподобные структуры. Однако в случае обнаружения измененных форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтвержден дополнительными методами исследования.

Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к М.tuberculosis, могут иметь различные формы — от длинных палочек до кокковидных форм с различной интенсивностью окрашивания. Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не только у микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут быть Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora. Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени кислотоустойчивой окраски — при частичной потере кислотоустойчивой окраски они приобретают фиолетово-малиновый цвет.

При культуральном исследовании ответ о выделении кислотоустойчивых микобактерий дается только после микроскопии окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из выросших колоний. При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулеза проявляют свои физико-химические особенности: они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию. Это обусловлено наличием в составе их клеточной стенки большого количества гидрофобных жировосковых субстанций. При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Циль-Нельсену, обнаруживаются яркие малиново-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами, образующие скопления или переплетения в виде «войлока» или «кос». Микобактерии туберкулеза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1 — 10 (чаще 1 — 4) мкм, шириной 0,2 — 0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами. Чаще в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно окрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.

Порядок проведения микроскопического исследования[править | править вики-текст]

При микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по Циль-Нельсену, следует просматривать не менее 100 полей зрения, чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают дополнительно 200 полей зрения. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20 — 50 полей зрения как при окраске по Циль-Нельсену, так и при люминесцентной микроскопии (см. таблицу). При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по одной и той же схеме:

  • либо 3 параллельных прохода по длине препарата;
  • либо 9 параллельных проходов по ширине.

Просматривать препарат начинают с левого верхнего выбранного в мазке поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной оси препарата до конца мазка, либо смещаясь вниз и затем вновь поднимаясь вверх и т. д., проходя все поля зрения до границы мазка. При увеличении микроскопа 1000x, то есть 100x для масляно-иммерсионного объектива и 10x для окуляра, при исследовании одной длины мазка (~ 20 мм) за один продольный проход просматривается около 100—120 полей зрения (диаметр поля зрения — 0,16 — 0,2 мм).

Градация результатов микроскопического исследования при окраске по методу Циль - Нильсена
Результат исследования Минимальное число полей зрения(п/з) Форма записи результата Интерпретация результатов исследования
КУМ не обнаружены в 300 п/з 300 ОТР. Отрицательный
1 - 2 КУМ в 300 п/з 300 Рекомендуется повторить исследование Результат не оценивается
1 - 9 КУМ в 100 п/з 100 "_N__" КУМ в 100 п/з[3] Положительный
10 - 99 КУМ в 100 п/з 100 1+[4] Положительный
1 - 10 КУМ в 1 п/з 50 2+[4] Положительный
Более 10 КУМ в 1 п/з 20 3+[4] Положительный

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Микроскопические методы выявления ТБ. Часть 2. Учебное пособие, предназначенное для обучения микроскопическим методам выявления ТБ. Пособие является частью Курса обучения выявления туберкулеза микробиологическими методами.
  2. 1 2 Приказ минздрава РФ от 21.03.2003 № 109. — 2003. — С. Приложение №11.
  3. Указать точное число КУМ.
  4. 1 2 3 Соответствие градаций: Точное число - единичные КУМ в препарате; 1+ - единичные КУМ в поле зрения; 2+ - умеренное количество КУМ; 3+ - значительное количество КУМ.