ПЦР в реальном времени

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR) — лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце.[1]

Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода — флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани.[2]

Описание метода[править | править вики-текст]

Процедура очень похожа на процедуру классического ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции — плавление или денатурация двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Принцип ПЦР в реальном времени заключается в детекции ПЦР-продукта по мере его накопления. Сегодня это возможно сделать благодаря высокоспецифичным флуоресцентным зондам. Существует два основных подхода генерации света у таких зондов — во время элонгации и отжига, но, в обоих случаях флуоресценция усиливается с каждым новым циклом. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы.[3]

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта еще не очень много, поэтому ее трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растет сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать фермент, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для понятия уровня флуоресценции выше уровня шума[4].

Количество циклов, необходимое для того, чтобы флуоресценция достигла порогового уровня (над шумом) называется СТ-величиной. Пороговый уровень — не строго определенная величина, может подбираться для каждого случая отдельно.

Однако СТ-величина может зависеть от многих случайных факторов, например чувствительности детектора, качество фильтра и так далее. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — таких генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (Пример — ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции у бактерий). Соотношение определяют по следующей формуле: [N0 ]A/[N0 ]B = (1+E)(CTB-CTA)

Где [N0 ]A и [N0 ]B — начальные количества двух образцов, CTB и CTА — соответствующие CT-величины, а E — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1 или 0.9[4]

Разнообразие зондов[править | править вики-текст]

Мечение двуцепочечной ДНК[править | править вики-текст]

В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый syberGreen.

Метка, работающая в фазу элонгации[править | править вики-текст]

Существует другой способ использования зондов, к которым с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии два химических реагента будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится[3].

Метки, работающий в фазу отжига[править | править вики-текст]

Флуорогенная шпилька[править | править вики-текст]

Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать [пространственную структуру| вторичная структура ДНК] — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуроофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации[3].

Метка, основанная на методе FRET[править | править вики-текст]

Другой вариант мечения вновь-образующегося ПЦР-продукта основывается на методе FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определенной длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать[3].

Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).

ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции[править | править вики-текст]

Метод был изобретен для детекции количества ДНК в пробе, однако, последнее время все чаще используется немного видоизмененный количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР , RT-qPCR). Этот метод широко используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях[5].

Прежде, чем проводить стандартный ПЦР в реальном времени, нужно провести реакцию обратной транскрипции, для синтеза кДНК. Реакция обратной транскрипции проводится с помощью фермента — обратной-транскриптазы (РНК-зависимой ДНК полимеразы, ревертазы). Реакцию можно проводить без добавления праймера, однако наибольшая эффективность достигается, когда праймер добавлен. Существует три основных типа праймеров:

  1. Олиго dT праймеры — гибридизуются с polyA последовательностью, которая есть на 3’ -конце многих эукариотических мРНК.
  2. Случайная последовательность. Обычно используют либо гексамеры, либо нонамеры. Такие последовательности могут транскрибировать все мРНК
  3. Ген-специфичные праймеры используются, когда исследуется мРНК, экспрессируемая с определенного гена[4].

Реакция обратной транскрипции — ключевой этап в данном подходе, так как количество кДНК должно соответствовать количеству изучаемой мРНК. РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.

Полуколичественный ПЦР[править | править вики-текст]

Полуколичественный ПЦР (semi-quantitative PCR) — немного модифицированный метод количественного ПЦР с реакцией обратной транскрипции. Он часто используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции. ПЦР реакция останавливается, когда предполагается, что накопление продукта находится в экспоненциальной фазе роста и ПЦР-продукт можно детектировать. Далее, после электрофореза или саузерн-блота, можно измерить разницу в экспрессии нескольких образцов[5].

Применение[править | править вики-текст]

ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашел применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания.

Диагностические исследования[править | править вики-текст]

Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний[6]. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа[7].

Использование кПЦР также позволяет проводить количественные измерения и генотипирование (характеристика штаммов) вирусов, например, вируса гепатита В[8]. Степень инфекции, которая оценивается, как число копий вирусного генома на единицу ткани пациента, имеет большое значение во многих случаях. Например, вероятность реактивации вируса простого герпеса типа 1 зависит от количества инфицированных ганглиев.[9] В зависимости от того, интегрировал ли вирус в геном пациента (как, например, в случае вируса папилломы человека) или нет, количественный анализ осуществляется с применением обратной транскрипции или без нее.

Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из плотных опухолей (solid tumours)[10][11]и даже при некоторых формах лейкемии.[12][13]

Выявление циркулирующих опухолевых клеток[править | править вики-текст]

Рак молочной железы все еще является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. При чем, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ — является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальной происхождение и, следовательно экспрессируют определенный набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии.[14]

В микробиологии[править | править вики-текст]

ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения[15]. Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры.[16]

Научные исследования[править | править вики-текст]

В ходе проведения исследований, кПЦР в основном используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определенного гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды . Он также используется для определения зиготности трансгенных животных, используемых в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально модифицируется

кПЦР для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК)[править | править вики-текст]

мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру[17].

ПЦР в реальном времени для измерения количества белка[править | править вики-текст]

Для измерения количества белка в клетке используют следующий подход:

  1. Создают два вида антител к целевому белку с пришитыми последовательностями ДНК таким образом, что при взаимодействии с белком, 3’ конец одной последовательности оказывается недалеко от 5’-конца второй ДНК последовательности.
  2. Получается, что каждой молекуле белка соответствует известная нам последовательность ДНК, количество которой потом можно анализировать с помощью классического кПЦР-анализа[18].

Обнаружение фитопатогенов[править | править вики-текст]

Агропромышленность стремится производить семена и рассаду, не содержащую патогенных микроорганизмов, с целью предотвращения экономических потерь и увеличения срока хранения. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК фитофторы (Phytophthora ramorum), оомицетов и некоторых других патогенов, которые приводят к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК возбудителя и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS (internal transcribed spacer), внутренних транскрибируемых участков, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, которые характерны для каждого таксона.[19]

Детекция генетически модифицированных организмов[править | править вики-текст]

кПЦР (с использованием обратной транскрипции) может быть использована для детекции ГМО (генно модифицированных организмов), так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. При этом специфические праймеры используются для амплификации промоутера, терминатора или даже промежуточных последовательностей, используемых в процессе создания вектора. Так как процесс создания трансгенного растения обычно приводит к вставке более, чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается с помощью кПЦР. При этом в качестве контроля используют растение, содержащее данный ген в единственном экземпляре.[20][21]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM (2008). «Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis». Biotechniques 44: 619–626. DOI:10.2144/000112776. PMID 18474036.
  2. Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006). «Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.». Nat. Protoc. 1: 1559–1582. DOI:10.1038/nprot.2006.236. PMID 17406449.
  3. 1 2 3 4 Validation of Gene Expression Data by Quantitative Real Time PCR, Maurizio Provenzano and Simone Mocellin, 2007
  4. 1 2 3 The real-time polymerase chain reaction Mikael Kubista a,*, Jose´ Manuel Andrade b, Martin Bengtsson a, c, Amin Forootan d, Jiri Jona´k e, Kristina Lind a, f, Radek Sindelka e, Robert Sjo¨back a, Bjo¨rn Sjo¨green d, Linda Stro¨mbom a, Anders Sta˚hlberg a, g, Neven Zoric a, 2006
  5. 1 2 Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems, S A Bustin, 2002
  6. Sails AD (2009). «Applications in Clinical Microbiology». Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  7. FDA Authorizes Emergency Use of Influenza Medicines, Diagnostic Test in Response to Swine Flu Outbreak in Humans. FDA News, April 27, 2009.
  8. Yeh S.H. Tsai C.Y. Kao J.H. Liu C.J. Kuo T.J. Lin M.W. Huang W.L. Lu S.F. Jih J. Chen D.S. Others (2004)."Quantification and genotyping of hepatitis B virus in a single reaction by real-time PCR and melting …". Journal of Hepatology 41 (4): 659—666.
  9. Sawtell N.M. (1998). «The Probability of in Vivo Reactivation of Herpes Simplex Virus Type 1 Increases with the Number of Latently Infected Neurons in the Ganglia».Journal of Virology 72 (8): 6888-6892. PMC 109900.PMID 9658140.
  10. Cen, P.; Ni, X.; Yang, J.; Graham, D.Y.; Li, M. Circulating tumor cells in the diagnosis and management of pancreatic cancer. Biochim. Biophys. Acta 2012, 1826, 350—356.
  11. Young, R.; Pailler, E.; Billiot, F.; Drusch, F.; Barthelemy, A.; Oulhen, M.; Besse, B.; Soria, J.C.; Farace, F.; Vielh, P. Circulating tumor cells in lung cancer. Acta Cytol. 2012, 56, 655—660
  12. Bruggemann M., Gokbuget N., Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: Monitoring minimal residual disease as a therapeutic principle. Semin. Oncol.2012;39:47-57. doi: 10.1053/j.seminoncol.2011.11.009.
  13. Dinardo C.D., Luger S.M. Beyond morphology: Minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia. Curr. Opin. Hematol. 2012;19:82-88.
  14. Detection of Circulating Tumour Cells from Blood of Breast Cancer Patients via RT-qPCR. Ulrich Andergassen, Alexandra C. Kölbl, Stefan Hutter, Klaus Friese, Udo Jeschke. Cancers (Basel) 2013 December; 5(4): 1212—1220. Published online 2013 September 25. doi: 10.3390/cancers5041212 PMCID:PMC3875936
  15. Filion, M (editor) (2012). Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology.Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0.
  16. Probiotics: The Effects on Human Health and Current Prospects By Giselle Nobre Costa and Lucia Helena S. Miglioranza DOI: 10.5772/50048
  17. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available Vladimir Benes a, Mirco Castoldi b, c,*, 2010
  18. Expanding applications of protein analysis using proximity ligation and qPCR q Elana Swartzman *, Mark Shannon, Pauline Lieu, Shiaw-Min Chen, Chad Mooney, Eric Wei, Julie Kuykendall, Rouying Tan, Tina Settineri, Levente Egry, David Ruff, 2010
  19. Baldwin, B.G. (1992). «Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: An example from the Compositaogy». Molecular Phylogenetics and Evolution 1 (1): 3-16. doi:10.1016/1055-7903(92)90030-K. PMID 1342921.
  20. Holst-jensen A, R{o}nning S.B, L{o}vseth A, Berdal K.G. (2003). «PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs)» (w). Analytical and Bioanalytical Chemistry 375 (8): 985—993.
  21. Brodmann P.D, Ilg E.C, Berthoud H, Herrmann A. (2002). «Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties».Journal of AOAC International 85 (3): 646—653.

Литература[править | править вики-текст]

  • Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.

См. также[править | править вики-текст]