Плазмиды

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Хромосомная ДНК (1) и плазмиды (2) в бактериальной клетке

Плазми́ды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также у архей и эукариот.

В природе плазмиды обычно содержат гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам (в т. ч. устойчивость к антибиотикам), нередко они могут передаваться от одной бактерии к другой (иногда даже к бактерии другого вида) и, таким образом, служат средством горизонтального переноса генов.

Попадание плазмиды в клетку может осуществляться двумя путями: либо при непосредственном контакте клетки-хозяина с другой клеткой в процессе конъюгации, либо путём трансформации, то есть искусственное введение в клетку плазмиды, которому предшествует изменение экспрессии определённого гена клетки-хозяина (приобретение клеткой компетентности).

Искусственные плазмиды используются как векторы в клонировании ДНК, причём благодаря их способности к репликации обеспечивается возможность репликации рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине.

Размер плазмид варьирует от 1 до свыше 1000 тысяч пар оснований[1]. Количество идентичных плазмид в пределах одной клетки изменяется от одной до тысяч в зависимости от дополнительных обстоятельств. Плазмиды можно считать частью мобилома, поскольку они часто передаются при конъюгации — механизме горизонтального переноса генов.

Впервые термин плазмида (англ. plasmid) был предложен американским молекулярным биологом Джошуа Ледербергом в 1952 году[2].

Физические характеристики[править | править вики-текст]

Размеры и численность[править | править вики-текст]

Разделение сверхспирализованных форм кольцевых плазмид семейства pUC при электрофорезе в агарозном геле

Плазмиды характеризуются различной величиной. Если самые маленькие плазмиды содержат менее 2 тысяч пар оснований, то мегаплазмиды включают сотни тысяч пар оснований (обычно до 600 тыс.). В этом случае уже сложно провести чёткую границу между мегаплазмидой и минихромосомой. Некоторые виды бактерий могут одновременно содержать множество различных плазмид, так что их суммарный генетический материал превосходит по размеру таковой у самой бактерии. Например, симбиотическая почвенная бактерия Sinorhizobium meliloti содержит 3 репликона размером 3,65, 1,68 и 1,35 миллионов пар оснований (Mbp) соответственно вдобавок к её собственной хромосоме (6,69 Mbp)[3]. Соответственно изменяется и молекулярная масса плазмид — от 1,5 до 200 МДа, а также количество кодируемых плазмидами белков — от 1—2 до 200[4].

Количество плазмид на одну клетку также варьирует. Если у некоторых плазмид число копий на клетку составляет одну или несколько, то у других, главным образом мелких, плазмид их число может доходить до десятков и даже сотен. Численность плазмид зависит от характера их репликации[3]. Плазмиды способны реплицироваться независимо от хромосомы, однако они могут находиться под строгим или ослабленным контролем от неё. В первом случае плазмида реплицируется синхронно с хромосомой, и численность таких плазмид невелика (1—3). К плазмидам с ослабленным контролем репликации относят мелкие плазмиды[5]. Конкретные механизмы репликации плазмид рассматриваются ниже.

Геометрия[править | править вики-текст]

Хотя большинство плазмид представляют собой кольцевые молекулы, в настоящее время известно много примеров бактерий с линейными плазмидами. Поскольку линейным плазмидам необходим механизм репликации концов, которого нет у кольцевых хромосом, линейные плазмиды обычно имеются у бактерий с также линейными хромосомами[6].

Кольцевые плазмиды могут иметь более одной топологической конфигурации, что обеспечивается соотношением противоположного действия ДНК-гираз и топоизомераз. Обычно плазмидная ДНК находится в виде ковалентно замкнутого суперскрученного кольца. Если одна из цепей ДНК претерпевает разрыв, то суперскрученная плазмида расплетается в простое кольцо, которое при электрофорезе медленнее, чем суперскрученная форма, проходит через агарозный гель. Если разрыв претерпевают в противоположных позициях обе цепи ДНК, то образуется линейная форма. Вдобавок из-за гомологичной рекомбинации плазмидные мономеры могут объединяться в димеры, которые из-за своих более крупных размеров медленнее мономеров проходят в агарозном геле при электрофорезе. Явление различной скорости прохождения различных форм плазмид через агарозный гель при электрофорезе используется для их электрофоретического разделения.

В нижеследующей таблице приведены некоторые таблицы и их основные физические характеристики[3].

Плазмида Хозяин Размер плазмиды
(тыс. пар оснований)
Геометрия плазмиды Число копий плазмиды
на клетку
pUB110 Bacillus subtilis 2,3 Кольцевая 20—50
ColEl Escherichia coli 6,6 Кольцевая 10—30
lp25 Borrelia burgdorferi 24,2 Линейная 1—2
pNOB8 Sulfolobus sp.a
(архея)
41,2 Кольцевая 2—40
F Escherichia coli 99,2 Кольцевая 1—2
SCP1 Streptomyces coelicolor 350,0 Линейная 4
pSymA Sinorhizobium meliloti 1354,2 Кольцевая 2—3

Репликация плазмид[править | править вики-текст]

Как отмечалось выше, важным свойством плазмид является их способность к автономной репликации, в той или иной мере проходящей под контролем хромосомы. Этот контроль обусловлен тем, что плазмиды содержат не все необходимые для репликации гены, и поэтому в их репликации также принимают участие некоторые ферменты клетки[5]. Механизмы этого контроля подробнее освещены ниже.

Этапы репликации[править | править вики-текст]

В репликации плазмид выделяют 3 этапа:

  • инициация;
  • элонгация;
  • терминация.

Так как ДНК-полимераза не может начинать репликацию de novo, то есть с нуля, для начала её работы требуется затравка — праймер. Эта проблема решается следующими способами:

  1. Открытие цепей и последующее РНК-праймирование (репликация по тета-механизму или репликация по механизму замещения цепи);
  2. Разрыв одной из цепей с образованием свободного 3'-ОН конца (репликация по типу катящегося кольца).

Наиболее часто инициация катализируется несколькими инициаторными белками, кодируемыми плазмидой, которые узнают определённый сайт на ДНК плазмиды и таким образом определяют точку начала репликации (Ori). В некоторых случаях эти белки также непосредственно участвуют в создании праймера. Они также могут играть роль направляющих белков в сборке реплисомы плазмиды.

Элонгацию обычно осуществляет голофермент ДНК-полимераза III (в некоторых случаях на ранней стадии — ДНК-полимераза I) при участии некоторых белков хозяйской клетки, входящих в состав реплисомы.

Для наступления терминации репликации плазмиды требуется набор необходимых условий, как и для возможной последующей реинициации[7].

Контроль репликации[править | править вики-текст]

Механизмы контроля репликации работают на стадии инициации репликации. Этот контроль обеспечивает поддержание определённой численности плазмид в популяции бактерий. Молекулы, непосредственно его осуществляющие, могут быть:

  • РНК с противоположной полярностью;
  • последовательности ДНК (итероны);
  • РНК с противоположной полярностью вместе с белками.

Эти механизмы поддерживают определённую частоту циклов репликации на плазмиду в данной клетке и способны чувствовать отклонения от этой частоты[7].

Механизмы репликации[править | править вики-текст]

Репликация по тета-механизму[править | править вики-текст]

Этот механизм хорошо изучен в основном у плазмид грамотрицательных бактерий, хотя такой механизм описан и у плазмид грамположительных бактерий: плазмид стрептококков/энтерококков семейства Inc18, некоторых репликонов лактококков и у как минимум одной плазмиды Bacillus subtilis.

Репликация по тета-механизму включает в себя следующие этапы:

  1. Расплетание двух родительских цепей;
  2. Синтез праймерной РНК (пРНК) на каждой из них;
  3. Инициация репликации при помощи ковалентного нарастания пРНК на каждой из них.
  4. Синтез комплементарной цепи ДНК на каждой из родительских цепей. Одна из цепей при этом выступает лидирующей, другая — отстающей, хотя синтез цепей происходит одновременно.

Тета-репликация может начинаться одновременно с одной или нескольких точек и быть при этом одно- или двунаправленной. В электронный микроскоп репликационная структура выглядит как греческая буква Θ (тета), отчего она называется тета-структурой. Если же специальные ферменты разрезают эту структуру в точке начала репликации, по получается Y-образная структура («вилка»). Репликационные структуры также можно определить при одно- или двумерном электрофорезе. Этот анализ позволяет установить природу репликационных соединений, направление репликации, точки начала и конца репликации, угол между лидирующей и отстающей цепями.

За редкими исключениями плазмидам с тета-типом репликации необходим кодируемый плазмидой инициаторный белок Rep. Некоторые репликоны на ранних этапах репликации также нужнаются в ДНК-полимеразе I хозяйской клетки[7].

Репликация по механизму замещения цепи[править | править вики-текст]

Модель, иллюстрирующая репликацию по механизму замешения цепи

Наиболее известым примером плазмид с репликацией по механизму замещения цепи являются плазмиды семейства IncQ, чьим прототипом является плазмида RSF1010. Членам этого семейства для репликации необходимы 3 белка, кодируемые плазмидой. Эти белки запускают инициацию репликации в каждой из двух точек начала репликации, локализованных симметрично по одной на каждой цепи ДНК.

Сущность механизма замещения цепи заключается в том, что новосинтезированная цепь ДНК, комплементарная одной из родительских цепей, вытесняет одну из родительских цепей. В результате образуется одноцепочечная кольцевая ДНК (вытесненная родительская цепь) и суперспирализованная двуцепочечная ДНК (комплементарные друг другу оставшаяся родительская цепь и дочерняя). В дальнейшем двуцепочечная структура одноцепочечной кольцевой ДНК восстанавливается[7].

Репликация по типу катящегося кольца[править | править вики-текст]

Модель, иллюстрирующая репликацию по типу катящегося кольца

Многие мелкие плазмиды (менее 10 тыс. пар оснований) бактерий и архей, а также некоторые бактериофаги (например, фаг M13 E. coli) используют репликацию по типу катящегося кольца (разматывающегося рулона, σ-типа[8]).

Сущность этого механизма заключается в следующем. Вначале инициаторный белок Rep совершает одноцепочечный разрыв в цепи ДНК. Появившаяся при этом свободная 3'-OH группа служит праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III клетки хозяина. В этом процессе задействованы также и другие белки клетки-хозяина, например, ДНК-хеликаза и белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК. Так синтезируется лидирующая цепь и восстанавливается двуцепочечная структура исходной ДНК. Содержащая разрыв цепь ДНК при этом удаляется и происходит её репликация ДНК-полимеразой III, сопровождающаяся созданием праймера РНК-полимеразой. После полной репликации ДНК-полимераза I заменяет праймер на ДНК, а ДНК-лигаза сшивает концы, образуя тем самым окончательную двуцепочечную ДНК[7][9].

Плазмиды в клетке[править | править вики-текст]

Передача плазмид[править | править вики-текст]

Плазмида может попасть в клетку несколькими путями. Многие плазмиды могут передаваться при конъюгации бактерий, то есть при их непосредственном контакте; плазмиды также обычно наследуются при обычном делении клеток. Возможна также передача плазмид при трансдукции (то есть вместе с фагом) и при трансформации (плазмида захватывается клеткой извне).

Конъюгативные плазмиды[править | править вики-текст]

Наиболее известной конъюгативной плазмидой является F-плазмида E. coli, свойства которой освещены ниже. Конъюгативные плазмиды известны как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий.

Функции плазмид[править | править вики-текст]

Многие плазмиды не вызывают заметных изменений в фенотипе своих хозяев. Другие, напротив, ответственны за проявление у клетки-хозяина свойств, помогающих ей выжить в определённых условиях окружающей среды, и без этих плазмид бактерии погибали бы или их рост замедлялся[10].

Функции плазмид в клетке чрезвычайно разнообразны. К ним относят:

  • перенос генетического материала при конъюгации — F-плазмида;
  • плазмиды бактериоциногенности контролируют синтез белков, летальных для других бактерий — Col-плазмиды;
  • синтез гемолизинов — Hly-плазмиды (являются конъюгативными);
  • устойчивость к тяжёлым металлам;
  • устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды);
  • синтез энтеротоксинов — Ent-плазмиды;
  • устойчивость к УФ-излучению;
  • синтез антигенов, обеспечивающих адгезию бактерий на клетках в организме человека и животных — плазмиды антигенов колонизации;
  • система рестрикции-модификации;
  • расщепление камфоры (плазмида САМ), ксилола (плазмида XYL), салицилата (плазмида SAL) (обнаружены у некоторых штаммов Pseudomonas)[11][12].

В следующей таблицы приведены примеры отдельных естественных плазмид и функций, ими выполянемых[10]:

Плазмида Хозяин Размер плазмиды
(тыс. пар оснований)
Известная функция
pT181 Staphylococcus aureus 4,4 Устойчивость к тетрациклину
ColEl Escherichia coli 6,6 Образование колицина и
устойчивость к нему
pMBl Escherichia coli 8,5 Система рестрикции-модификации
pGKL2 Kluyveromyces lactisb 13,5 Плазмида-киллер
pAMpi Enterococcus faecalis 26,0 Устойчивость к эритромицину
pSK41 Staphylococcus aureus 46,4 Множественная устойчивость
pBM4000 Bacillus megaterium 53,0 Оперон рРНК
pI258 Staphylococcus aureus 28,0 Устойчивость к ионам тяжёлых металлов
pSLT Salmonella enterica ssp. typhimurium 93,9 Детерминанта вирулентности
pMT1 Yersinia pestis 101,0 Детерминанта вирулентности
pADP-1 Pseudomonas sp. 108,8 Катаболизм атразина (гербицид)
pWW0 Pseudomonas putida 117,0 Деградация ароматических углеводородов
pX01 Bacillus anthracis 181,7 Синтез энтеротоксинов
pSOL1 Clostridium acetobutylicum 192,0 Образование сольвента
pSymB Sinorhizobium meliloti 1683,3 Множественные функции

Наиболее изученными являются F-плазмида, Col- и R-плазмиды[12], на функциях которых мы остановимся подробнее.

F-плазмида[править | править вики-текст]

Наиболее известной конъюгативной плазмидой является F-плазмида, или F-фактор. F-плазмида является эписомой длиной около 100 тыс. пар оснований. У неё есть собственная точка начала репликации — oriV и точка разрыва — oriT[13]. F-плазмида, как и все конъюгативные плазмиды, кодирует белки, противодействующие прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной.

Помимо прочей генетической информации, F-плазмида несёт локусы tra и trb, организованные в один оперон в общей сложности содержащие 34 тыс. пар оснований. Содержащиеся в них гены ответственны за различные аспекты процесса конъюгации: синтез пилина и сборка половых пилей, запуск и регулирование процесса переноса генетического материала, разрыв в локусе oriT и расплетание цепи ДНК[14].

Кроме того, на половых пилях адсорбируются бактериофаги, специфичные к клеткам, содержащим F-плазмиду. К ним относятся РНК-содержащие фаги: R17, MS2, Qβ, f12, а также фаги с одноцепочечной ДНК: fd, f1, M13[15].

R-плазмиды[править | править вики-текст]

R-плазмида, или R-фактор, представляет собой кольцевую двуспиральную молекулу ДНК. В ней заключены гены, ответственные за механизм репликации и перенос свойств резистентности в клетку- реципиент (фактор переноса устойчивости, или RTF (от англ. resistance transfer factor)), а также гены, определяющие устойчивость к конкретному антибиотику (обозначаются r (от англ. resistance)[16].

R-фактор передаётся при трансдукции и обычно делении клетки. Некоторые R-плазмиды могут передаваться при конъюгации бактерий, то есть являются конъюгативными. Возможна передача R-плазмид между бактериями различных видов, родов и даже семейств. Так, RP1, плазмида, ответственная за устойчивость к ампициллину, тетрациклину и канамицину у бактерий рода Pseudomonas семейства Pseudomonadaceae может передаваться кишечной палочке E. coli, относящейся к семейству Enterobacteriaceae[17].

Механизм превращения R+-клетками антибиотиков в неактивную форму связан с действием на них специфических ферментов, кодируемых R-плазмидой[16].

С действием R-плазмид часто бывает связан тот факт, что некоторые бактериальные заболевания с трудом поддаются лечению при помощи известных на данный момент антибиотиков.

Col-плазмиды[править | править вики-текст]

Структура колицина А

Col-плазмиды (от англ. colicinogeny — колициногенность) определяют синтез особых белков — колицинов, подавляющий рост и размножение других бактерий, но безвредных для бактерий, их выделяющих.

Этот феномен был открыт в 1925 г. A. Gratia у штамма E. coli. Установлено, что E. coli синтезируют колицины различных типов: A, B, C, D и т.д. Колицины адсорбируются на клетках, лишённых Col-фактора, и, не проникая внутрь, нарушают их метаболизм, вызывая гибель клетки[18].

Классификация[править | править вики-текст]

Существует несколько систем классификации плазмид, базирующихся на:

Вне зависимости от типа, все плазмиды содержат точку инициации репликации (ori V).

Использование[править | править вики-текст]

Плазмиды широко используются в генной инженерии для переноса генетической информации и генетических манипуляций. Для этого создаются искусственные плазмиды — векторы, состоящие из частей, взятых из разных генетических источников, а также из искусственно созданных фрагментов ДНК.

См. также[править | править вики-текст]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. http://www.innovateus.net/+(2006-2011). What are Plasmids?. Пресс-релиз. Проверено 5 July 2013.
  2. Lederberg J (1952). «Cell genetics and hereditary symbiosis». Physiol. Rev. 32 (4): 403–430. PMID 13003535.
  3. 1 2 3 The Function and Organization of Plasmids: Basic Plasmid Characteristics Size and Copy Number.
  4. Билич, Крыжановский, 2009, с. 196
  5. 1 2 Билич, Крыжановский, 2009, с. 197
  6. The Function and Organization of Plasmids: Geometry.
  7. 1 2 3 4 5 Gloria del Solar, Rafael Giraldo, María Jesús Ruiz-Echevarría, Manuel Espinosa, Ramón Díaz-Orejas Replication and Control of Circular Bacterial Plasmids // Microbiology and Molecular Biology Review. — 1998. — Т. 62. — № 2. — С. 434—464.
  8. Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь. Репликация σ-типа.
  9. Saleem A. Khan Rolling-Circle Replication of Bacterial Plasmids // Microbiology and Molecular Biology Review. — 1997. — Т. 61. — № 4. — С. 442—455.
  10. 1 2 The Function and Organization of Plasmids: Plasmid-Encoded Traits.
  11. Билич, Крыжановский, 2009, с. 199—200
  12. 1 2 Biljana Miljkovic-Selimovic, Tatjana Babic, Branislava Kocic, Predrag Stojanovic, Ljiljana Ristic, Marina Dinic Bacterial plasmids // Acta Medica Medianae. — 2007. — Т. 46. — № 4. — С. 61—65.
  13. Ryan KJ, Ray CG (editors) Sherris Medical Microbiology. — 4th. — McGraw Hill, 2004. — P. 60–4. — ISBN 0-8385-8529-9
  14. Sheela Srivastava Genetics of Bacteria. — Delphi, India: Springer, 2013. — С. 79. — 215 с. — ISBN 978-81-322-1089-4
  15. Инге-Вечтомов, 2010, с. 247
  16. 1 2 Госманов и др., 2011, с. 126
  17. R Plasmids and Resistance to Antibiotics.
  18. Госманов и др., 2011, с. 126—127

Литература[править | править вики-текст]

  • Билич Г. Л., Крыжановский В. А. Биология. Полный курс: В 4 т. — издание 5-е, дополненное и переработанное. — М.: Издательство Оникс, 2009. — Т. 1. — 864 с. — ISBN 978-5-488-02311-6
  • Инге-Вечтомов С. Г. Генетика с основами селекции. — СПб.: Издательство Н-Л, 2010. — 718 с. — ISBN 987-5-94869-105-3
  • Госманов Р. Г., Галиуллин А. К., Волков А. Х., Ибрагимова А. И. Микробиология: учебное пособие. — СПб.: Издательство «Лань», 2011. — 496 с. — ISBN 978-5-8114-1180-1


Ссылки[править | править вики-текст]