Стеклянный микроэлектрод

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
У этого термина существуют и другие значения, см. Электрод (значения).
Заполненный электролитом стеклянный микроэлектрод в держателе. Видна введенная в ствол электрода хлорированная серебряная проволока.

Стеклянный микроэлектро́д — очень тонкая стеклянная пипетка, заполненная электролитом. Используется в электрофизиологии. Разработка микроэлектродных методов позволила вести электрофизиологические исследования на уровне отдельных клеток.

Диаметр кончика стеклянного микроэлектрода около 0,5 мкм, иногда — менее 0,1 мкм[1], при разглядывании в оптический микроскоп он может быть неразличим.

Не следует путать этот инструмент с субтильными моделями ионометрических стеклянных электродов, в частности, также используемых в электрофизиологии.

Применение[править | править код]

Существует три основных способа использования микроэлектродов:

  • для внутриклеточной регистрации электрических параметров клеточных мембран,
  • для поляризации клеточных мембран электрическим током,
  • для введения различных веществ внутрь клетки (ионофорез) или подачи их на её поверхность (аппликация).

Дальнейшим развитием микроэлектродной техники явился метод локальной фиксации потенциала (метод пэтч кламп)[2]. Разработанные для этого метода специальные типы микроэлектродов обычно называют микропипетками. Чувствительность метода позволяет регистрировать активность отдельных ионных каналов клеточной мембраны.

История[править | править код]

До разработки стеклянных микроэлектродов в физиологии использовались металлические электроды, например, из вольфрамовой проволоки, заточенной электрохимически[3]. Малое электрическое сопротивление металлических электродов позволяло использовать с ними примитивную регистрирующую аппаратуру с малым входным сопротивлением. В некоторых областях такие электроды применяются и по сей день.

Впервые стеклянные микроэлектроды применили в 1949 году[4] Г. Линг и Р. В. Джерард в своей работе по регистрации мембранного потенциала миоцитов лягушки.

В. Л. Настук и А. Л. Ходжкин в 1950 году, используя[5] микроэлектродную технику, зарегистрировали потенциал действия мышечного волокна.

Использовать стеклянные микроэлектроды для аппликации веществ на мембрану клетки предложил В. Л. Настук в 1953 году[6].

В СССР микроэлектродную технику ввёл в практику Платон Григорьевич Костюк[7]. На Биологическом факультете МГУ Г. А. Курелла применил в своей работе одновременно микроэлектродную технику и миниатюрные стеклянные ионометрические электроды для исследований субклеточных структур[уточнить][8].

Конструкция и изготовление[править | править код]

Материалом для изготовления микроэлектродов служит стеклянный капилляр диаметром около 1 мм. Обычно используют марку стекла «Пирекс», реже применяют другие типы стекла — алюмосиликатное 38-ЗС и кварцевое стекло. Часто в качестве заготовок берут капилляр со вплавленными внутрь него стеклянными нитями — в таком случае в дальнейшем облегчается заполнение микроэлектрода электролитом. Заготовки тщательно очищают.

Приготовление микропипетки[править | править код]

Стеклянный микроэлектрод изготавливается вытягиванием и разрывом нагретого капилляра на специальном приспособлении — пуллере (микрокузнице). Параметры получающегося микроэлектрода зависят от выбранного сорта стекла, диаметра капилляра, температуры нагрева, момента начала рывка и его силы.[1] Наиболее совершенные модели современных пуллеров с микропроцессорным управлением позволяют программировать различные формы кончика вытягиваемой микропипетки[9], обеспечивая заранее заданные свойства и хорошую их повторяемость.

Цилиндрическая часть получившейся заготовки плавно суживается, переходя в колющую часть. Вытянутые микропипетки осматривают под микроскопом, при диаметре колющего кончика менее 0,5 мкм он неразличим, теряясь в интерференционной кайме. В некоторых случаях кончик микроэлектрода дополнительно особым образом затачивают или оплавляют.

Микроэлектроды для пэтч кламп дополнительно покрывают силиконом для обеспечения формирования гигаомного контакта при касании мембраны клетки.

Заполнение электрода[править | править код]

Заготовку заполняют электролитом, чаще всего 2—3 М раствором хлорида калия. Иногда используют электролиты другого состава или заполняют электрод легкоплавким металлом, например, сплавом Вуда[10].

Заполнение электродов может быть затруднено из-за очень малого диаметра его рабочей части. Для его облегчения предложен ряд методик: заполнение в вакууме, предварительное заполнение спиртом и затем вытеснение спирта электролитом[11]. В настоящее время широко применяется предложенный Тасаки[12] метод с использованием вплавленного в микропипетку стеклянного волокна, при этом микроэлектрод заполняется под действием капиллярных сил[13].

Подключение и контроль[править | править код]

Для подключения электродов к измерительной аппаратуре их фиксируют в заполненном электролитом цанговом держателе или вводят в цилиндрическую часть заполненного электрода хлорированную серебряную проволоку.

Качество заполненного и подключенного микроэлектрода контролируют, измеряя его сопротивление, которое имеет порядок единиц мегаом. Меньшее сопротивление свидетельствует о том, что кончик микроэлектрода обломлен, бо́льшее или хаотично меняющееся — о забитости колющего кончика грязью.

Готовые микроэлектроды плохо хранятся, поэтому изготавливают их обычно непосредственно перед началом эксперимента[14]. Некоторое время, не более суток, их можно хранить в холодильнике, погрузив в стаканчик с электролитом. При длительном хранении электроды теряют годность из-за кристаллизации электролита, возможно зарастание их колониями микроорганизмов[15].

Физико-химические свойства микроэлектродов[править | править код]

Между микроэлектродом и средой, в которую он погружен (физиологическим раствором, клеточным содержимым), протекают различные физико-химические процессы.

  • Диффузия. Концентрация электролита в микроэлектроде выше, чем в окружающей его среде, поэтому вещества электролита будут переходить в физиологический раствор или внутрь клетки за счёт диффузии[16][Пр. 1].
  • Ионофорез
  • Электроосмос
  • Гидростатические процессы

Электрические свойства микроэлектродов[править | править код]

Электрическое сопротивление — важнейший параметр микроэлектрода. Сопротивление обязательно контролируется перед началом эксперимента, а в ряде случаев — и в ходе работы. Для годного электрода сопротивление находится в диапазоне между 5 и 20 МОм. Сопротивление менее 1 МОм — признак обломленной колющей части, более 60 МОм — кончик электрода слишком тонок, либо закупорен выпавшими кристаллами или частицами исследуемого объекта[17]. Хаотично меняющееся сопротивление также характерно для загрязненного электрода[14]. Электроды с высоким сопротивлением имеют большие собственные шумы и чувствительность к электромагнитным помехам. При токах, превышающих 1 нА, вольт-амперные характеристики микроэлектродов могут становиться нелинейными. Расчёт сопротивления электродов возможен, но он сложен и не дает высокой точности, поэтому на практике сопротивление электрода определяют экспериментально[18].

Ёмкость электрода. Наличие у микроэлектрода собственной ёмкости искажает форму регистрируемого сигнала. Поэтому предпринимаются усилия для её снижения и компенсации: увеличивают диаметр цилиндрической части электрода, уменьшают его длину, для подключения к усилителю стараются использовать возможно более короткие провода. Для компенсация ёмкости электрода во входном каскаде усилителя применяется ёмкостная отрицательная обратная связь. Компенсирование ёмкости контролируется подачей на электрод прямоугольного сигнала — при верной настройке форма его фронта не искажена[19].

Потенциал смещения. Возникает по нескольким причинам. Основными являются:

  • диффузионный потенциал — возникающий между электролитом, заполняющим электрод, и раствором, в который он погружен. Для уменьшения диффузионного потенциала, в качестве электролита используют раствор хлорида калия, так как у ионов K+ и Cl- одинаков заряд и близки коэффициенты диффузии.
  • потенциал между серебряными проводниками микроэлектрода и опорного электрода
  • потенциал колющей части. Его возникновение связано со свойствами контакта электролита и стекла в узком кончике микропипетки[20].

Потенциал смещения подключенного к усилителю и погруженного в физиологический раствор электрода компенсируется при регулировке усилителя.

Для уменьшения нежелательного собственного потенциала используют также следующие приёмы[21]:

  • тщательная очистка стеклянных заготовок промывкой в щёлочи и спирте;
  • использование свежеизготовленных микропипеток;
  • использование для заполнения электролитов высокой концентрации;
  • подкисление электролита;
  • отбор электродов с малым омическим сопротивлением;
  • отбор электродов с низким собственным потенциалом.

Типы микроэлектродов[править | править код]

Многоканальные микроэлектроды[править | править код]

Многоканальные микроэлектроды часто используются в исследованиях с применением ионофореза (микроэлектрофореза). Они позволяют проводить одновременно регистрацию электрической активности и вводить активные вещества из соседних стволов микропипетки. Обычно число каналов такого сложного электрода не менее трёх: один служит для регистрации, второй — для компенсации и контроля эффектов тока и третий — для введения исследуемого вещества[22].

Отдельные каналы могут располагаться параллельно друг другу или коаксиально.

Большую паразитную ёмкость многоканальных микроэлектродов иногда компенсируют за счёт создания токопроводящего экрана путём напыления на его нерабочую часть металла или графита[22].

Для заполнения многоканальных микроэлектродов электролитом и растворами исследуемых веществ может применяться центрифугирование.

Подготовка многоканальных микроэлектродов технически сложна; высказывалось мнение, что их изготовление является настолько же искусством, насколько и наукой[23].

Составные микроэлектроды[править | править код]

Используют для тех же целей, что и многоканальные. Составные микроэлектроды сильнее травмируют клетку, однако по своим электрическим характеристикам часто превосходят многоканальные. Собирают из отдельных микроэлектродов, контролируя работу под микроскопом[22].

Плавающий микроэлектрод[править | править код]

Для регистрации электрической активности клеток сократимых тканей, например, миокарда, используют плавающие микроэлектроды, предложенные Вудбери и Брэди[24]. Они имеют облегчённую конструкцию, с очень короткой цилиндрической частью и закрепляются на тонкой серебряной или вольфрамовой проволоке каплей лака. Микроманипулятором электрод подводится к поверхности ткани и опускается на неё. Вкалывается в ткань он под действием собственного веса; при попадании электрода в клетку отмечается скачок напряжения.

За счёт упругости проволоки электрод может двигаться вместе с тканью, в которую он вколот.

Микропипетки для пэтч кламп[править | править код]

Основная статья: Метод локальной фиксации потенциала

Усилители для работы со стеклянными микроэлектродами[править | править код]

Основная статья: Усилитель биопотенциалов

Усилители биопотенциалов, использующиеся со стеклянными микроэлектродами, должны обладать следующими характеристиками[25]:

  • наличие схемы компенсации ёмкости входной цепи;
  • диапазон входных напряжений ± 1В;
  • регулировка смещения ± 300 мВ;
  • токи утечки менее 14 пА;
  • время нарастания фронта сигнала — не более 100 мс;
  • температурный дрейф — менее 50 мкВ.

Для работы методом пэтч кламп используются специализированные усилители.

См. также[править | править код]

Примечания[править | править код]

  1. ↑ С некоторыми упрощениями, скорость диффузии (моль/с) можно оценить следующим образом: , где  — концентрация электролита,  — коэффициент диффузии,  — половина внутреннего угла кончика электрода, постоянного для данного типа электродов,  — внутренний радиус колющего кончика. То-есть, скорость диффузии прямо пропорциональна толщине колющего кончика и концентрации заполняющего микроэлектрод электролита.

Источники[править | править код]

  1. ↑ 1 2 Камкин, 2011, с. 26.
  2. ↑ Hamill O.P., Marty F., Neher E. et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cell and cekk-free membrane patches // Europ. J. Physiok. — 1981. — Vol. 391 (2) p.85 — 100.
  3. ↑ Кожечкин, 1975, с. 63.
  4. ↑ 1949, G. Ling & R.W. Gerard, The normal membrane potential of frog sartorius fibers, in: J. Cell. Comp. Physiol., 34, p. 383-96.
  5. ↑ Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). «The electrical activity of single muscle fibers». J. Cell. Comp. Physiol. 35: 39-73
  6. ↑ Nastuk W. L. The Electrical Activity of the Muscle Cell Membrane at the Neuro-muscular Jumction — J. Cellular Comp. Physiol. — v. 42, p.249-272, 1953
  7. ↑ Костюк Платон Григорьевич // Большая советская энциклопедия : [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров. — 3-е изд. — М. : Советская энциклопедия, 1969—1978.
  8. ↑ Об исследованиях Г. А. Куреллы и Литвина Ф. Ф. — Кондрашин А. А., Самуилов В. Д. Солнце — энергия — жизнь. // Теория эволюции как она есть Архивная копия от 19 июля 2011 на Wayback Machine.
  9. ↑ [1] Архивная копия от 13 февраля 2018 на Wayback Machine Warner Instruments PMP-102 — пуллер с микропроцессорным управлением.
  10. ↑ Shanes A. M. — Electrochemical Aspects of Physiological and Pharmacological Action in Excitable Cells — Pharmacol. Revs., v.10, p.59-164, 1958
  11. ↑ Гоффман Б., Крейнфилд П. Электрофизиология сердца. — Перевод с англ. Цузмер Е. С. под ред. Бабского Е. Б. — М.: Изд-во иностранной литературы — 1962
  12. ↑ Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner M. J., Yu W. Y. A simple, direct and rapid method for filling microelectrodes. — Physiol. Behav., 1968, v.3, p. 1009—1010.
  13. ↑ Камкин, 2007.
  14. ↑ 1 2 Большой практикум по физиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. Г. Камкин и др. М.:Изд. центр «Академия» 2007.
  15. ↑ Кожечкин, 1975, с. 82.
  16. ↑ Камкин, 1989, с. 108.
  17. ↑ Камкин, 2011, с. 32.
  18. ↑ Камкин, 1989, с. 112.
  19. ↑ Камкин, 2011, с. 33.
  20. ↑ Камкин, 2011, с. 34.
  21. ↑ Кожечкин, 1975, с. 76.
  22. ↑ 1 2 3 Александров А. А. Метод микроэлектрофореза в физиологии. — Л.: Наука, 1983. — 148 с. — (Методы физиологических исследований).
  23. ↑ Kelly J. S. Microiontophoretic application of drugs onto single neurons. — In: Handbook of psychopharvacology. New York; London, 1975, v.2, p. 29-67
  24. ↑ Woodbury J.W., Brady A.J Intracellular recording from Moving Tissues with a Flexibly Mounted Microelectrode — Science, 123, p. 100—101, 1956
  25. ↑ Камкин, 2011, с. 43.

Литература[править | править код]

  • Камкин А. Г., Киселёва И. С. Техническое обеспечение микроэлектродного исследования клеток / под ред. И. С. Киселёвой. — М.: 2 МГОЛМИ им. Н. И. Пирогова, 1989. — 174 с. — 1000 экз. экз.
  • Камкин А. Г. и др. Большой практикум по физиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. — М.: Изд. центр «Академия», 2007. — ISBN 978-5-7695-2723-4.
  • Физиология: руководство к экспериментальным работам: учеб. пособие / под ред. Камкина Г. А., Киселёвой И. С. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 384 с. — ISBN 978-5-9704-1777-5.
  • Кожечкин С. Н. Микроэлектроды // Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток / под ред. Вепринцев Б. Н., Крастс И. В. — Пущино: Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1975. — 800 экз.
  • Костюк П. Г. Микроэлектродная техника. — Киев: «Наукова Думка», 1960.
  • Пёрвис Р. Микроэлектродные методы внутриклеточной регистрации и ионофореза: Пер. с англ = Microelectrode methods for intracellular recording and ionophoresis - R. D. Purves. — М.: «Мир», 1983. — 208 с. — 2300 экз.
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Стеклянный_микроэлектрод&oldid=129745959