Бисульфитное секвенирование

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Бисульфитное секвенирование — общее название группы методов, направленных на изучение паттерна метилирования ДНК посредством обработки ее бисульфитом.

Метилирование — первое открытое эпигенетическое маркирование. Оно влияет на уровень экспрессии генов, подавляя транскрипционную активность. Кроме того, во многих случаях метилирование наследуемо[1][2], что придает дополнительный интерес их исследованию.

Бисульфит действует на одноцепочечную ДНК, конвертируя цитозин в CpG-динуклеотиде (стоящие подряд в нуклеотидной цепочке цитозин и гуанин) в урацил[3]. Если же этот цитозин метилирован, то есть к его пятому атому углерода присоединена метильная группа, то такой цитозин не конвертируется. Таким образом, бисульфит изменяет последовательность ДНК в зависимости от ее паттерна метилирования, и после его воздействия можно установить, какие CpG-динуклеотиды были метилированы, сравнив измененную последовательность с исходной.

Методы анализа метилирования ДНК, иные, чем ПЦР, специфичный к метилированию. После бисульфитной конверсии геномная ДНК амплифицируется при помощи ПЦР, которая не различает метилированные и неметилированные последовательности. Для разделения ампликонов после бисульфитной конверсии в таком случае применяют различные методы.

Методы[править | править исходный текст]

Описанные ниже методы используют секвенирование обработанных бисульфитом участков ДНК для определения паттерна метилирования. Существуют также методы, не основанные на секвенировании, например, комбинированный бисульфитный рестриктационный анализ (COBRA) и иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP).

Описанию методов бисульфитного секвенирования посвящены несколько обзоров.[4][5][6][7][8][9]

Задачи изучения паттернов метилирования могут состоять как в исследовании метилирования конкретного CpG-динуклеотида, так и в определении доли метилированных CpG-динуклеотидов на каком-то участке ДНК, или даже по всему геному в целом. Из приводимых далее методов некоторые больше приспособлены для изучения конкретных сайтов метилирования, другие же — для изучения метилирования на более высоких уровнях. В идеале необходимо определять метилирование каждого аллеля.

Прямое секвенирование[править | править исходный текст]

Первый метод бисульфитного секвенирования описан в 1992 году.[10] Для определения паттерна метилирования использовали ПЦР, праймеры для которой были специфичными как к измененной, так и к неизмененной бисульфитом ДНК, то есть они не содержали цитозинов, входящих в CpG-динуклеотиды. Для праймеров использовали участки, близкие к интересующему сайту метилирования, но не содержащие его. В случае, когда цитозин не был метилирован, в амплифицированной последовательности обнаруживался тимин (урацил), а в синтезированной комплементарной последовательности — аденин. Если цитозин был метилирован, то в амплифицированной последовательности он и остался, а в комплементарной синтезировался гуанин. Такой метод очень трудозатратен, поскольку требует клонирования продуктов ПЦР для достижения необходимой чувствительности. Эту же проблему можно решить при помощи вложенной ПЦР (Nested PCR).

Пиросеквенирование[править | править исходный текст]

В пиросеквенировании используют ПЦР с праймерами, амплифицирующими как измененную, так и не измененную бисульфитом ДНК. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в амплифицируемой последовательности определяется по соотношению количества нуклеотидов А и Г в синтезируемой комплементарной последовательности[11][12].

Дальнейшее усовершенствование этого метода заключается в использовании аллель-специфических праймеров с однонуклеотидными полиморфизмами, позволяющих исследовать паттерны метилирования по отдельности в отцовских и материнских аллелях, что особенно полезно при изучении геномного импринтинга.[13]

Чувствительный к метилировании анализ одноцепочечных конформаций[править | править исходный текст]

Этот метод основан на методе анализа одноцепочечных конформационных полиморфизмов (single-strand conformation polymorphism analysis, SSCA). SSCA был разработан для выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)[14]. Фрагменты ДНК одинаковой длины, но разной нуклеотидной последовательности, с разной скоростью перемещаются в электрофорезе. Вообще говоря, SSCA недостаточно чувствителен для выявления единичной замены, но при достаточном количестве неметилированных CpG-динуклеотидов полиморфизмов в обработанной и необработанной бисульфитом ДНК будет достаточно много, чтобы чувствительности метода оказалось достаточно для определения доли метилированных цитозинов на рассматриваемом участке. Данный метод не позволяет исследовать метилированию в конкретном сайте, однако дает представление о метилировании на уровне некоторого участка, или даже всего генома.

Методы высокочувствительного плавления[править | править исходный текст]

Высокочувствительное плавление (high resolution melting, HRM) основан на ПЦР в реальном времени[15]. Температуру повышают с 55 до 95 градусов, в результате чего комплементарные связи между цепочками разрушаются. Скорость плавления регистрируют при помощи специальных флюоресцентных красителей, и, зная зависимость флюоресценции от нуклеотидной последовательности цепочек, можно различить однонуклеотидные полиморфизмы. Метод не дает информации о том, какие именно CpG-динуклеотиды были метилированы, и потому не изменились в процессе бисульфитной обработки, однако дает достаточно точную информацию об их количестве на интересующем участке.

Чувствительный к метилированию метод однонуклеотидного расширения праймера[править | править исходный текст]

Метод однонуклеотидного расширения праймера исходно был разработан для анализа однонуклеотидных полиморфизмов[16]. Применительно к анализу метилирования его используют следующим образом. На обработанной бисульфитом одноцепочечной ДНК отжигают праймеры до пары оснований, непосредственно предшествующей интересующему сайту метилирования. Затем праймер расширяется при помощи ДНК-полимеразы с использованием терминирующих ее дидезоксинуклеотидов. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности определяется по соотношению количеств расширений праймеров нуклеотидами Г и А соответственно.

Определить соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности можно разными способами. Используют радиоактивные или флюоресцентные метки, а также пиросеквенирование[17].

Кроме того, это можно делать при помощи матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с последующим применением время-пролетного масс-анализатора (MALDI-TOF) или ион-парной обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (IP-RP-HPLC)[18].

Расщепление, специфичное к основанию[править | править исходный текст]

Метод основан на использовании специфического расщепления РНК.[19] При добавлении к праймеру в ПЦР промотора РНК-полимеразы, in vitro синтезируется РНК-транскрипт интересующего участка, после чего расщепляется рибонуклеазой А. Рибонуклеаза А расщепляет одноцепочечную РНК на местах расположения нуклеотидов Ц и У. Используя устойчивые к расщеплению нуклеозидтрифосфаты dUTP и dCTP, можно добиться специфического расщепления в местах расположения Ц или У. Фрагменты РНК затем анализируют при помощи MALDI-TOF. Данный метод даёт информацию о метилировании каждого из имеющихся CpG-динуклеотидов, а не только о доле метилированных нуклеотидов.

Метилированно-специфичная ПЦР (MSP)[править | править исходный текст]

Этот метод использует праймеры, специфичные или только к преобразованной бисульфитом ДНК, или только к непреобразованной[20]. Соответственно, к первым праймерам прикрепляются только участки, которые были метилированы, а ко вторым — те, которые не были, что лишает необходимости секвенировать участки после амплификации.

Амплифицированную в MSP ДНК можно далее анализировать разными другими методами. Метод MethyLight использует MSP в реальном времени, основанную на флюоресценции[21]. Mc-MSP использует анализ кривых плавления[22]. Высокочувствительный метод плавления (HRM) использует и то, и другое, и потому обладает достаточной чувствительностью для определения метилирования низкого уровня[23].

Методы, основанные на микрочипах[править | править исходный текст]

Использование ДНК-микрочипов дает возможность расширить описанные выше методы для анализа метилированности на уровне всего генома[24]. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа делают специфичными к метилированию и соответствующими интересующим CpG-сайтам. Одни комплементарны измененной бисульфитом последовательности (то есть той, в которой CpG-сайт не был метилирован), другие — неизмененной. Примером такого метода служит Illumina methylation assay.

Ограничения методов[править | править исходный текст]

Первое ограничение происходит из предположения о том, что при бисульфитной обработке ДНК происходит полная конвертация, то есть все неметилированные цитозины в CpG преобразуются в урацилы, а все метилированные — не преобразуются.

Вторая проблема состоит в деградации ДНК при обработке бисульфитом. Поскольку бисульфит действует только на одноцепочечную ДНК, необходимо проводить реакцию в таких условиях, в которых ДНК оставалась бы одноцепочечной, причем проводить ее достаточное для успешной конвертации время. Однако, такие условия, а именно высокая температура и длительный период инкубации, могут привести к деградации до 90 % всей ДНК.

См. также[править | править исходный текст]

Ссылки[править | править исходный текст]

  1. Lunerová-Bedrichová J, Bleys A, Fojtová M, Khaitová L, Depicker A, Kovarík A. (Jun 2008). «Trans-generation inheritance of methylation patterns in a tobacco transgene following a post-transcriptional silencing event.». Plant J. 54 (6): 1049-62. PMID 18315537.
  2. Xiufang Ou, Yunhong Zhang, Chunming Xu, Xiuyun Lin, Qi Zang, Tingting Zhuang, Lili Jiang, Diter von Wettstein, Bao Liu. «Transgenerational Inheritance of Modified DNA Methylation Patterns and Enhanced Tolerance Induced by Heavy Metal Stress in Rice (Oryza sativa L.)». DOI:10.1371/journal.pone.0041143.
  3. Hikoya Hayatsu , Yusuke Wataya , Kazushige Kai , Shigeru Iida (July 1970). «Reaction of sodium bisulfite with uracil, cytosine, and their derivatives». Biochemistry 9 (14): 2858–65. DOI:10.1021/bi00816a016.
  4. Fraga MF, Esteller M: DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques 2002, 33:632, 634, 636—649
  5. El-Maarri O: Methods: DNA methylation. Adv Exp Med Biol 2003, 544:197-204
  6. Laird PW: The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer 2003, 3:253-266
  7. Callinan PA, Feinberg AP: The emerging science of epigenomics. Hum Mol Genet 2006, 15 Spec No 1:R95-101
  8. Reinders J, Paszkowski J. (Apr 2010). «Bisulfite methylation profiling of large genomes». Epigenomics 2 (2): 209-20. DOI:10.2217/epi.10.6..
  9. Tomasz K Wojdacz, Tine Hørning Møller, Britta Boserup Thestrup, Lasse Sommer Kristensen and Lise Lotte Hansen (July 2010). «Limitations and advantages of MS-HRM and bisulfite sequencing for single locus methylation studies». Expert Review of Molecular Diagnostics 10 (5): 575-80. DOI:10.1586/erm.10.46.
  10. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, et al. (March 1992). «A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands». Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (5): 1827–31. DOI:10.1073/pnas.89.5.1827. PMID 1542678.
  11. Colella S, Shen L, Baggerly KA, Issa JP, Krahe R (July 2003). «Sensitive and quantitative universal Pyrosequencing methylation analysis of CpG sites». BioTechniques 35 (1): 146–50. PMID 12866414.
  12. Tost J, Dunker J, Gut IG (July 2003). «Analysis and quantification of multiple methylation variable positions in CpG islands by Pyrosequencing». BioTechniques 35 (1): 152–6. PMID 12866415.
  13. Wong HL, Byun HM, Kwan JM, et al. (December 2006). «Rapid and quantitative method of allele-specific DNA methylation analysis». BioTechniques 41 (6): 734–9. DOI:10.2144/000112305. PMID 17191619.
  14. Bianco T, Hussey D, Dobrovic A (1999). «Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation». Hum. Mutat. 14 (4): 289–93. DOI:10.1002/(SICI)1098-1004(199910)14:4<289::AID-HUMU3>3.0.CO;2-A. PMID 10502775.
  15. Wojdacz TK, Dobrovic A (2007). «Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation». Nucleic Acids Res. 35 (6): e41. DOI:10.1093/nar/gkm013. PMID 17289753.
  16. Gonzalgo ML, Jones PA (June 1997). «Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE)». Nucleic Acids Res. 25 (12): 2529–31. DOI:10.1093/nar/25.12.2529. PMID 9171109.
  17. Uhlmann K, Brinckmann A, Toliat MR, Ritter H, Nürnberg P (December 2002). «Evaluation of a potential epigenetic biomarker by quantitative methyl-single nucleotide polymorphism analysis». Electrophoresis 23 (24): 4072–9. DOI:10.1002/elps.200290023. PMID 12481262.
  18. Matin MM, Baumer A, Hornby DP (October 2002). «An analytical method for the detection of methylation differences at specific chromosomal loci using primer extension and ion pair reverse phase HPLC». Hum. Mutat. 20 (4): 305–11. DOI:10.1002/humu.10118. PMID 12325026.
  19. Ehrich M, Nelson MR, Stanssens P, et al. (November 2005). «Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base-specific cleavage and mass spectrometry». Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (44): 15785–90. DOI:10.1073/pnas.0507816102. PMID 16243968.
  20. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (September 1996). «Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands». Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18): 9821–6. DOI:10.1073/pnas.93.18.9821. PMID 8790415.
  21. Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, et al. (April 2000). «MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation». Nucleic Acids Res. 28 (8): E32. DOI:10.1093/nar/28.8.e32. PMID 10734209.
  22. Akey DT, Akey JM, Zhang K, Jin L (October 2002). «Assaying DNA methylation based on high-throughput melting curve approaches». Genomics 80 (4): 376–84. DOI:10.1006/geno.2002.6851. PMID 12376091.
  23. Kristensen LS, Mikeska T, Krypuy M, Dobrovic A (April 2008). «Sensitive Melting Analysis after Real Time- Methylation Specific PCR (SMART-MSP): high-throughput and probe-free quantitative DNA methylation detection». Nucleic Acids Res. 36 (7): e42. DOI:10.1093/nar/gkn113. PMID 18344521.
  24. Adorján P, Distler J, Lipscher E, et al. (March 2002). «Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis». Nucleic Acids Res. 30 (5): e21. DOI:10.1093/nar/30.5.e21. PMID 11861926.