Протеиназа K

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
протеиназа К
Обозначения
Символы
UniProt P06873
Другие данные
Шифр КФ 3.4.21.64

Протеиназа K (протеаза K, эндопептидаза K; КФ 3.4.21.64)[1] — сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album (Tritirachium album)[2].

Протеиназа К способна расщеплять кератин, основной белок волос, отсюда и пошло её название. Основные участки в пептиде, распознаваемые и гидролизуемые протеиназой, — пептидные связи, соседствующие с карбоксильной группой алифатических и ароматических аминокислот с закрытой альфа-амино-группой. Широко используется благодаря её широкой специфичности.

Структура[править | править вики-текст]

Протеиназа К состоит из 384 аминокислот. Для ферментативной активности требует присутствие ионов Ca2+ (1 - 5 mM). Протеиназы K содержит два сайта связывания ионов Ca2+, которые расположены вблизи активного центра, но не принимают непосредственного участия в каталитической реакции. Фермент расщепляет белки преимущественно по гидрофобным аминокислотам (алифатические, ароматические и другие гидрофобных аминокислоты). Белки полностью расщепляются, при длительной инкубации или при высокой концентрации протеиназы К. После удаления ионов кальция, стабильность фермента снижается, но протеолитическая активность остается. Удаление ионов Ca2+ снижает каталитическую активность протеиназы К на 80%, но остаточной активности вполне достаточно для расщепления белков [3]. Поэтому, протеиназу К можно использовать для очистки нуклеиновых кислот в присутствии ЭДТА (ингибирующий магний-зависимых ДНКаз).

Активность протеиназы К[править | править вики-текст]

В молекулярной биологии протеиназа К широко применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК или РНК.

Повышение температуры реакции от 37°C до 60°C увеличивает активность протеиназы K в несколько раз, как и при добавление 0,5 - 1% SDS или гуанидина хлорида (3 M) или гуанидина тиоционата (1 M) или мочевины (4 M) [4]. Так как повышается доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, даже ускоряют их гидролиз.

Протеиназа К работает в широком диапазоне pH (4-12), её оптимум - pH 8.

Температура выше 65°C или присутствие трихлоруксусной кислоты или сериновых протеаз-ингибиторов AEBSF, PMSP или DFP ингибируют активность.

Протеиназы К не ингибируется в присутствии гуанидина хлорида (до 3 M), гуанидина тиоционата (до 1 M), мочевины (до 4 M), Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, EDTA, цитрат, йодуксусной кислоты и, а также в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, как Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) и Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK).


Активность протеиназы К в стандартных буферах

Буфер (pH 8.0, 50°C, 1.25 мкг/мл протеиназы К, 15 мин инкубации) Активность протеиназы К (%)
30 mM Tris·Cl 100
30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5% Tween 20; 0.5% Triton X-100; 800 mM GuHCl 313
36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% Tween 20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl 301
10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.5% SDS 128
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl 74
10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.45% Tween 20; 0.5% Triton X-100 106
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS 120
30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS 203

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Betzel C, Singh TP, Visanji M, et al. (July 1993). «Structure of the complex of proteinase K with a substrate analogue hexapeptide inhibitor at 2.2-A resolution». The Journal of Biological Chemistry 268 (21): 15854–15858. PMID 8340410.
  2. Ebeling W, Hennrich N, Klockow M, Metz H, Orth HD, Lang H (1974). «Proteinase K from Tritirachium album Limber». European Journal of Biochemistry 47 (1): 91–97. DOI:10.1111/j.1432-1033.1974.tb03671.x. PMID 4373242.
  3. Müller A, Hinrichs W, Wolf WM, Saenger W (1994). «Crystal structure of calcium-free proteinase K at 1.5-Å resolution». Journal of Biological Chemistry 269: 23108-23111. PMID 8083213.
  4. Hilz H, Wiegers U, Adamietz P (1975). «Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins». European Journal of Biochemistry 56 (1): 103–108. DOI:10.1111/j.1432-1033.1975.tb02211.x. PMID 1236799.