Эта статья является кандидатом в хорошие статьи

Альтернативный сплайсинг

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Благодаря альтернативному сплайсингу образуются три разные изоформы одного и того же белка

Альтернати́вный спла́йсинг — процесс в экспрессии генов, приводящий к образованию нескольких белков с одного гена. В ходе этого процесса отдельные экзоны могут быть включены в зрелую мРНК или же отброшены[1]. В результате белки, считанные с мРНК одного гена, подвергшихся альтернативному сплайсингу, будут иметь разные аминокислотные последовательности и нередко и разные функции. Благодаря альтернативному сплайсингу в человеческом геноме закодировано гораздо больше белков, чем можно было бы ожидать с его 20 тысяч белоккодирующих генов.

Альтернативный сплайсинг широко распространен у эукариот, значительно увеличивая разнообразие белков, закодированных в их геномах. У человека около 95 % многоэкзонных генов подвергаются альтернативному сплайсингу[2]. Существует много разновидностей альтернативного сплайсинга, из которых наиболее часто встречается пропуск экзонов. При пропуске экзонов отдельные экзоны в некоторых тканях или при определённых условиях могут быть включены в зрелую мРНК или пропущены[1].

Образование альтернативно сплайсированных мРНК находится под контролем системы транс-действующих белков, которые связываются с цис-сайтами самого первичного транскрипта. К этим белкам относятся активаторы сплайсинга, которые способствуют использованию отдельных сайтов сплайсинга, а также репрессоры сплайсинга, которые выключают использование некоторых сайтов сплайсинга. Механизмы альтернативного сплайсинга очень разнообразны, и постоянно открываются новые примеры, в частности, с помощью высокопроизводительных методов. Учёные работают над тем, чтобы полностью изучить все механизмы сплайсинга, чтобы с помощью «кода сплайсинга» можно было предсказывать продукты альтернативного сплайсинга для данного гена в определённых условиях[3][4].

Ненормальные случаи альтернативного сплайсинга нередко приводят к болезням; значительное количество генетических заболеваний человека возникает из-за альтернативного сплайсинга[3]. Нарушенный сплайсинг может приводить к развитию рака, и в различных видах рака гены факторов сплайсинга нередко мутируют[5][6][7][8][8].

История изучения[править | править вики-текст]

Впервые альтернативный сплайсинг был описан в 1977 году[9][10]. Аденовирус образует пять различных транскриптов в ранней стадии инфекционного цикла, до репликации вирусной ДНК, и ещё один после начала репликации ДНК. После начала репликации ДНК продолжают образовываться ранние первичные транскрипты. Дополнительный одиночный транскрипт, образуемый на поздних стадиях инфекционного цикла, очень крупный и считывается с 5/6 аденовирусного генома размером 32 килобазы. Он гораздо крупнее каждого из вирусных транскриптов, образованных в заражённой клетке на ранних стадиях инфекционного цикла. Учёные показали, что первичный транскрипт, образуемый аденовирусом типа 2 на поздних стадиях инфекции, подвергается сплайсингу разными способами, в результате чего образуются различные мРНК, кодирующие разные вирусные белки. Кроме того, первичный транскрипт содержит множество сайтов полиаденилирования, в результате чего у разных мРНК могут получаться разные 3'-концы[11][12][13].

В 1981 году альтернативный сплайсинг был описан у обычного клеточного гена. Было показано, что в клетках млекопитающих гормон кальцитонин образуется в результате альтернативного сплайсинга. Первичный транскрипт гена кальцитонина содержит 6 экзонов; в зрелую мРНК, кодирующую кальцитонин, входят экзоны 1—4, и сигнал полиаденилирования находится в экзоне 4. У другой мРНК, образуемой из того же первичного транскрипта, при сплайсинге экзон 4 пропускается, и зрелая мРНК содержит экзоны 1—3, 5 и 6. Она кодирует белок, известный как CGRP[en] (англ. calcitonin gene related peptide)[14][15]. В начале 1980-х также был открыт альтернативный сплайсинг в генах иммуноглобулинов млекопитающих[11][16].

С тех пор было показано, что альтернативный сплайсинг распространён среди всех эукариот[1]. Рекорд по количеству белков, образуемых с одного и того же гена, принадлежит гену плодовой мушки Drosophila melanogaster, известному как Dscam[en]. Он имеет 38016 разных вариантов сплайсинга[17].

Модели[править | править вики-текст]

Традиционная классификация базовых типов альтернативного сплайсинга
Относительная частота моделей альтернативного сплайсинга различается у человека и плодовой мушки[18]

Существует пять моделей протекания альтернативного сплайсинга[1][2][3][18]:

  • Пропуск экзона или кассетный экзон. В этом случае экзон может быть включен в состав зрелой мРНК или вырезан. Это наиболее распространённая модель протекания альтернативного сплайсинга у пре-мРНК млекопитающих[18].
  • Взаимоисключающие экзоны. Из двух экзонов в зрелой мРНК находится только один, но не оба.
  • Альтернативный донорный сайт. Используется альтернативный 5'-конец интрона (донорный сайт), так что меняется 3'-конец вышестоящего экзона.
  • Альтернативный акцепторный сайт. Используется альтернативный 3'-конец интрона (акцепторный сайт), так что меняется 5'-конец нижестоящего экзона.
  • Сохранение интрона. Последовательность может быть вырезана как интрон или оставлена в зрелой мРНК. Этот способ отличается от пропуска экзона, поскольку сохраняемая последовательность не фланкирована интронами. Если оставленный интрон попадает в кодирующую область[en], то он должен кодировать аминокислотную последовательность с такой же рамкой считывания, как и соседние экзоны. Если он будет содержать стоп-кодон или будет иметь другую рамку считывания, нежели окружающие экзоны, то произойдёт сдвиг рамки считывания и белок будет нефункциональным. Это самый редкий путь альтернативного сплайсинга у млекопитающих[18].

Кроме этих пяти основных моделей протекания альтернативного сплайсинга, существуют два способа получения нескольких белков с одного гена: использования множественных промоторов и множественных сайтов полиаденилирования. Использование множественных промоторов относится скорее к регуляции транскрипции, чем к альтернативному сплайсингу. Начиная транскрипцию с разных точек, можно получить транскрипты с различающимися 5'-концевыми экзонами. С другой стороны, использование множественных сайтов полиаденилирования приведёт к образованию разных 3'-концов у созревающих транскриптов. Оба этих механизма в сочетании с пятью моделями сплайсинга обеспечивают разнообразие мРНК, считываемых с одного и того же гена[1][3].

Схематическое представление мРНК гена мышиной гуалуронидазы. Экзоны и интроны изображены не в масштабе

Эти модели хорошо описывают базовые механизмы сплайсинга, однако они могут не подходить для сложных случаев. Например, на рисунке справа представлены три формы мышиного гена гиалуронидазы 3, полученные в ходе аналогичного сплайсинга. Сравнение экзонов первой формы (зелёная) и второй (жёлтая) указывает на то, что имело место сохранение интрона, а сравнение второй формы с третьей (синяя) показывает, что произошёл пропуск экзона[18].

Механизм[править | править вики-текст]

Общая схема сплайсинга[править | править вики-текст]

Сплайсосомный комплекс А определяет 5'- и 3'-концы интронов[3]

Когда пре-мРНК транскрибируется с ДНК, она содержит несколько интронов и экзонов. Так, у нематод обычно имеется 4—5 интронов и экзонов, а у дрозофилы может быть более 100 интронов и экзонов в одной пре-мРНК. В ходе сплайсинга экзоны должны быть оставлены в транскрипте, а интроны удалены. Регуляция и выбор сайтов сплайсинга осуществляется транс-действующими белками-активаторами и репрессорами сплайсинга, а также цис-действующими элементами в самой пре-мРНК, такими как энхансеры и сайленсеры сплайсинга. Типичные эукариотические интроны имеют консенсусные последовательности[en] в определённых местах; так, на 5'-конце каждого интрона располагается динуклеотид GU. Рядом с 3'-концом находится точка ветвления, и в точке ветвления всегда находится нуклеотид А, а вокруг него последовательности несколько варьируют. У человека консенсусная последовательность вокруг точки ветвления выглядит как yUnAy[19]. После точки ветвления располагается ряд пиримидинов (полипиримидиновый тракт[en]), 3'-конец которого выглядит как AG[3].

Сплайсинг пре-мРНК осуществляет РНК-белковый комплекс, известный как сплайсосома. В состав сплайсосомы входят малые ядерные рибонуклеопротеиды[en] (snRNP), обозначаемые U1[en], U2[en], U4[en], U5[en] и U6[en] (U3 не участвует в сплайсинге мРНК)[20]. U1 связывается с 5'-концевым динуклеотидом GU, а U2, при участии белковых факторов U2AF, связывается с точкой ветвления. На этой стадии комплекс известен как сплайсосомный А-комплекс. Во время формирования А-комплекса определяются 5'- и 3'-границы удаляемого интрона, а также концы экзонов, которые должны быть оставлены[3] .

Далее с А-комплексом связывается комплекс U4, U5, U6. После этого U6 замещает U1, а U1 и U4 покидает комплекс. Оставшийся комплекс осуществляет две реакции пересэтерификации. В ходе первой реакции 5'-конец интрона отрезается от вышележащего экзона и присоединяется к нуклеотиду А в точке ветвления с помощью 2',5'-фосфодиэфирной связи. В ходе второй реакции отрезается 3'-конец интрона, и два экзона соединяются фосфодиэфирной связью. Интрон, принимающий форму лассо, высвобождается и далее деградирует[1].

Регуляторные элементы и белки[править | править вики-текст]

Репрессия сплайсинга

Сплайсинг регулируется транс-действующими белками (активаторами и репрессорами) и соответствующими цис-регуляторными элементами (сайленсерами и энхансерами) на пре-мРНК. Впрочем, имеются данные, что во многих случаях действие фактора сплайсинга зависит от положения. Когда фактор сплайсинга связан с интронным энхансерным элементом, он действует как активатор сплайсинга, а когда связывается с регуляторным сайтом в экзоне, действует как репрессор, и наоборот[21]. В регуляции сплайсинга также принимает участие вторичная структура пре-мРНК, сближающая друг с другом два регуляторных элемента или маскируя последовательности, которые могли бы служить местами связывания факторов сплайсинга[22][23]. Вместе все эти элементы образуют «код сплайсинга», который определяет, как будет проходить сплайсинг в данных клеточных условиях[24][25].

Имеется два типа цис-активирующих элементов в пре-мРНК, и им соответствуют транс-активирующие РНК-связывающие белки. Сайленсеры сплайсинга — это элементы, с которыми связываются белки-репрессоры сайленсинга, при этом снижая вероятность того, что по соседству будет находиться сайт сплайсинга. Сайленсеры сплайсинга могут находиться в интронах (интронные сайленсеры сплайсинга, ISS) или в экзонах (экзонные сайленсеры сплайсинга, ESS). Их последовательности, как и связывающиеся белки, сильно разнятся. Большинство репрессоров сплайсинга являются гетерогенными ядерными рибонуклеопротеидами[en] (hnRNP), такие как hnRNPA1[en] и белок, связывающий полипиримидиновый тракт (PTB). С энхансерами сплайсинга связываются белки-активаторы сплайсинга, увеличивая вероятность того, что рядом будет находиться сайт сплайсинга. Они тоже могут находиться в интронах (интронные энхансеры сплайсинга, ISE) или в экзонах (экзонные энхансеры сплайсинга, ESE). Большая часть белков, связывающихся с ISE и ESE, относится к семейству белков SR. Эти белки содержат мотивы, распознающие РНК, а также домены, обогащённые аргинином и серином[3][25]. Наличие определённых цис-регуляторных последовательностей РНК увеличивают вероятность того, что рядом будет находиться сайт сплайсинга, а в других уменьшают эту вероятность в зависимости от контекста. Например, некоторые такие элементы влияют на сплайсинг только тогда, когда рядом располагается ряд определённых элементов. Кроме того, цис-регуляторные элементы могут давать разный эффект при экспрессии в клетке определённых белков. Адаптивное значение энхансеров и сайленсеров сплайсинга подтверждается работами, показывающими, что в человеческих генах на мутации, приводящие к образованию новых сайленсеров или разрушению старых энхансеров, действует строгий отбор[26][27].

Примеры[править | править вики-текст]

Пропуск экзона: ген dsx дрозофилы[править | править вики-текст]

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК dsx

Пре-мРНК гена dsx[en] D. melanogaster содержит 6 экзонов. У самцов в зрелую мРНК входят экзоны 1, 2, 3, 5, 6, и они кодируют белок, который функционирует как регулятор транскрипции в развитии по мужскому типу. У самок в зрелую мРНК входят экзоны 1, 2, 3 и 4, и экзон 4 содержит сигнал полиаденилирования, по которому мРНК разрезается. Получившийся белок функционирует как регулятор транскрипции в развитии по женскому типу[28].

В описанном примере имеет место альтернативный сплайсинг по типу пропуска экзона. Интрон, лежащий выше экзона 4, содержит полипиримидиновый тракт, который не вполне удовлетворяет консенсусной последовательности сплайсинга, поэтому белки U2AF связываются с ним плохо в отсутствие активаторов сплайсинга. По этой причине у самцов этот 3'-акцепторный сайт сплайсинга не используется. У самок, однако, имеется активатор сплайсинга Transformer (Tra). SR-белок Tra2 образуется у обоих полов и связывается с ESE в экзоне 4; если имеется Tra, то он связывается с Tra2 и вместе с ещё одним SR-белком формирует комплекс, который содействует связыванию белков U2AF со слабым пиримидиновым трактом. U2 рекрутируется к соответствующей точке ветвления, и в результате экзон 4 включается в состав зрелой мРНК[28][29].

Альтернативные акцепторные сайты: Transformer дрозофилы[править | править вики-текст]

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК гена Transformer дрозофилы

Пре-мРНК гена Transformer (Tra) D. melanogaster подвергаются альтернативному сплайсингу по модели альтенативных акцепторных сайтов. Ген Tra кодирует белок, экспрессирующийся только у самок. Первичный транскрипт этого гена содержит интрон с двумя возможными акцепторными сайтами. У самцов используется вышележащий акцепторный сайт. В итоге в мРНК включается удлинённый вариант экзона 2, содержащий преждевременный стоп-кодон. Поэтому у самцов образуется укороченный неактивный белок. У самок образуется белок, играющий ключевую роль в определении пола и известный как Sex lethal (Sxl). Белок Sxl является репрессором сплайсинга, который связывается с ISS в РНК-транскрипте Tra рядом с вышележащим акцепторным сайтом, предотвращая связывание белка U2AF с полипиримидиновым трактом. В результате сплайсосома связывается с нижележащим акцепторным сайтом. При использовании этого сайта преждевременный стоп-кодон удаляется в составе интрона. Получившаяся мРНК кодирует белок Tra, который сам выступает регулятором альтернативного сплайсинга других связанных с полом генов (см. выше пример гена dsx)[1].

Альтернативный сплайсинг рецептора Fas[править | править вики-текст]

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК рецептора Fas

Множество изоформ рецептора Fas[en] образуются в результате альтернативного сплайсинга. Две нормальные изоформы у человека образуются по механизму пропуска экзона. мРНК, содержащая 6 экзонов, кодирует мембраносвязанную форму рецептора Fas, которая стимулирует апоптоз. Повышенное образование рецептора Fas в клетках, постоянно подвергающихся воздействию солнечного света, и отсутствие этого рецептора в клетках рака кожи свидетельствует о том, что этот механизм играет важную роль в элиминации клеток, которые встали на путь превращения в раковые[30]. Если экзон 6 пропускается, то образуется водорастворимая изоформа белка Fas, которая неспособна стимулировать апоптоз. Вставка или пропуск экзона зависят от действия двух белков-антагонистов TIA-1[en] и PTB.

Донорный сайт, расположенный на 5'-конце интрона, следующим после экзона 6 в пре-мРНК, плохо согласуется с консенсусной последовательностью сплайсинга, и не всегда связывается с snRNP U1[3]. Если U1 не связывается, экзон пропускается (картинка а на рисунке справа). Связывание белка TIA-1 с интронным энхансером сплайсинга стабилизирует связывание U1. Образующийся на 5'-конце интрона донорный сайт помогает связываться фактору сплайсинга U2AF с 3'-сайтом сплайсинга, расположенным выше экзона, хотя механизм этого ещё не понятен (картинка b на рисунке справа)[31]. Экзон 6 содержит обогащённый пиримидинами сайленсер сплайсинга (ure6), с которым может связываться PTB. Если связывание PTB происходит, то донорный сайт на 5'-конце интрона не способствует связыванию фактора U2AF, и экзон пропускается (картинка с на рисунке справа).

Описанный выше механизм является примером определения экзона при сплайсинге. Сплайсосома собирается в области интрона, и snRNP так укладывают РНК, что 5'- и 3'-концы интрона соединяются. Однако в описанном выше случае происходит также взаимодействие концов экзона. В этом случае взаимодействия, определяющие границы экзона, необходимы для связывания коровых факторов сплайсинга до сборки сплайсосомы на границах фланкирующих интронов[31].

Конкуренция репрессора и активатора: экзон 2 гена tat ВИЧ-1[править | править вики-текст]

Альтернативный сплайсинг экзона 2 tat ВИЧ-1

ВИЧретровирус, являющийся причиной развития СПИДа — образует единственную пре-мРНК, из которой далее посредством альтернативного сплайсинга образуется более 40 различных мРНК[32]. Равновесие между по-разному сплайсированными транскриптами обеспечивает образование мРНК, кодирующих все белки, необходимые для репликации вируса[33]. Один из по-разному сплайсированных транскриптов содержит транскрипт гена tat[en], у которого экзон 2 является кассетным, то есть может быть включён в итоговый транскрипт или не включён. Включение этого экзона регулируется репрессором сплайсинга hnRNP A1 и SR-белком[en] SC35. В экзоне 2 сайленсерная последовательность (ESS) и энхансерная последовательность (ESE) перекрываются. Если с ESS связывается репрессор А1, то он запускает кооперативное связывание молекул А1, закрывая 5'-концевой донорный сайт выше экзона 2 и препятствуя связыванию U2AF35 с полипиримидиновым трактом. Если SC35 связывается с ESE, то он препятствует связыванию А1, и 5'-донорный сайт остаётся доступным для сплайсосомы. Конкуренция между репрессором и активатором приводит к образованию РНК, содержащей или не содержащей экзон 2[32].

Адаптивное значение[править | править вики-текст]

Альтернативный сплайсинг — это одно из исключений из правила, что одному гену соответствует один белок (гипотеза «один ген — один фермент»)[34]. Корректнее было бы сказать, «один ген — много полипептидов». Внешняя информация нужна для того, чтобы решить, какой именно полипептид образовать с данной мРНК. Поскольку способы регуляции наследуются, то это даёт мутациям новый путь к изменению экспрессии генов[7].

Предполагается, что для эукариот альтернативный сплайсинг — очень важный шаг на пути к повышению эффективности, поскольку он даёт возможность хранить информацию более экономно. Один ген может давать начало нескольким белкам, а не один ген даёт начало только одному белку, поэтому одно и то же разнообразие протеома можно получить с генома существенно меньшего размера[1]. Это также обеспечивает эволюционную гибкость. Из-за единственной точечной мутации может привести к включению или исключению экзона из транскрипта, благодаря чему может быть получена новая изоформа белка без потери его основной формы[1]. Обнаружены действительно неупорядоченные регионы, которые содержат много неконститутивных экзонов, поэтому изоформы белка может выполнять новые функции, изменяя функциональные модули в этих местах[35][36][37]. Сравнительные оценки показывают, что возникновение альтернативного сплайсинга в ходе эволюции предшествовало появлению многоклеточности, и предполагается, что альтернативный сплайсинг был одним из средств, обеспечивающих возникновение многоклеточных организмов[38].

Исследования в рамках проекта «Геном человека», а также других проектов по секвенированию геномов показали, что геном человека всего лишь на 30% больше генома круглого червя Caenorhabditis elegans, и всего лишь в два раза больше, чем у плодовой мушки Drosophila melanogaster. Эти данные наводят на мысль, что сложность человека и позвоночных животных вообще может быть связана с более активным, по сравнению с беспозвоночными, использованию альтернативного сплайсинга[39][40]. Однако дальнейшее изучение последовательностей человека, мыши, крысы, коровы, D. melanogaster, C. elegans и растения Arabidopsis thaliana показало, что между человеком и другими животными не наблюдается значительной разнице в использовании альтернативного сплайсинга[41]. Впрочем, имеются сведения, что полученные данные были артефактом. При сравнении частоты использования альтернативного сплайсинга случайного набора генов каждого организма оказалось, что позвоночные всё-таки прибегают к альтернативному сплайсингу чаще беспозвоночных[42].

Клиническое значение[править | править вики-текст]

Изменения в машинерии процессинга РНК могут приводить к нарушениям сплайсинга многих транскриптов, а однонуклеотидные замены в сайтах сплайсинга или цис-регуляторных сайтах сплайсинга приводят к различиям в сплайсинге одного и того же гена, как и при спайсинге транскрипта мутировавшего гена. В работе 2005 года было показано, что свыше 60 % мутаций, приводящих к развитию болезней, влияют не на саму кодирующую последовательность, а на сплайсинг[43]. Показано также, что треть наследственных заболеваний связана со сплайсингом[21].

Ненормально сплайсированные клетки встречаются в заметной доле раковых клеток[5][6][8]. Анализ RNA-Seq и протеомов показал поразительно дифференциальную экспрессию сплайсинговых изоформ белков, участвующих в сигнальных путях, связанных с развитием рака[44]. Неизвестно, влияют ли нарушения сплайсинга на развития рака напрямую, или же они являются следствием поломки клеточных процессов в связи с переходом к раковому росту. Интересно, что при некоторых видах рака, такой как рак толстой кишки или рак простаты, количество ошибок в сплайсинге значительно варьировало у разных пациентов; этот феномен назвали транскриптомной нестабильностью[45][46]. Далее было показано, что транскриптомная нестабильность связана с пониженной экспрессией генов факторов сплайсинга. Действительно, в общем случае в раковых клетках альтернативный сплайсинг используется меньше, чем у нормальных клеток, причём модели сплайсинга тоже различаются. Так, в раковых клетках сохранение интрона происходит чаще, чем в нормальных клетках, а пропуск экзона — реже. Особенности сплайсинга в раковых клетках могут быть связаны с высокой частотой соматических мутаций в генах факторов сплайсинга, а некоторые особенности могут быть обусловлены изменениями в фосфорилировании транс-регуляторных факторов сплайсинга[47][7]. Некоторые особенности могут быть связаны с изменениями относительного количества факторов сплайсинга; например, в клетках рака груди наблюдаются повышенные уровни фактора сплайсинга SF2/ASF[en][48]. В одном исследовании было показано, что относительно небольшая доля (383 из 26000) вариантов альтернативного сплайсинга в раковых клетках встречалась сильно чаще, чем в нормальных, поэтому существует ограниченное количество генов, неправильный сплайсинг которых приводит к развитию опухоли[49]. Считается, однако, что губительное действие нарушенного сплайсинга сдерживается особым клеточным посттранскрипционным механизмом контроля — нонсенс-опосредованным распадом[50].

Одним из человеческих генов, специфический вариант сплайсинга которого связан с развитием рака, является один из генов DNMT. Три гена DNMT кодируют ферменты, которые добавляют метильные группы к ДНК, и эта модификация часто имеет регуляторные эффекты. Несколько неправильно сплайсированных мРНК гена DNMT3B[en] были найдены в опухолях и клетках раковых линий[en]. Экспрессия двух из этих мРНК вызывала изменения в метилировании ДНК в этих клетках. Клетки с одной ненормальной мРНК росли вдвое быстрее, чем контрольные клетки, поэтому эти мРНК связаны с развитием рака[7].

Другим примером может служить протоонкоген Ron (MST1R[en]). Важным свойством раковых клеток является их способность переселяться в нормальные ткани и нарушать их работу. Образование ненормально сплайсированной мРНК Ron было связано с повышенными уровнями SF2/ASF в клетках рака груди. Ненормальная изоформа Ron, образованная с этой мРНК, увеличивала подвижность клеток[48].

Сверхэкспрессия укороченного варианта белка FOSB[en] — ΔFosB — в специфической популяции нейронов прилежащего ядра лежит в основе возникновения и поддержания привыкания к наркотикам и естественному вознаграждению (англ. natural reward)[51][52][53][54].

Недавние провокационные исследования показывают на роль структуры хроматина и модификаций гистонов в регуляции альтернативного сплайсинга. Поэтому эпигенетические факторы могут влиять не только на экспрессию генов, но и на их сплайсинг[55].

Полногеномный анализ[править | править вики-текст]

Полногеномный анализ альтернативного сплайсинга — сложная задача. Обычно альтернативно сплайсированные транскрипты обнаруживают при сравнении экспрессируемых последовательностей-меток[en] (англ. Expressed sequence tag, EST). Большинство библиотек EST[en] собраны из очень ограниченного числа тканей, поэтому тканеспецифичные транскрипты не были учтены. Однако появились высокопроизводительные методы для изучения сплайсинга, такие как ДНК-микрочипы и глубокое секвенирование[en] (англ. deep sequencing). Эти методы могут быть использованы для поиска полиморфизмов и мутаций, расположенных в или вокруг элементов сплайсинга, которые влияют на связывание белков. При сочетании с такими методами изучения сплайсинга, как in vitro анализ репортерных генов, могут быть исследованы функциональные эффекты полиморфизмов и мутаций на сплайсинг пре-мРНК[21][24][56].

При анализе с помощью микрочипов были использованы фрагменты ДНК, являющиеся отдельными экзонами (такие как микрочип Affymetrix[en]) или границами между экзонами. Затем в микрочип добавляется меченая кДНК из интересующей ткани. Пробы кДНК комплементарно связываются с ДНК, произошедшей от экзонов, которые присутствуют в мРНК из исследуемой ткани, или с ДНК от места соединения двух экзонов. Благодаря этому методу можно определить присутствие определённых альтернативно сплайсированных мРНК[57].

Метод CLIP (англ. Cross-linking and immunoprecipitation — образование поперечных сшивок и иммунопреципитация) использует УФ-излучение для образования сшивок между белками и РНК, подвергающихся сплайсингу. Затем транс-действующие регуляторные белки сплайсинга осаждаются при помощи специальных антител. Когда РНК, связанная с белком, изолируется и клонируется, то определяется последовательность РНК, связанная с регуляторным белком[4]. Использование репортерных генов позволяет определить белки сплайсинга, участвующие в специфичных случаях альтернативного спайсинга: в зависимости от того, каким образом прошёл сплайсинг, репортерный ген будет давать начало двум разным флуоресцентным белкам. Этот метод был использован для изоляции мутантов с нарушенным сплайсингом, а значит, и определения регуляторных белков сплайсинга, инактивированных у этих мутантов[4].

Примечания[править | править вики-текст]

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Black D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. (англ.) // Annual review of biochemistry. — 2003. — Vol. 72. — P. 291—336. — DOI:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161720. — PMID 12626338. исправить
  2. 1 2 Pan Q., Shai O., Lee L. J., Frey B. J., Blencowe B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. (англ.) // Nature genetics. — 2008. — Vol. 40, no. 12. — P. 1413—1415. — DOI:10.1038/ng.259. — PMID 18978789. исправить
  3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Matlin A. J., Clark F., Smith C. W. Understanding alternative splicing: towards a cellular code. (англ.) // Nature reviews. Molecular cell biology. — 2005. — Vol. 6, no. 5. — P. 386—398. — DOI:10.1038/nrm1645. — PMID 15956978. исправить
  4. 1 2 3 David C. J., Manley J. L. The search for alternative splicing regulators: new approaches offer a path to a splicing code. (англ.) // Genes & development. — 2008. — Vol. 22, no. 3. — P. 279—285. — DOI:10.1101/gad.1643108. — PMID 18245441. исправить
  5. 1 2 Skotheim Rolf I., Nees Matthias Alternative splicing in cancer: Noise, functional, or systematic? // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. — 2007. — Vol. 39. — P. 1432—1449. — ISSN 13572725. — DOI:10.1016/j.biocel.2007.02.016. исправить
  6. 1 2 He C., Zhou F., Zuo Z., Cheng H., Zhou R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. (англ.) // Public Library of Science ONE. — 2009. — Vol. 4, no. 3. — P. e4732. — DOI:10.1371/journal.pone.0004732. — PMID 19266097. исправить
  7. 1 2 3 4 Fackenthal J. D., Godley L. A. Aberrant RNA splicing and its functional consequences in cancer cells. (англ.) // Disease models & mechanisms. — 2008. — Vol. 1, no. 1. — P. 37—42. — DOI:10.1242/dmm.000331. — PMID 19048051. исправить
  8. 1 2 3 Sveen A., Kilpinen S., Ruusulehto A., Lothe R. A., Skotheim R. I. Aberrant RNA splicing in cancer; expression changes and driver mutations of splicing factor genes. (англ.) // Oncogene. — 2016. — Vol. 35, no. 19. — P. 2413—2427. — DOI:10.1038/onc.2015.318. — PMID 26300000. исправить
  9. Chow L. T., Gelinas R. E., Broker T. R., Roberts R. J. An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA. (англ.) // Cell. — 1977. — Vol. 12, no. 1. — P. 1—8. — PMID 902310. исправить
  10. Berget S. M., Moore C., Sharp P. A. Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1977. — Vol. 74, no. 8. — P. 3171—3175. — PMID 269380. исправить
  11. 1 2 Leff S. E., Rosenfeld M. G., Evans R. M. Complex transcriptional units: diversity in gene expression by alternative RNA processing. (англ.) // Annual review of biochemistry. — 1986. — Vol. 55. — P. 1091—1117. — DOI:10.1146/annurev.bi.55.070186.005303. — PMID 3017190. исправить
  12. Chow L. T., Broker T. R. The spliced structures of adenovirus 2 fiber message and the other late mRNAs. (англ.) // Cell. — 1978. — Vol. 15, no. 2. — P. 497—510. — PMID 719751. исправить
  13. Nevins J. R., Darnell J. E. Jr. Steps in the processing of Ad2 mRNA: poly(A)+ nuclear sequences are conserved and poly(A) addition precedes splicing. (англ.) // Cell. — 1978. — Vol. 15, no. 4. — P. 1477—1493. — PMID 729004. исправить
  14. Rosenfeld M. G., Amara S. G., Roos B. A., Ong E. S., Evans R. M. Altered expression of the calcitonin gene associated with RNA polymorphism. (англ.) // Nature. — 1981. — Vol. 290, no. 5801. — P. 63—65. — PMID 7207587. исправить
  15. Rosenfeld M. G., Lin C. R., Amara S. G., Stolarsky L., Roos B. A., Ong E. S., Evans R. M. Calcitonin mRNA polymorphism: peptide switching associated with alternative RNA splicing events. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1982. — Vol. 79, no. 6. — P. 1717—1721. — PMID 6952224. исправить
  16. Maki R., Roeder W., Traunecker A., Sidman C., Wabl M., Raschke W., Tonegawa S. The role of DNA rearrangement and alternative RNA processing in the expression of immunoglobulin delta genes. (англ.) // Cell. — 1981. — Vol. 24, no. 2. — P. 353—365. — PMID 6786756. исправить
  17. Schmucker D., Clemens J. C., Shu H., Worby C. A., Xiao J., Muda M., Dixon J. E., Zipursky S. L. Drosophila Dscam is an axon guidance receptor exhibiting extraordinary molecular diversity. (англ.) // Cell. — 2000. — Vol. 101, no. 6. — P. 671—684. — PMID 10892653. исправить
  18. 1 2 3 4 5 Sammeth M., Foissac S., Guigó R. A general definition and nomenclature for alternative splicing events. (англ.) // Public Library of Science for Computational Biology. — 2008. — Vol. 4, no. 8. — P. e1000147. — DOI:10.1371/journal.pcbi.1000147. — PMID 18688268. исправить
  19. Gao K., Masuda A., Matsuura T., Ohno K. Human branch point consensus sequence is yUnAy. (англ.) // Nucleic acids research. — 2008. — Vol. 36, no. 7. — P. 2257—2267. — DOI:10.1093/nar/gkn073. — PMID 18285363. исправить
  20. Clark, David. Molecular biology. — Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2005. — ISBN 0-12-175551-7.
  21. 1 2 3 Lim K. H., Ferraris L., Filloux M. E., Raphael B. J., Fairbrother W. G. Using positional distribution to identify splicing elements and predict pre-mRNA processing defects in human genes. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2011. — Vol. 108, no. 27. — P. 11093—11098. — DOI:10.1073/pnas.1101135108. — PMID 21685335. исправить
  22. Warf M. B., Berglund J. A. Role of RNA structure in regulating pre-mRNA splicing. (англ.) // Trends in biochemical sciences. — 2010. — Vol. 35, no. 3. — P. 169—178. — DOI:10.1016/j.tibs.2009.10.004. — PMID 19959365. исправить
  23. PMID 198614269 (PMID 198614269)
    Библиографическое описание появится автоматически через некоторое время. Вы можете подставить цитату вручную или используя бота.
  24. 1 2 Wang Z., Burge C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. (англ.) // RNA (New York, N.Y.). — 2008. — Vol. 14, no. 5. — P. 802—813. — DOI:10.1261/rna.876308. — PMID 18369186. исправить
  25. 1 2 Barash Y., Calarco J. A., Gao W., Pan Q., Wang X., Shai O., Blencowe B. J., Frey B. J. Deciphering the splicing code. (англ.) // Nature. — 2010. — Vol. 465, no. 7294. — P. 53—59. — DOI:10.1038/nature09000. — PMID 20445623. исправить
  26. Ke S., Zhang X. H., Chasin L. A. Positive selection acting on splicing motifs reflects compensatory evolution. (англ.) // Genome research. — 2008. — Vol. 18, no. 4. — P. 533—543. — DOI:10.1101/gr.070268.107. — PMID 18204002. исправить
  27. Fairbrother W. G., Holste D., Burge C. B., Sharp P. A. Single nucleotide polymorphism-based validation of exonic splicing enhancers. (англ.) // Public Library of Science Biology. — 2004. — Vol. 2, no. 9. — P. e268. — DOI:10.1371/journal.pbio.0020268. — PMID 15340491. исправить
  28. 1 2 Lynch K. W., Maniatis T. Assembly of specific SR protein complexes on distinct regulatory elements of the Drosophila doublesex splicing enhancer. (англ.) // Genes & development. — 1996. — Vol. 10, no. 16. — P. 2089—2101. — PMID 8769651. исправить
  29. Graveley B. R., Hertel K. J., Maniatis T. The role of U2AF35 and U2AF65 in enhancer-dependent splicing. (англ.) // RNA (New York, N.Y.). — 2001. — Vol. 7, no. 6. — P. 806—818. — PMID 11421359. исправить
  30. Filipowicz E., Adegboyega P., Sanchez R. L., Gatalica Z. Expression of CD95 (Fas) in sun-exposed human skin and cutaneous carcinomas. (англ.) // Cancer. — 2002. — Vol. 94, no. 3. — P. 814—819. — PMID 11857317. исправить
  31. 1 2 Izquierdo J. M., Majós N., Bonnal S., Martínez C., Castelo R., Guigó R., Bilbao D., Valcárcel J. Regulation of Fas alternative splicing by antagonistic effects of TIA-1 and PTB on exon definition. (англ.) // Molecular cell. — 2005. — Vol. 19, no. 4. — P. 475—484. — DOI:10.1016/j.molcel.2005.06.015. — PMID 16109372. исправить
  32. 1 2 Zahler A. M., Damgaard C. K., Kjems J., Caputi M. SC35 and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B proteins bind to a juxtaposed exonic splicing enhancer/exonic splicing silencer element to regulate HIV-1 tat exon 2 splicing. (англ.) // The Journal of biological chemistry. — 2004. — Vol. 279, no. 11. — P. 10077—10084. — DOI:10.1074/jbc.M312743200. — PMID 14703516. исправить
  33. Jacquenet S., Méreau A., Bilodeau P. S., Damier L., Stoltzfus C. M., Branlant C. A second exon splicing silencer within human immunodeficiency virus type 1 tat exon 2 represses splicing of Tat mRNA and binds protein hnRNP H. (англ.) // The Journal of biological chemistry. — 2001. — Vol. 276, no. 44. — P. 40464—40475. — DOI:10.1074/jbc.M104070200. — PMID 11526107. исправить
  34. HHMI Bulletin September 2005: Alternative Splicing. www.hhmi.org. Проверено 26 мая 2009. Архивировано из первоисточника 22 июня 2009.
  35. Romero P. R., Zaidi S., Fang Y. Y., Uversky V. N., Radivojac P., Oldfield C. J., Cortese M. S., Sickmeier M., LeGall T., Obradovic Z., Dunker A. K. Alternative splicing in concert with protein intrinsic disorder enables increased functional diversity in multicellular organisms. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2006. — Vol. 103, no. 22. — P. 8390—8395. — DOI:10.1073/pnas.0507916103. — PMID 16717195. исправить
  36. Li H. D., Menon R., Omenn G. S., Guan Y. The emerging era of genomic data integration for analyzing splice isoform function. (англ.) // Trends in genetics : TIG. — 2014. — Vol. 30, no. 8. — P. 340—347. — DOI:10.1016/j.tig.2014.05.005. — PMID 24951248. исправить
  37. Eksi R., Li H. D., Menon R., Wen Y., Omenn G. S., Kretzler M., Guan Y. Systematically differentiating functions for alternatively spliced isoforms through integrating RNA-seq data. (англ.) // Public Library of Science for Computational Biology. — 2013. — Vol. 9, no. 11. — P. e1003314. — DOI:10.1371/journal.pcbi.1003314. — PMID 24244129. исправить
  38. Irimia M., Rukov J. L., Penny D., Roy S. W. Functional and evolutionary analysis of alternatively spliced genes is consistent with an early eukaryotic origin of alternative splicing. (англ.) // BMC evolutionary biology. — 2007. — Vol. 7. — P. 188. — DOI:10.1186/1471-2148-7-188. — PMID 17916237. исправить
  39. Ewing B., Green P. Analysis of expressed sequence tags indicates 35,000 human genes. (англ.) // Nature genetics. — 2000. — Vol. 25, no. 2. — P. 232—234. — DOI:10.1038/76115. — PMID 10835644. исправить
  40. Roest Crollius H., Jaillon O., Bernot A., Dasilva C., Bouneau L., Fischer C., Fizames C., Wincker P., Brottier P., Quétier F., Saurin W., Weissenbach J. Estimate of human gene number provided by genome-wide analysis using Tetraodon nigroviridis DNA sequence. (англ.) // Nature genetics. — 2000. — Vol. 25, no. 2. — P. 235—238. — DOI:10.1038/76118. — PMID 10835645. исправить
  41. Brett D., Pospisil H., Valcárcel J., Reich J., Bork P. Alternative splicing and genome complexity. (англ.) // Nature genetics. — 2002. — Vol. 30, no. 1. — P. 29—30. — DOI:10.1038/ng803. — PMID 11743582. исправить
  42. Kim E., Magen A., Ast G. Different levels of alternative splicing among eukaryotes. (англ.) // Nucleic acids research. — 2007. — Vol. 35, no. 1. — P. 125—131. — DOI:10.1093/nar/gkl924. — PMID 17158149. исправить
  43. López-Bigas N., Audit B., Ouzounis C., Parra G., Guigó R. Are splicing mutations the most frequent cause of hereditary disease? (англ.) // FEBS letters. — 2005. — Vol. 579, no. 9. — P. 1900—1903. — DOI:10.1016/j.febslet.2005.02.047. — PMID 15792793. исправить
  44. Omenn G. S., Guan Y., Menon R. A new class of protein cancer biomarker candidates: differentially expressed splice variants of ERBB2 (HER2/neu) and ERBB1 (EGFR) in breast cancer cell lines. (англ.) // Journal of proteomics. — 2014. — Vol. 107. — P. 103—112. — DOI:10.1016/j.jprot.2014.04.012. — PMID 24802673. исправить
  45. Sveen A., Johannessen B., Teixeira M. R., Lothe R. A., Skotheim R. I. Transcriptome instability as a molecular pan-cancer characteristic of carcinomas. (англ.) // BMC genomics. — 2014. — Vol. 15. — P. 672. — DOI:10.1186/1471-2164-15-672. — PMID 25109687. исправить
  46. Sveen A., Agesen T. H., Nesbakken A., Rognum T. O., Lothe R. A., Skotheim R. I. Transcriptome instability in colorectal cancer identified by exon microarray analyses: Associations with splicing factor expression levels and patient survival. (англ.) // Genome medicine. — 2011. — Vol. 3, no. 5. — P. 32. — DOI:10.1186/gm248. — PMID 21619627. исправить
  47. Kim E., Goren A., Ast G. Insights into the connection between cancer and alternative splicing. (англ.) // Trends in genetics : TIG. — 2008. — Vol. 24, no. 1. — P. 7—10. — DOI:10.1016/j.tig.2007.10.001. — PMID 18054115. исправить
  48. 1 2 Ghigna C., Giordano S., Shen H., Benvenuto F., Castiglioni F., Comoglio P. M., Green M. R., Riva S., Biamonti G. Cell motility is controlled by SF2/ASF through alternative splicing of the Ron protooncogene. (англ.) // Molecular cell. — 2005. — Vol. 20, no. 6. — P. 881—890. — DOI:10.1016/j.molcel.2005.10.026. — PMID 16364913. исправить
  49. Hui L., Zhang X., Wu X., Lin Z., Wang Q., Li Y., Hu G. Identification of alternatively spliced mRNA variants related to cancers by genome-wide ESTs alignment. (англ.) // Oncogene. — 2004. — Vol. 23, no. 17. — P. 3013—3023. — DOI:10.1038/sj.onc.1207362. — PMID 15048092. исправить
  50. Danckwardt S., Neu-Yilik G., Thermann R., Frede U., Hentze M. W., Kulozik A. E. Abnormally spliced beta-globin mRNAs: a single point mutation generates transcripts sensitive and insensitive to nonsense-mediated mRNA decay. (англ.) // Blood. — 2002. — Vol. 99, no. 5. — P. 1811—1816. — PMID 11861299. исправить
  51. Nestler E. J. Cellular basis of memory for addiction. (англ.) // Dialogues in clinical neuroscience. — 2013. — Vol. 15, no. 4. — P. 431—443. — PMID 24459410. исправить
  52. Ruffle J. K. Molecular neurobiology of addiction: what's all the (Δ)FosB about? (англ.) // The American journal of drug and alcohol abuse. — 2014. — Vol. 40, no. 6. — P. 428—437. — DOI:10.3109/00952990.2014.933840. — PMID 25083822. исправить
  53. Biliński P., Wojtyła A., Kapka-Skrzypczak L., Chwedorowicz R., Cyranka M., Studziński T. Epigenetic regulation in drug addiction. (англ.) // Annals of agricultural and environmental medicine : AAEM. — 2012. — Vol. 19, no. 3. — P. 491—496. — PMID 23020045. исправить
  54. Olsen C. M. Natural rewards, neuroplasticity, and non-drug addictions. (англ.) // Neuropharmacology. — 2011. — Vol. 61, no. 7. — P. 1109—1122. — DOI:10.1016/j.neuropharm.2011.03.010. — PMID 21459101. исправить
  55. Luco R. F., Allo M., Schor I. E., Kornblihtt A. R., Misteli T. Epigenetics in alternative pre-mRNA splicing. (англ.) // Cell. — 2011. — Vol. 144, no. 1. — P. 16—26. — DOI:10.1016/j.cell.2010.11.056. — PMID 21215366. исправить
  56. Fairbrother W. G., Yeh R. F., Sharp P. A., Burge C. B. Predictive identification of exonic splicing enhancers in human genes. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2002. — Vol. 297, no. 5583. — P. 1007—1013. — DOI:10.1126/science.1073774. — PMID 12114529. исправить
  57. Pan Q., Shai O., Misquitta C., Zhang W., Saltzman A. L., Mohammad N., Babak T., Siu H., Hughes T. R., Morris Q. D., Frey B. J., Blencowe B. J. Revealing global regulatory features of mammalian alternative splicing using a quantitative microarray platform. (англ.) // Molecular cell. — 2004. — Vol. 16, no. 6. — P. 929—941. — DOI:10.1016/j.molcel.2004.12.004. — PMID 15610736. исправить

Ссылки[править | править вики-текст]