Пиросеквенирование

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Пример пирограммы, которую отображает прибор по завершении сеанса пиросеквенирования
Пиросеквенатор Pyromark Q24 с рабочей станцией

Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов.[1] Технология была разработана Полом Ниреном (Pål Nyrén) и его студентом Мустафой Ронаги, в Королевском Техническом Институте (Стокгольм) в 1996 году.[2][3][4]

Процедура[править | править вики-текст]

«Секвенирование путем синтеза» заключается в том, что для секвенирования одноцепочечной ДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путем синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.

Матрица одноцепочечной ДНК гибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатами (APS) и люциферином.

  1. Добавление одного из четырёх дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP)(в случае dATP добавляют dATPαS, который не является субстратом для люциферазы) инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезоксинуклеотид в цепочку. При этом стехиометрически высвобождается пирофосфат (PPi).
  2. Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат (АТФ) в присутствии аденозин-5´-фосфосульфата. АТФ выступает «топливом» для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ. Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой.
  3. Невключённые нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.

В настоящий момент существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300—500 нуклеотидов, что короче, чем 800—1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида.

Коммерциализация[править | править вики-текст]

Компания «Pyrosequencing AB», которая располагается в Уппсале, Швеция, коммерциализовала технологию и реагенты для секвенирования коротких участков ДНК. В 2003 году «Pyrosequencing AB» переименована в «Biotage». В 2008 году Qiagen приобрел Biotage. [5] Далее технология пиросеквенирования была лицензирована 454 Life Sciences. 454 разработала технологию пиросеквенирования, которая взяла начало от высокоэффективного секвенирования (High-throughput sequencing). Наиболее значимы приложения для секвенирования геномов и метагеномики. «GS FLX», наиболее крупная платформа 454 Life Sciences (в настоящее время приобретена Roche Diagnostics), может получать информацию о 400 миллионах нуклеотидах за 10-часовой период работы на одной установке. Каждый раунд работы стоит порядка пяти-семи тысяч долларов, что эквивалентно стоимости секвенирования генома млекопитающего в миллион долларов.

Литература[править | править вики-текст]

  • Elahi et al. (2004). «Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis». Methods Mol Biol 255: 211–219. PMID 15020827.
  • Fakhrai-Rad et al. (2002). «Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms». Hum Mutat. 19: 479. DOI:10.1002/humu.10078. PMID 11968080.

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Definition of pyrosequencing from the Nature Reviews Genetics Glossary. Проверено 28 октября 2008. Архивировано из первоисточника 31 марта 2012.
  2. Ronaghi et al. (1998-07-17). «A sequencing method based on real-time pyrophosphate». Science 281: 363. DOI:10.1126/science.281.5375.363. PMID 9705713.
  3. Ronaghi et al. (1996). «Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release». Analytical Biochemistry 242: 84. DOI:10.1006/abio.1996.0432. PMID 8923969.
  4. Nyrén, P. (2007). «The History of Pyrosequencing». Methods Mol Biology 373: 1–14. PMID 17185753.
  5. Qiagen acquires biosystems business from Biotage. Qiagen press release, October 1st, 2008