PBR322

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Карта плазмиды pBR 322

pBR322плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. Создана в 1977 году мексиканскими биологами Франциско Боливаром (англ.)русск. и Раймондом Родригесом[1].

pBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару[2] и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1 (англ.)русск.); гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124 (англ.)русск.) и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101 (англ.)русск.). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причём 2 сайта (HindIII (англ.)русск. и ClaI (англ.)русск.) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR. Участок репликации ori (англ.)русск., заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1[3]. Он кодирует две РНК (RNAI и RNAII) и один белок (Rom или Rop).

Молекулярная масса плазмиды составляет 2,83·106 дальтон[4].

Код в базе данных GenBank — J01749[5].

Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза (англ. penicillin beta-lactamase) с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину[5].

История создания[править | править исходный текст]

В 1975 году, когда Франциско Боливар (англ.)русск. начал работу в Калифорнийском университете в Сан-Франциско в составе группы Герберта Бойера (англ.)русск., инструментарий, имевшийся в распоряжении молекулярных биологов, был крайне беден. Векторы клонирования имели очень большую молекулярную массу, их свойства были плохо изучены, удобные сайты клонирования отсутствовали[6].

Группа Бойера, в состав которой входило несколько талантливых биологов, занималась клонированием и изучением некоторых специфических генов. Однако работа продвигалась крайне медленно из-за отсутствия удобных инструментов, в первую очередь векторов клонирования, а также достаточно чистых эндонуклеаз рестрикции и ДНК-лигазы Т4. Со временем некоторые члены группы пришли к мысли о создании более совершенного инструментария.

В первое время Бойер не одобрял занятий своих сослуживцев, и большую часть работы пришлось проделать в нерабочее время. Однако когда плазмида pBR322 была создана, он стал активным сторонником и пропагандистом нового инструмента, заменив им использовавшуюся ранее плазмиду pMB9. Новая плазмида быстро распространилась по научному сообществу, в течение первых дней её получили более 300 лабораторий по всему миру. Оригинальный метод клонирования путём деактивации генов сопротивляемости к антибиотикам позволял легко планировать эксперименты и быстро анализировать полученные данные.

В то время проблемы биологической безопасности считалась чрезвычайно актуальными, поэтому плазмида была создана с сильно ограниченными возможностями распространения за пределами лаборатории. Она стала первым вектором типа EK2, сертифицированная Национальным институтом зоровья (англ.)русск. как соответствующая требованиям безопасности для рекомбинантных ДНК.

Наконец, очень сильно способствовало популярности новой плазмиды расшифровка и опубликование в 1979 году её нуклеотидной последовательности, сделанное Грегом Сатклиффом (англ. Greg Sutcliffe) из лаборатории Уолтера Гилберта[7].

В течение десятилетий pBR322 активно использовалась в генных исследованиях. Её кодовая последовательность и функции генов были настолько хорошо изучены, что стали использоваться как компоненты при создании новых инструментальных плазмид.

Оригинальная статья в журнале Gene[1], где было описано создание плазмиды, стала одним из лидеров по числу цитирований среди статей по молекулярной биологии в 1970-х и начале 1980-х годов[8].

Структура плазмиды[править | править исходный текст]

Нуклеотидная последовательность[править | править исходный текст]

Нуклеотидная последовательность pBR322 следующая[5]

pBR322
       1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA
      61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG
     121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT
     181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA
     241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG
     301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC
     361 CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG GCCGGCATCA CCGGCGCCAC
     421 AGGTGCGGTT GCTGGCGCCT ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGATC GGGCTCGCCA
     481 CTTCGGGCTC ATGAGCGCTT GTTTCGGCGT GGGTATGGTG GCAGGCCCCG TGGCCGGGGG
     541 ACTGTTGGGC GCCATCTCCT TGCATGCACC ATTCCTTGCG GCGGCGGTGC TCAACGGCCT
     601 CAACCTACTA CTGGGCTGCT TCCTAATGCA GGAGTCGCAT AAGGGAGAGC GTCGACCGAT
     661 GCCCTTGAGA GCCTTCAACC CAGTCAGCTC CTTCCGGTGG GCGCGGGGCA TGACTATCGT
     721 CGCCGCACTT ATGACTGTCT TCTTTATCAT GCAACTCGTA GGACAGGTGC CGGCAGCGCT
     781 CTGGGTCATT TTCGGCGAGG ACCGCTTTCG CTGGAGCGCG ACGATGATCG GCCTGTCGCT
     841 TGCGGTATTC GGAATCTTGC ACGCCCTCGC TCAAGCCTTC GTCACTGGTC CCGCCACCAA
     901 ACGTTTCGGC GAGAAGCAGG CCATTATCGC CGGCATGGCG GCCGACGCGC TGGGCTACGT
     961 CTTGCTGGCG TTCGCGACGC GAGGCTGGAT GGCCTTCCCC ATTATGATTC TTCTCGCTTC
    1021 CGGCGGCATC GGGATGCCCG CGTTGCAGGC CATGCTGTCC AGGCAGGTAG ATGACGACCA
    1081 TCAGGGACAG CTTCAAGGAT CGCTCGCGGC TCTTACCAGC CTAACTTCGA TCACTGGACC
    1141 GCTGATCGTC ACGGCGATTT ATGCCGCCTC GGCGAGCACA TGGAACGGGT TGGCATGGAT
    1201 TGTAGGCGCC GCCCTATACC TTGTCTGCCT CCCCGCGTTG CGTCGCGGTG CATGGAGCCG
    1261 GGCCACCTCG ACCTGAATGG AAGCCGGCGG CACCTCGCTA ACGGATTCAC CACTCCAAGA
    1321 ATTGGAGCCA ATCAATTCTT GCGGAGAACT GTGAATGCGC AAACCAACCC TTGGCAGAAC
    1381 ATATCCATCG CGTCCGCCAT CTCCAGCAGC CGCACGCGGC GCATCTCGGG CAGCGTTGGG
    1441 TCCTGGCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG
    1501 GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC
    1561 TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG
    1621 TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA
    1681 GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA
    1741 CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA
    1801 CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT
    1861 TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC
    1921 AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT
    1981 CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC
    2041 GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC
    2101 CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC
    2161 AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC
    2221 CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG
    2281 TACTGAGAGT GCACCATATG CGGTGTGAAA TACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC
    2341 GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC
    2401 GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA
    2461 ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG
    2521 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT
    2581 CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA
    2641 GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC
    2701 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT
    2761 AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG
    2821 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG
    2881 CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT
    2941 TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC
    3001 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG
    3061 CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC
    3121 AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT
    3181 AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA
    3241 AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT
    3301 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT
    3361 GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG
    3421 CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG
    3481 CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA
    3541 ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG
    3601 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG
    3661 GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT
    3721 CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA
    3781 TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG
    3841 GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC
    3901 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG
    3961 GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA
    4021 TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG
    4081 GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT
    4141 GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC
    4201 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA
    4261 CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT
    4321 ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAAGA A                    

Гены[править | править исходный текст]

Источник информации[9].

Ген Нуклеотидная
последовательность
Источник Примечание
tet (TcR) 86—1276 pSC101 Устойчивость к тетрациклину
bla (ApR) 4153—3293 Tn3 Устойчивость к ампициллину
rop 1915—2106 pMB1 Белок Rop
ori 3122—2534 pMB1 Участок репликации

Сайты рестрикции[править | править исходный текст]

Жирным шрифтом выделены уникальные сайты[9].

По координатам По алфавиту
Сайт Координата Ген Сайт Координата Ген
ClaI-BspDI 23 AatII-ZraI 4284
HindIII 29 AcuI 3000 ori
EcoRV 185 tet AcuI 4048 amp
BmtI-NheI 229 tet AhdI 3361 amp
BamHI 375 tet AlwNI 2884 ori
SgrAI 409 tet AseI 3537 amp
BanII 471 tet AvaI-BsoBI 1425
BanII 485 tet BamHI 375 tet
BtgI 528 tet BanII 471 tet
SphI 562 tet BanII 485 tet
EcoNI 622 tet BciVI 2682 ori
SalI-AccI-HincII 651 tet BciVI 4209
PshAI 712 tet BmtI-NheI 229 tet
EagI 939 tet BsaAI 2225
BseYI 949 tet BsaBI 1668
NruI 972 tet BsaI 3433 amp
BstAPI 1045 tet BseYI 949 tet
BspMI-BfuAI 1063 tet BseYI 2777 ori
PflMI 1315 BsgI 1650
BsmI 1353 BsmBI 2122
PflMI 1364 BsmI 1353
StyI 1369 BspEI 1664
AvaI-BsoBI 1425 BspMI-BfuAI 1063 tet
PpuMI 1438 BspQI-SapI 2350
MscI 1444 BsrBI 2404
BtgI 1447 BsrBI 4205
PpuMI 1480 BsrDI 3420 amp
BsgI 1650 BsrDI 3602 amp
BspEI 1664 BstAPI 1045 tet
BsaBI 1668 BstAPI 2291
XmnI 2029 rop BstZ17I-AccI 2244
PvuII 2064 rop BtgI 528 tet
BsmBI 2122 BtgI 1447
DrdI 2162 BtsI 3759 amp
Tth111I-PflFI 2217 BtsI 3787 amp
BsaAI 2225 ClaI-BspDI 23
BstZ17I-AccI 2244 DrdI 2162
BstAPI 2291 DrdI 2575 ori
NdeI 2295 EagI 939 tet
BspQI-SapI 2350 EarI 2351
EarI 2351 EarI 4155
BsrBI 2404 EcoNI 622 tet
PciI-AflIII 2473 EcoRI 4359
DrdI 2575 ori EcoRV 185 tet
BciVI 2682 ori HincII 3905 amp
BseYI 2777 ori HindIII 29
AlwNI 2884 ori MscI 1444
AcuI 3000 ori NdeI 2295
AhdI 3361 amp NruI 972 tet
BsrDI 3420 amp PciI-AflIII 2473
BsaI 3433 amp PflMI 1315
AseI 3537 amp PflMI 1364
BsrDI 3602 amp PpuMI 1438
PstI 3607 amp PpuMI 1480
PvuI 3733 amp PshAI 712 tet
BtsI 3759 amp PstI 3607 amp
BtsI 3787 amp PvuI 3733 amp
ScaI 3844 amp PvuII 2064 rop
HincII 3905 amp SalI-AccI-HincII 651 tet
XmnI 3961 amp ScaI 3844 amp
AcuI 4048 amp SgrAI 409 tet
EarI 4155 SphI 562 tet
SspI 4168 SspI 4168
BsrBI 4205 StyI 1369
BciVI 4209 Tth111I-PflFI 2217
AatII-ZraI 4284 XmnI 2029 rop
EcoRI 4359 XmnI 3961 amp

Плазмида pBR322 в массовой культуре[править | править исходный текст]

По сюжету романа Майкла Крайтона «Парк юрского периода» части плазмиды pBR322 используются для воссоздания ДНК динозавров[10]. Хотя само название плазмиды не упоминается на страницах книги, там приводится последовательность нуклеотидов, являющаяся по сюжету фрагментом восстановленной ДНК динозавра. Поиск в базе данных GenBank при помощи поисковой программы BLASTN находит большое количество совпадений с генной последовательностью pBR322.

См. также[править | править исходный текст]

Ссылки[править | править исходный текст]

Примечания[править | править исходный текст]

  1. 1 2 Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa J.H., Falkow S. (1977). «Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system». Gene 2 (2): 95-113. PMID 344137.
  2. Watson, N. (1988). «A new revision of the sequence of plasmid pBR322». Gene 70 (2): 399–403. DOI:10.1016/0378-1119(88)90212-0. PMID 3063608. Проверено 2009-03-27.
  3. Qiagen Plasmid Resource Center. Growth of Bacterial Cultures(недоступная ссылка — история). Архивировано из первоисточника 16 октября 2005.
  4. pBR322 Vector.
  5. 1 2 3 pBR322 Nucleotide Sequences, NCBI Sequence Viewer v2.0.
  6. Все материалы данного раздела, кроме абзацев, где источник указан особо, взяты из статьи Francisco Bolivar Zapata (November 19, 1990). «Multipurpose Tools in Molecular Biology». Current Contents 47: 12.
  7. Sutcliffe J. G. (1979) Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77—80, PMID: 383387.
  8. Garfield E. (1 October 1984) The articles most cited in 1961-1982. 4. 100 additional Citation Classics. Current Contents, 40: 3—9.
  9. 1 2 Restriction Maps. pBR322.
  10. Mark Boguski (1992). «A Molecular Biologist Visits Jurassic Park». Biotechniques 12: 668–9. Проверено 2009-03-27.