Редактирование: Иммуноферментный анализ

{{перенаправление|ИФА|IFA}}

[[Файл:Microtiter plate.JPG|thumb|96-луночный микропланшет, используемый для ИФА.]]
'''Иммуноферментный анализ''' (сокращённо '''ИФА''', {{lang-en|enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA}}) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция [[антиген]]-[[антитело]]. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическую энзимологию, знание физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на основные принципы аналитической химии.

ИФА является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимической реакции (то есть [[антитела]] связываются исключительно с определёнными [[антиген]]ами, и ни с какими другими) сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки (вплоть до 10<sup>−21</sup> моль в образце). Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации, возможность создания каскадных систем усиления различных химических сигналов, относительно низкая цена и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, микробиологическую и пищевую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования.<ref name="Egorov">{{книга
| автор = А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова
| заглавие = [http://www.booksshare.net/index.php?id1=4&category=biol&author=egorov-am&book=1991 Теория и практика иммуноферментного анализа]
| место = М.
| издательство = Издательство "Высшая школа"
| год = 1991
| isbn = 5-06-000644-1
| страницы = 3—42
}}</ref>

== Теоретические основы ==
Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений, пептидных и стероидных гормонов, фармакологических препаратов, пестицидов, до вирусов и бактерий, и даже до других антител, — многообразия принципов связывания и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода. По одним лишь вариантам регистрации ферментативной активности возможно применение фотометрических, флуорометрических, био- и хемолюминесцентных методов, а в ряде случаев (особенно связанных с решением технологических задач) успешно применяются электрохимические и микрокалориметрические датчики.

=== Физико-химические основы взаимодействия ===
Иммунохимическая реакция в растворе протекает в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса между антителами и антигенами состава 1:1 (вследствие наличия в молекуле антител более одного центра связывания для поливалентных антигенов возможно дальнейшее многостадийное образование сложных комплексов с различным соотношением компонентов). Образование комплекса обеспечивается [[Гидрофобность|гидрофобными]], [[Ионная связь|ионными]], [[Силы Ван-дер-Ваальса|ван-дер-ваальсовыми]] и [[Водородная связь|водородными]] связями. Наиболее существенную роль играют силы гидрофобного взаимодействия, которые стабилизируют всю систему (уменьшают её [[Энергия Гиббса|свободную энергию]] при одновременном увеличении [[Энтропия|энтропии]]). Эффективность таких взаимодействий возрастает с повышением температуры.

В простейшем случае взаимодействие одного центра связывания антитела гепатита (''AT'') с одновалентным антигеном (''AG'') может быть представлено схемой

: <math>AG+AT\rightleftharpoons AG\times AT</math>.

С количественной стороны специфичность взаимодействия антиген-антитело характеризуется через [[аффинность]] антител или равновесную константу образования иммунокомплекса ''Ka'' (внутреннюю аффинность, л/моль):

: <math>Ka=\frac{[AG\times AT]}{[AG]\times [AT]}</math>,

где [''AG''], [''AT''] и [''AG × AT''] — равновесные концентрации свободного антигена, свободного антитела и комплекса антиген-антитело соответственно. На практике часто используют равновесную константу диссоциации комплекса ''Kd'' (моль/л), связанную с Ka простым соотношением

: <math>Kd=\frac{1}{Ka}</math>

Очевидно, что чем меньше ''Kd'' (или же, наоборот, больше ''Ka''), тем прочнее образующийся иммунокомплекс.

{{якорь|Константа_комплексообразования}}Константа комплексообразования является термодинамическим параметром, характеризующим изменение свободной энергии взаимодействия антиген-антитело, которое может быть рассчитано по формуле:

: <math>\Delta F=-RT\ln Ka</math>,

где ''R'' — газовая постоянная, ''T'' — абсолютная температура. Общее изменение свободной энергии при комплексообразовании складывается из двух термодинамических величин — изменений [[Энтальпия|энтальпии]] и [[Энтропия|энтропии]]:

: <math>\Delta F=\Delta H-T\Delta S</math>.

Реакция антиген-антитело протекает с выделением теплоты, но, как правило, изменение энтальпии невелико и составляет около 40 кДж/моль. Изменение энтропии в большинстве случаев положительно, так как активные центры антител в свободном виде доступны растворителю и гидратированы, а при взаимодействии с антигеном из них высвобождаются связанные молекулы воды, что приводит к уменьшению общей упорядоченности системы. Таким образом, говоря об иммунологической специфичности антител, всегда проводят сравнительную оценку эффективности антиген-антитело, которое характеризуется константой равновесия или изменением свободной энергии системы при комплексообразовании.

=== Взаимодействие антигена с субпопуляцией антител ===
Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия антиген-антитело за основу была взята простая модель взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела. Но так как молекула антитела имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами одной молекулы антигена, то такая характеристика образования иммунохимического комплекса является весьма упрощённой. Для описания более близкого к реальности процесса взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным антигеном введён термин ''[[авидность]]'', или ''функциональная аффинность'' (''функциональное сродство''). С биологической точки зрения именно функциональная аффинность играет основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусами или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенные детерминанты.

Процесс образования комплекса антиген-антитело состава 1:1, в котором реализуются поливалентные взаимодействия, также является обратимым и может быть охарактеризован ''[[#Константа комплексообразования|константой комплексообразования]]''. С энергетической точки зрения образование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентного. Например, эффективная константа комплексообразования IgG может в 1000 и более раз превышать константу одиночных связей.

=== Каталитические свойства ферментов ===
Весьма важной и часто используемой на практике характеристикой ферментов является их ''каталитическая активность''. За единицу каталитической активности (1 каталь) любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в 1 с в реакционной смеси при определённых условиях. Для практических целей наиболее удобным является нанокаталь (10<sup>−9</sup> кат). Однако до сих пор часто употребляется старое обозначение каталитической активности, известное как ''международная единица'' (''МЕ'', англ. ''U''), определённое как количество фермента, катализирующее превращение 1 ммоль субстрата в 1 мин. Соотношение между этими единицами следующее:

: ''1 нкат = 10<sup>−9</sup> кат = 0,06 U''.

Для сравнительной оценки различных препаратов фермента часто используют ''удельную каталитическую активность'', то есть каталитическую активность, отнесённую к единицу массы белка.

На скорость ферментативной реакции оказывают влияние различные факторы, среди которых основными являются:
# температура,
# природа и ''pH'' буфера,
# субстраты,
# [[Ферменты#Кофакторы ферментов|коферменты]],
# эффекторы,
# количество белка в системе.

Температурные зависимости имеют сложный вид, что обусловлено как термолабильностью белковых молекул, так и влиянием температуры на константы [[Уравнение Михаэлиса — Ментен|Михаэлиса]], константы скоростей распада отдельных фермент-субстратных комплексов и положение ''pH''-оптимума. В области низких температур, когда структура активного центра достаточно стабильна, константа скорости распада фермент-субстратного комплекса описывается уравнением типа [[Уравнение Аррениуса|Аррениуса]].

Диапазон ''pH''-оптимума активности может быть весьма узким. Он зависит от ионной силы и вида используемого буфера, меняется с температурой. Например, для щелочной фосфатазы ''pH''-оптимум при температурах 37, 30 и 25 °C составляет 9,9; 10,1 и 10,3 соответственно.

Определяемая каталитическая активность сильно зависит от используемого субстрата, которые могут быть как природными, так и синтетическими, при этом скорости их превращения также значительно варьируют. Например, фермент β-''D''-галактозидаза гидролизует синтетические субстраты 2-нитрофенил-β-''D''-галактозид и 4-нитрофенил-β-''D''-галактозид соответственно в 7 и 17 раз быстрее, чем естественный субстрат лактозу.

К эффекторам относят как ингибиторы, так и активаторы ферментативных реакций, то есть вещества, оказывающие замедляющее или ускоряющее действие на превращение субстрата. В некоторых случаях для ферментативных реакций наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата или одним из продуктов реакции. Наличие в реакционной среде эффекторов может приводить к нежелательному отклонению скорости ферментативной реакции от линейной зависимости с количеством фермента в системе.

=== Экспериментальные методы определения ферментативной активности ===

===== Фотометрический метод =====
В ИФА наибольшее распространение получил ''фотометрический метод'' регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают видимый свет, то есть электромагнитное излучение с длинами волн 400—700 нм. Поглощение света подчиняется [[Закон Бугера — Ламберта — Бера|закону Бугера-Ламберта-Бера]], в соответствии с которым оптическая плотность раствора в определённом диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества. Для измерения оптической плотности используется спектрофотометр.

===== Флуориметрический метод =====
В последнее время в ИФА получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые ''флуориметрическим методом''. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбуждённое. Возбуждённая молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдёт в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбуждённого состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Долю молекул, перешедших из возбуждённого состояния в основное с испусканием света, определяет квантовый выход φ. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству света, адсорбированного образцом. Таким образом, она прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества и абсолютному значению начальной интенсивности света, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности, адсорбированные образцом. Этот факт позволяет на 1-2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрическим методом по сравнению с фотометрическим.

===== Биолюминесценция и хемилюминесценция =====
В качестве детектирующих систем в ИФА нашли применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения — ''реакции био- и хемилюминесценции''. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода (реакция хемолюминесценции) катализируется пероксидазой хрена.

===== Электрохимический метод =====
Известны также ''электрохимические способы'' определения активности ферментов, используемых в качестве меток в иммуноанализе. Такие датчики позволяют определить скорость ферментативных реакций в мутных средах и удобны для создания проточных иммуноферментных ячеек.

В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. Если меткой служит молекула фермента, то выбранный способ детекции должен обеспечивать регистрацию сигнала, пропорционально зависимого от концентрации фермента, а в случае применения в качестве метки субстрата — от концентрации субстрата. В первом случае фермент выполняет роль маркёра (он ковалентно связан с молекулой антигена или антитела), во втором — детектора (свободный фермент). После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, то есть определить каталитическую активность фермента в пробе. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркёра в системе. Следует отметить, что ИФА всегда строится на сравнительном определении в идентичных условиях стандартного и измеряемого образца, в связи с чем требование пропорциональности скорости и концентрации является скорее желательным, чем обязательным. Достаточным является существование взаимно однозначного соответствия между количеством образовавшегося продукта ферментативной реакции и количеством фермента в системе. Однако же, выполнение условия пропорциональности в определённом диапазоне концентраций обеспечивает бо́льшую точность эксперимента и позволяет построить теоретическую модель с описанием метода для его оптимизации.

=== Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток ===
Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Если обычными спектрофотометрическими или флуориметрическими методами можно зарегистрировать образование продукта в концентрации 10<sup>−7</sup> моль/л, то концентрация фермента составит при этом 10<sup>−13</sup> моль/л. Причём принципиально возможным является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счёт увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образовавшегося продукта. В этой связи перспективными являются люминесцентные методы детекции ферментативных реакций, а также методы, основанные на ферментативном усилении детекции продуктов первичной ферментативной реакции («каскады»).

К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:

# высокая специфичность и удельная каталитическая активность, позволяющая обнаружить метку в низких концентрациях;
# доступность фермента, возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую активность после химической модификации при получении конъюгата с антигенами или антителами;
# стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
# простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.

Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА (где используются реагенты, иммобилизированные на поверхности твёрдых носителей) получили [[пероксидаза хрена]], [[щелочная фосфатаза]] и [https://en.wikipedia.org/wiki/Beta-galactosidase β-''D''-галактозидаза]. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций.

Наиболее доступной является пероксидаза хрена. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислению перекисью окрашенные соединения.

Каталитическую активность глюкозооксидазы регистрируют с теми же хромогенами, что и активность пероксидазы, однако чувствительность её определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента служит полное отсутствие его в плазме крови, что даёт возможность использования этого фермента в гомогенных методах ИФА (реагенты для всех стадий ИФА находятся в водном растворе).

Щелочная фосфатаза и её конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако имеет относительно высокую стоимость. Разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы [[Никотинамидадениндинуклеотидфосфат|НАДФ]]. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт [[Никотинамидадениндинуклеотид|НАД]] определяется в ферментативной системе регенерации кофактора.

β-''D''-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА. Она катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Если вместо природного субстрата взять 4-метилумбеллиферил-β
-''D''-галактозид, при гидролизе образуются галактоза и 4-метилумбеллиферон, регистрируемый флуориметрически.

Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется её высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ) с перекисью водорода, продукт окисления которых регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту. Учёт результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450—490 нм.

== Классификация методов ИФА ==
К настоящему времени разработано большое число различных вариантов проведения ИФА, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Единая чёткая классификация всего многообразия методов ИФА в литературе отсутствует, что затрудняет выявление общих закономерностей и проведение сравнительной оценки возможностей различных методов. Обычно рассмотрение методов ИФА осуществляется с позиций разделения на гетерогенные и гомогенные, то есть по принципу проведения всех стадий анализа с участием твёрдой фазы или же только в растворе.

Первичным процессом в ИФА является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. В случае анализа антигенов для проведения такой оценки существует два подхода:
# прямое измерение концентрации образовавшихся комплексов;
# определение концентрации оставшихся свободными (не вступивших в реакцию) антител.
Очевидно, что в последнем случае число образовавшихся иммунных комплексов определяется по разности общего числа добавленных антител и числа антител, оставшихся свободными.

Классические методы ИФА основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. К тому же, результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов ([[Гаптены|гаптенов]]), например, гормонов и лекарственных соединений, эти методы непригодны. Индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов. Так как процесс комплексообразования происходит в строго количественном отношении, то концентрация метки, входящей в состав комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена.

=== Гетерогенный ИФА в микропланшетном формате ===
Для осуществления анализа эффективности комплексообразования необходимо провести полную очистку комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген-антитело прочно связать (''иммобилизировать'') на твёрдом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся комплексов от свободных компонентов. Использование иммобилизации антител на твёрдом носителе положило начало методам ''твердофазного (гетерогенного) ИФА''.

Особую значимость для широкого внедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полистирольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах [[Радиоиммунный анализ|радиоиммунологического анализа (РИА)]]. Введение полистирольных плат в практику ИФА позволило значительно увеличить число проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок планшеты.<ref name="Egorov" />

Гетерогенный (твердофазный) ИФА в микропланшетном варианте получил наибольшее распространение в тест-системах для клинических лабораторных исследований. В качестве твёрдой фазы используется поверхность лунок полистиролового микропланшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антигены или антитела (называемые в этом случае ''иммуносорбентом''). В ходе специфической реакции иммуносорбента с определяемыми в исследуемом образце антителами или антигенами образуются иммунные комплексы, которые оказываются фиксированными на твёрдой фазе. Субстанции, не участвовавшие в реакции, а также избытки реагентов, удаляются при многократной промывке. Такая схема позволяет упростить процесс эффективного разделения компонентов реакции.<ref name="Dolgov">{{книга
| ответственный = В. В. Долгов
| заглавие = Иммунохимический анализ в лабораторной медицине
| место = М.-Тверь
| издательство = ООО "Издательство "Триада""
| год = 2015
| isbn = 978-5-94789-695-4
| страницы = 34—38
}}</ref>

==== Прямой ИФА ====
В прямом иммуноферментном анализе вносимый материал (антиген) закрепляется во время инкубации на поверхности чистых лунок. Количество исследуемого материала детектируется с помощью антител к выявляемому антигену, соединенных со специфической меткой, обеспечивающий ферментативную реакцию.

[[Файл:Direct ELISA.png|thumb|'''Принцип прямого ИФА'''<br><small>''разноцветные круги — различные антигены из внесённой в лунку сыворотки;<br><span style="color:rgb(91,155,213)">'''Y'''</span> с лиловой точкой — антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат).''</small>]]

{{начало цитаты}}
'''''Структура анализа.'''''

Биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) помещается в чистые лунки на некоторое время (обычно 15—30 минут), достаточное, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок.

Далее в лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4—5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном. Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними. Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок выливают (или вымывают методом [[Декантация|декантации]]). В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок.

Следующий этап — ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30—60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт).

Краткая схема: '''(Антиген) → Антитело'''
{{конец цитаты}}

Поскольку добавленная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов.<ref name="polismed">[http://www.polismed.com/articles-immunofermentnyjj-analiz-ifa-elisa-sut-princip-metoda-i-ehtapy-issledovanija.html www.polismed.com]</ref>

==== Непрямой ИФА ====
В непрямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.<ref name="polismed" />

По типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества) среди гетерогенных методов различают неконкурентный и конкурентный. Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические [[антитело|антитела]]), то метод является ''неконкурентным''. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является ''конкурентным''.

===== Непрямой неконкурентный ИФА =====
В лунки, на твёрдой поверхности которых предварительно сорбирован антиген, вносится исследуемый биологический материал (чаще всего сыворотка или плазма крови человека), содержащий антитела к антигену. Образец исследуется на содержание антител.

[[Файл:Indirect incompetitive ELISA.png|thumb|'''Принцип непрямого неконкурентного ИФА'''<br><small>''синие круги — антиген, иммобилизированный на поверхности лунки;<br><span style="color:rgb(255,0,0)">'''Y'''</span>, <span style="color:rgb(255,255,0)">'''Y'''</span>, <span style="color:rgb(112,173,71)">'''Y'''</span>, <span style="color:rgb(47,85,151)">'''Y'''</span> — антитела из внесённой в лунку сыворотки;<br><span style="color:rgb(91,155,213)">'''Y'''</span> с лиловой точкой — антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат).''</small>]]

{{начало цитаты}}
'''''Структура анализа.'''''

Исследуемые антитела из внесённого образца биологического материала во время инкубации связываются с антигеном и таким образом иммобилизируются на поверхности лунки. Несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием.

В лунку вносят конъюгат, то есть антитело с заранее прикреплённым к нему ферментом (например, [[Пероксидаза хрена|пероксидазой хрена]], способное связаться с антителом, иммобилизированном на первой стадии. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с ними во время второй инкубации, а несвязавшийся конъюгат удаляется последующим отмыванием.

Далее в лунку добавляется субстратно-хромогенный реагент, который превращается в окрашенный продукт под влиянием ферментного компонента конъюгата.<ref name="Dolgov" />

Краткая схема: '''Антиген → (Антитело) → Антитело-К'''
{{конец цитаты}}

Таким образом, отличие от прямого метода состоит в том, что исследуемые антитела не приклеиваются к поверхности чистой лунки, а связываются с иммобилизированным на планшете антигеном.

===== «Сэндвич» =====
«Сэндвич» является вариантом непрямого неконкурентного гетерогенного ИФА, в котором в качестве иммуносорбента выступает антитело.<ref name="Dolgov" />

[[Файл:Indirect incompetitive ELISA sandwich.png|thumb|'''Принцип непрямого неконкурентного ИФА «сэндвич»'''<br><small>''разноцветные круги — различные антигены из внесённой в лунку сыворотки;<br><span style="color:rgb(47,85,151)">'''Y'''</span> — антитела, иммобилизированные на поверхности лунки;<br><span style="color:rgb(91,155,213)">'''Y'''</span> с лиловой точкой — антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат)''</small>]]

{{начало цитаты}}
'''''Структура анализа.'''''

К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело.

Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела.

После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител.

Результат оценивается [[Спектрофотометрия|спектрофотометрически]] или визуально.

Краткая схема: '''Антитело → (Антиген) → Антитело-К'''
{{конец цитаты}}

На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия ''«сэндвич»-метод''. По аналогичной схеме работают тест-системы для определения антител, но в качестве иммуносорбента в них используется антиген, а конъюгат содержит раствор антигена, меченного ферментом.

«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две пространственно удалённые антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: [[Вирус иммунодефицита человека|ВИЧ-инфекция]], вирусные [[гепатит]]ы, [[цитомегаловирус]]ная, [[герпес]]ная, токсоплазменная и другие инфекции.

В настоящее время получили распространение тест-системы с использованием [http://humbio.ru/humbio/tarantul_sl/000014b1.htm стрептавидина] и биотинилированных моноклональных антител (которые представляют собой смесь высокоочищенных специфичных моноклональных антител к различным эпитопам). Стандарты, контроли и пробы пациентов добавляются в микроячейки, покрытые стрептавидином, затем добавляют биотинилированные антитела, и антитела, меченные ферментом (конъюгат). После перемешивания результатом реакции становится образование «сэндвич»-комплекса, который связывается со стрептавидином в ячейках. Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. После инкубации с субстратным раствором фотометрически определяется относительная плотность растворов в лунках. Особенностью таких систем является отдаление ферментной реакции от стенки планшета, поэтому окраска развивается в объёме и тест-система аналитически становится более чувствительной.<ref name="Dolgov" />

===== Конкурентные =====
В случае ''конкурентного'' ИФА определяемые антигены или антитела конкурируют с аналогичными меченными антигенами или антителами конъюгата за места связывания с иммуносорбентом. Анализ этого типа часто используют для определения антигенов, присутствующих в высоких концентрациях или гормонов, имеющих только один антиген-связывающий центр.

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата: прямой и непрямой.

====== Прямой конкурентный ИФА ======
Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антигены, а меченые ферментом и немеченые [[антиген|антитела]] конкурируют за связь с иммобилизованным [[антитело|антигеном]].

[[Файл:Direct competitive ELISA.png|thumb|'''Принцип прямого конкурентного ИФА'''<br><small>''синие круги — антиген, иммобилизированный на поверхности лунки;<br><span style="color:rgb(255,0,0)">'''Y'''</span>, <span style="color:rgb(255,255,0)">'''Y'''</span>, <span style="color:rgb(112,173,71)">'''Y'''</span>, <span style="color:rgb(91,155,213)">'''Y'''</span> — антитела из внесённой в лунку сыворотки;<br><span style="color:rgb(91,155,213)">'''Y'''</span> с лиловой точкой — антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат).''</small>]]

{{начало цитаты}}
'''''Структура анализа.'''''

В лунку планшета, на поверхности которой сорбированы антигены, вносят исследуемый образец (сыворотку или плазму крови человека) и конъюгат, который представляет собой антитела, меченные ферментом. После инкубирования образуются иммунные комплексы двух видов: содержащие ферментную метку (меченные) и без неё (немеченные). Чем больше определяемых (немеченных) антител содержит исследуемый образец, тем больше конкуренция с меченными антителами и, следовательно, образуется меньше меченных иммунокомплексов.

Далее, после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов, добавляют субстрато-хромагенный реагент и регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов.<ref name="Dolgov" />

Краткая схема: '''Антиген → (Антитело) + Антитело-К'''
{{конец цитаты}}

Таким образом, величина детектируемого сигнала, получаемого прямым конкурентным ИФА, находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

====== Непрямой конкурентный ИФА ======
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антивидовые [[антитело|антитела]] (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат [[антиген]]-белок-носитель. Одна из наиболее распространенных схем ИФА. Конкуренция происходит на этапе связывания антител либо с антигеном из сыворотки крови испытуемого (свободные, удаляются при отмывке), либо с антигеном, иммобилизированном на твёрдой фазе (при отмывке не удаляются). Далее к антителам присоединяется конъюгат меченых антител и определяется оптическая плотность. То есть если во внесённом образце вообще нет измеряемого вещества, все антитела свяжутся с антигеном, иммобилизированном через белок-носитель на поверхности лунки, при отмывке они останутся в лунке, и детектируемый сигнал будет высоким. В случае, если в сыворотке испытуемого окажется много измеряемого вещества (то есть оно будет находиться в растворе в свободном состоянии), часть антител свяжутся с этим веществом, а часть — с иммобилизированным; антитела, находящиеся в свободном состоянии (связанные с антигеном из сыворотки), будут удалены при отмывке, и детектируемый сигнал дадут антитела, связанные с иммобилизированным в лунке антигеном — он окажется низким, поскольку часть антител удалена при отмывке.

[[Файл:Indirect competitive ELISA.png|thumb|'''Принцип непрямого конкурентного ИФА'''<br><small>''большие жёлтые круги — конъюгат антиген-белок, иммобилизированный на поверхности лунки;<br>малые красный, зелёный и синие круги — различные антигены из внесённой в лунку сыворотки (например, наркотические вещества);<br><span style="color:rgb(47,85,151)">'''Y'''</span> — немеченые антитела, специфические к конкретному антигену;<br><span style="color:rgb(91,155,213)">'''Y'''</span> с лиловой точкой — вторичные антивидовые антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат).''</small>]]

{{начало цитаты}}
'''''Структура анализа.'''''

На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат [[антиген]]-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый [[антиген]] и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют.

После удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых вторичных антивидовых антител.

После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов.

Краткая схема: '''Антиген-К → (Антитело) + Антиген → Антитело-К'''
{{конец цитаты}}

Величина детектируемого сигнала также, как и при использовании прямого конкурентного метода, находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого [[антиген]]а.

Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий. Данный метод применяется для качественного и количественного выявления, например, опиатов (морфин, героин), каннабиноидов (марихуана, гашиш), амфетаминов и метамфетаминов, барбитуратов.<ref>[https://www.monographies.ru/en/book/section?id=9935 www.monographies.ru]</ref>

=== Гомогенный ИФА ===
В 1972 г Рубеншетейн с сотрудниками разработали новый подход с проведением всего анализа без твёрдой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА (англ. «EMIT» — enzyme multiplied immunoassay technique) и был основан на учёте различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. Суть его состоит в связывании низкомолекулярного антигена с ферментом [[лизоцим]]ом вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток. При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга токсических, наркотических и лекарственных средств. Существенным достоинством EMIT-анализа являются возможность использования малых объёмов анализируемого образца (5-50 мкл) и высокая скорость определения (2—5 мин), обусловленная отсутствием стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения. К недостаткам метода следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл), и возможность определения только низкомолекулярных антигенов.<ref name="Egorov" />

=== Особенности и проблемы ИФА ===
Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт [[Ревматоидный фактор|ревматоидного фактора]], представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям.<ref>[http://xn--80agfxainapd7aj.xn--p1ai/%D0%B8%D0%BC%D0%BC%D1%83%D0%BD%D0%B8%D1%82%D0%B5%D1%82/%D1%81%D0%B8%D0%BD%D0%B4%D1%80%D0%BE%D0%BC_%D0%BF%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%BA%D0%BB%D0%BE%D0%BD%D0%B0%D0%BB%D1%8C%D0%BD%D0%BE%D0%B9_%D0%B0%D0%BA%D1%82%D0%B8%D0%B2%D0%B0%D1%86%D0%B8%D0%B8/ Синдром поликлональной активации как причина ложноположительных результатов ИФА]{{Недоступная ссылка|date=Июнь 2018 |bot=InternetArchiveBot }}</ref>
Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.

Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

== Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов ==
В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:
# Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
# Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;
# Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.
Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена.

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам).

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков.
В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100 % специфичностью при высокой чувствительности.

На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.
На данное время, на основании пептидного имунноферментного анализа, можно сказать, успешно реализован [[Квантеферон|квантифероновый тест]] для быстрой и высокоточной диагностики туберкулеза.

== Перспективы и развитие метода ==
Одна из важных задач — поиск подходов, позволяющих значительно сократить время проведения анализа при сохранении высокой чувствительности. Один из таких подходов — перевод анализа в кинетический режим, что реализуется созданием автоматических устройств, основанных на проведении реакции в проточных системах.

Широкие возможности открывает использование [[Моноклональные антитела|моноклональных антител]], специфичных строго к определённому антигенному участку анализируемого соединения. Путём подбора соответствующих антител можно создавать довольно сложные иммунохимические системы, позволяющие идентифицировать соединения самого разнообразного круга.

Метода ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идёт постоянный поиск всё новых и новых ферментов, используемых в качестве маркеров. Всё возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.<ref name="Egorov"/> Так, если до внедрения генно-инженерных методов приходилось выделять антитела из биологических сред (а хорошая очистка требует существенных затрат и времени, и реагентов и ресурса оборудования), то в настоящее время есть возможность использовать клетки насекомого (сверчка, цикады, таракана) или ''[[Кишечная палочка|E. coli]]'' для производства требуемого рекомбинантного белка, который при сохранении требуемых биологических свойств вдобавок получается сравнительно чистым, так что его значительно проще выделить из смеси и сохранить в стабилизирующем растворе.

== Примечания ==
{{примечания}}

{{Персонализированная медицина}}
{{rq|sources|wikify|style}}

[[Категория:Серологические методы]]
[[Категория:Методы биологических исследований]]