В 1850-е годы вместе с Генри Бейтсом проводил исследования бассейна реки Амазонка и Малайского архипелага, по результатам которых им была собрана огромная естественно-научная коллекция и выделена так называемая «линия Уоллеса», отделяющая австралийскую фауну от азиатской. Впоследствии предложил разделить всю поверхность Земли на зоны — палеарктическую, неарктическую, эфиопскую, восточную (индо-малайскую), австралийскую и неотропическую, став, таким образом, основоположником такой дисциплины, как зоогеография.
