Определение конформации хромосом

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Метод фиксации конформации хромосом[1] (англ. Chromosome Сonformation Сapture, 3C) — метод анализа трёхмерной структуры хромосом в ядре клетки. Изучение пространственной структуры хромосом имеет важное значение для понимания механизмов регуляции экспрессии генов, репликации и репарации ДНК, рекомбинации.

Регуляторные элементы могут располагаться на расстоянии нескольких млн пар оснований от генов, которые они контролируют[2]. Но регуляция может осуществляться с помощью физического взаимодействия, если участок хромосомы между регуляторным элементом и геном образует петлю. Примером может служить локус бета-глобина у мыши, который включает в себя 4 гена и локус контролирующую область (ЛКО), содержащую 6 гиперчувствительных к ДНКазе I участков и несколько сайтов связывания факторов транскрипции. Несмотря на то, что ЛКО располагается на расстоянии нескольких десятков килобаз от генов, сложная конформация участка ДНК между ними позволяет им непосредственно взаимодействовать друг с другом, с помощь которого контролируется экспрессия генов[3].

Метод фиксации конформации хромосом (Chromosome Сonformation Сapture, 3C)[править | править вики-текст]

Метод можно разбить на пять этапов:

  1. Клетки обрабатывают формальдегидом, что приводит к закреплению белок-белковых, белок-ДНК и белок-РНК взаимодействий, в результате чего взаимодействующие сегменты ДНК сшиваются белками.
  2. Фрагментация сшитых ДНК с помощью рестриктаз.
  3. Лигирование. В результате «склеиваются» концы сшитых ДНК. Эту стадию нужно проводить при низких концентрациях ДНК, чтобы лигировались концы сшитых фрагментов ДНК, а не случайных.
  4. Повышение температуры ведет к разрыву поперечных связей и образованию линейных химерных фрагментов ДНК. В результате будет создана библиотека попарно взаимодействующих фрагментов ДНК. (3C библиотека)
  5. Далее применяют метод количественной ПЦР, который позволит оценить вероятность взаимодействия двух конкретных участков генома. Если взять два праймера, которые им гомологичны, то наличие продуктов амплификации докажет, что данные участки генома находились в ядре клетки близко друг к другу.

Метод замкнутой фиксации конформации хромосом (Circularized Chromosome Conformation Capture, 4С)[править | править вики-текст]

Этот метод[4][5] имеет используется для того, чтобы найти участок генома, который взаимодействует с данной последовательностью ДНК. Он представляет собой объединение метода фиксации конформации хромосом и метода инвертированной ПЦР.

Первые 4 этапа совпадают с этапами метода фиксации конформации хромосом.

Этап 5а: Фрагментация химерных ДНК с помощью рестриктаз.

Этап 5б: Лигирование. В результате будет создана библиотека кольцевых химерных ДНК. (4C библиотека)

Этап 5в: Далее применяется метод инвертированной ПЦР. Анализ 4С библиотеки проводится с использованием ДНК-микрочипов.

Метод фиксации конформации хромосом «под копирку» (Carbon-Copy Chromosome Conformation Capture, 5С)[править | править вики-текст]

Этот метод[6] позволяет искать участки ДНК, которые взаимодействуют с несколькими выбранными участками генома. Он представляет собой объединение метода фиксации конформации хромосом и метода мультиплексной ПЦР.

Первые 4 этапа совпадают с этапами метода фиксации конформации хромосом.

Этап 5а: Лигирование адаптерных последовательностей с использованием Taq-лигазы.

Этап 5б: Применяется метод мультиплексной ПЦР, анализ 5С библиотеки проводится с использованием ДНК-микрочипов и секвенирования.

Методы ChiP-loop и ChiA-PET[править | править вики-текст]

Методы ChiP-loop[7] и ChIA-PET позволяют выделить участки генома, которые взаимодействуют с помощью специфических белков, например, транскрипционных факторов или белков инсуляторов. Они основаны на принципах имунопреципитации и лигирования сближенных в пространстве молекул ДНК.

См. также[править | править вики-текст]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Dekker J, Rippe K, Dekker M, Kleckner N (2002). «Capturing chromosome conformation». Science 295 (5558): 1306–1311. DOI:10.1126/science.1067799. PMID 11847345.
  2. Dekker J (2006). «The three 'C' s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.». Nat Methods. 3 (1): 17-21. DOI:10.1038/nmeth823. PMID 16369547.
  3. Dekker J (2003). «A closer look at long-range chromosomal interactions». Trends Biochem Sci. 28 (6): 277-80. DOI:10.1016/S0968-0004(03)00089-6. PMID 12826398.
  4. Zhao Z, Tavoosidana G, Sjölinder M, Göndör A, Mariano P, Wang S, Kanduri C, Lezcano M, Sandhu KS, Singh U, Pant V, Tiwari V, Kurukuti S, Ohlsson R (2006). «Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions». Nat. Genet. 38 (11): 1341–1347. DOI:10.1038/ng1891. PMID 17033624.
  5. Simonis M, Klous P, Splinter E, Moshkin Y, Willemsen R, de Wit E, van Steensel B, de Laat W (2006). «Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C)». Nat. Genet. 38 (11): 1348–1354. DOI:10.1038/ng1896. PMID 17033623.
  6. Dostie J, Dekker J (2007). «Mapping networks of physical interactions between genomic elements using 5C technology». Nat. Protoc. 2 (4): 988–1002. DOI:10.1038/nprot.2007.116. PMID 17446898.
  7. Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF, Kohwi-Shigematsu T (2005). «Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome». Nat Genet. 37 (1): 31-40. DOI:10.1038/ng1491. PMID 15608638.