Нанопоровое секвенирование

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Нанопоровое секвенирование — семейство высокоэффективных методов определения последовательности молекул ДНК или РНК с использованием белковых или твердотельных пор диаметром в несколько нанометров.

Нанопора альфа-гемолизина в мембране, напряжение отсутствует
Под действием приложенного напряжения возникает ток ионов
При прохождении большой молекулы через пору (показана красным) ток ионов уменьшается

История[править | править вики-текст]

Первая работа, описывающая возможность применения нанопор для определения характеристик нуклеиновых кислот, появилась в 1996 году[1].

В 1999—2000 годах была показана возможность отличать одноцепочечную РНК от одноцепочечной ДНК, используя альфа-гемолизин стафилококка[2][3].

В 2001 году впервые была проведена работа по распознаванию наличия или отсутствия коротких последовательностей ДНК с помощью нанопор.[4] Только к 2009 году удалось показать возможность различать все основания в последовательности ДНК при использовании нанопор, необходимую для создания методов секвенирования[5].

В настоящий момент продемонстрировано принципиальное доказательство возможности применения данного метода — был секвенирован геном бактериофага phiX длиной 5,4 килобазы[6].

Принцип работы[править | править вики-текст]

Нанопоровые системы представляют собой реакционную камеру, внутри которой находится раствор электролита. Камера разделена на две части липидной мембранной или иной тонкой непроводящей поверхностью, в которую внедрена единичная нанопора. К частям камеры прикладывают напряжение, из-за чего возникает ток ионов через пору. Когда исследуемые молекулы проходят через пору по направлению поля, они уменьшают сечение, доступное для ионов, и сила тока падает. Анализируя изменение силы тока, можно определить свойства молекулы, проходящей через пору.

В случае нуклеиновых кислот, диаметр используемых нанопор составляет несколько нанометров, из-за чего ДНК и РНК способны проходить сквозь пору только в одноцепочечной форме, но не в двухцепочечной. При прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через пору отдельные нуклеотиды задерживаются в определенных сайтах внутри поры, в результате чего происходит измеримое падение силы тока.

Достоинства нанопорового секвенирования[править | править вики-текст]

По сравнению с уже существующими методами секвенирования применение нанопор обладает следующими преимуществами[7]:

  • Дешевизна и простота использования, достигается отсутствием необходимости приготовления образца и использования реактивов;
  • Высокая чувствительность, вплоть до секвенирования без амплификации ДНК из крови или слюны;
  • Высокая длина прочтений, вплоть до десятков тысяч оснований.

Варианты нанопорового секвенирования[править | править вики-текст]

В зависимости от того, сохраняют ли секвенируемые молекулы нуклеиновых кислот свою химическую целостность, выделяют следующие методы[8]

Секвенирование целых цепочек[править | править вики-текст]

В данном методе цепи нуклеиновых кислот не расщепляются. Перенос целых молекул ДНК и РНК через пору может осуществляться следующими способами:

Транспорт под действием напряжения[править | править вики-текст]

Так как ДНК и РНК несут на себе отрицательный заряд, то самым простым способом транспорта молекулы нуклеиновой кислоты через пору является их электрофоретический перенос вместе с ионами. Проблемой данного метода является то, что для измерения падения тока ионов через пору изначально требуется большой ток, чтобы получить хорошее соотношение сигнал/шум. Но при увеличении приложенного напряжения увеличивается и скорость, с которой молекула нуклеиновой кислоты преодолевает пору, а значит уменьшается время распознавания каждого отдельного основания, из-за чего качество распознавания падает.

Транспорт под действием напряжения с расплетанием дуплексов[править | править вики-текст]

Замедлить скорость прохождения одноцепочечной ДНК через пору можно, образуя с ней двухцепочечные участки с помощью комплементарных фрагментов ДНК. Тогда в ходе транспорта будет происходить расплетание данного участка, что и позволит дольше задерживать отдельные нуклеотиды в поре. Тем не менее, поскольку расплетение происходит не понуклеотидно, то время задержки нуклеотида в поре не является постоянным для всей последовательности.

Транспорт с использованием ферментов[править | править вики-текст]

Для того, чтобы каждый нуклеотид задерживался в поре на фиксированное время, можно использовать различные ферменты, которые будут пропускать нуклеотиды через пору по одному. Примером такого фермента является ДНК-полимераза. За счет приложенного напряжения комплекс ДНК-фермент изначально притянут к поре. Но теперь, прежде, чем очередной нуклеотид молекулы ДНК пройдет через пору, должен произойти один шаг синтеза второй цепи ДНК. Возникающая задержка оснований внутри поры позволяет более точно различать их.

Экзонуклеазное секвенирование[править | править вики-текст]

В данном методе цепь нуклеиновой кислоты нарезается на единичные нуклеотиды экзонуклеазой, расположенной в непосредственной близости от поры. Под действием поля отрицательно заряженные нуклеотиды самостоятельно попадают в пору, где происходит определение оснований.

Типы нанопор[править | править вики-текст]

Структура альфа-гемолизина — одного из нанопоровых белков, вид сверху и сбоку

Для секвенирования используют белковые нанопоры и синтетические твердотельные нанопоры[8].

Белковые нанопоры[править | править вики-текст]

Альфа-гемолизин[править | править вики-текст]

Альфа-гемолизин Staphylococcus aureus — нанопора, гептамерный белок, состоящий из двух доменов: ствола и головки поры. Головка поры содержит полость диаметром около 4,5 нм. В месте соединения ствола и головки находится сужение канала шириной 1,4 нм. Ствол поры состоит из 14 антипараллельных бета-тяжей, формирующих сквозной канал шириной около 2 нм. Внутри ствола находится три сайта распознавания, на которых задерживаются проходящие молекулы. Время пребывания разных нуклеотидов на этих сайтах разнится, что и позволяет отличать одни основания от других.

MspA[править | править вики-текст]

Порин A Mycobacterium smegmatis — нанопора, диаметром 1,2 нм. Обладает структурными особенностями, которые улучшают соотношение сигнал/шум при секвенировании ДНК по сравнению с альфа-гемолизином.

Моторный белок упаковки ДНК бактериофага phi29[править | править вики-текст]

В отличие от других пор данный белок в своей исходной форме не встраивается в мембрану, поэтому для его внедрения были использованы методы белковой инженерии. Ключевым отличием от вышеупомянутых белков является то, что имея больший диаметр канала, он способен пропускать двухцепочечную ДНК.

Твердотельные нанопоры[править | править вики-текст]

Помимо белковых нанопор также используются твердотельные нанопоры небиологической природы. Для анализа нуклеиновых кислот используют нанопоры в подложках из нитрида кремния и в монослоях графена. Их преимущества по сравнению с белковыми нанопорами: большая стабильность, разнообразие форм и размеров пор, сравнительная простота в использовании. Недостатками является то, что твердотельные нанопоры не обладают атомарной точностью в своей форме и возможностями регуляции, присущими белкам.

Коммерческое применение[править | править вики-текст]

Oxford Nanopore Techonologies[править | править вики-текст]

В феврале 2012 года на конференции AGBT во Флориде компания Oxford Nanopore Technologies представила прототипы двух платформ для высокопроизводительного секвенирования длинных фрагментов, основанные на нанопоровой технологии секвенирования целых цепочек: GridION и MinION. В качестве демонстрации был секвенирован геном бактериофага Phi X длиной 5386 оснований[6]. GridION — устройство, спроектированное для полногеномного секвенирования. Прототип имел 2000 отдельных нанопор, каждая из которых способна получать риды длиной до 5100 килобаз со скоростью 150 мегабаз/ч в течение 6 часов. MinION — одноразовый секвенатор небольшого размера, спроектированный для использования в домашних условиях, с запланированной ценой около 900$. Содержит 512 нанопор со сходными характеристиками[7].

По состоянию на конец 2013 года устройство на рынок не поступало.[9][10]

См. также[править | править вики-текст]

Ссылки[править | править вики-текст]

  1. Kasianowicz, JJ; Brandin E, Branton D, Deamer DW (1996-11-26). «Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel.». Proc Natl Acad Sci USA 93 (24): 13770–3. DOI:10.1073/pnas.93.24.13770. PMID 8943010.
  2. Akeson, M.; Branton, D., Kasianowicz, J. J., Brandin, E., and Deamer, D. W. (1999). «Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules.». Biophys J 77: 3227–3233. PMID 10585944.
  3. Meller, A.; Nivon, L., Brandin, E., Golovchenko, J., and Branton, D. (2000). «Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules». Proc Natl Acad Sci USA 97: 1079–1084.
  4. Howorka, S.; Cheley, S., Bayley, H. (2001). «Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores.». Nat Biotechnol 19: 636–639. DOI:10.1038/90236.
  5. Stoddart, D.; Heron, A., Mikhailova, E., Maglia, G., and Bayley, H. (2009). «Single nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.». Proc Natl Acad Sci USA 106: 7702–7707. DOI:10.1073/pnas.0901054106.
  6. 1 2 Eisenstein, Michael (2012). «Oxford Nanopore announcement sets sequencing sector abuzz». Nat Biotechnol 30 (04): 295-296. DOI:10.1038/nbt0412-295.
  7. 1 2 Maitra, RD; Kim J, Dunbar WB (2012). «Recent advances in nanopore sequencing». Elps 33 (23): 3418-3428. DOI:10.1002/elps.201200272. PMID 23138639.
  8. 1 2 Wanunu, Meni (2012). «Nanopores: A journey towards DNA sequencing». Phys Life Rev 9 (2): 125-158. DOI:10.1016/j.plrev.2012.05.010.
  9. Юрий Мильнер профинансирует электронное секвенирование ДНК, Lenta.ru (15 ноября 2013). Проверено 15 ноября 2013.
  10. Oxford Nanopore Launches MinION Access Program: #ASHG2013, NEXT GEN SEEK Making Sense of Next-Generation Sequencing Data (October 23, 2013). Проверено 15 ноября 2013.