Иммуно-ПЦР

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Общая схема иммуно-ПЦР

Иммуно-ПЦР, или иммунополимеразная цепная реакция — это сверхчувствительный метод выявления антигенов, основанный на их специфичном взаимодействии с антителами и детекции этого взаимодействия при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Во многом метод иммуно-ПЦР схож с иммуноферментным анализом (ИФА), однако вместо фермента для детекции в нём используется фрагмент ДНК, количество которого экспоненциально увеличивается в ходе ПЦР. Именно амплификация этого фрагмента ДНК в реакционной смеси и является аналитическим сигналом метода[1].

Метод иммуно-ПЦР был предложен в 1992 году: Сано и сотрудники использовали его для обнаружения бычьего сывороточного альбумина (БСА). В их эксперименте предел обнаружения на пять порядков превзошёл предел обнаружения стандартного ИФА и составил 580 молекул на образец[1][2].

Суть метода[править | править код]

Метод иммуно-ПЦР является комбинацией ИФА и ПЦР. Первый из них используется в том случае, если в клинической диагностике необходимо обнаружить гормоны, антитела, белки или токсины. Благодаря доступности антител различной специфичности этот метод позволяет обнаруживать широкий диапазон антигенов. Однако чувствительность ИФА сравнительно невысока. С другой стороны, широко применяемый метод ПЦР служит для обнаружения очень малых количеств ДНК. Теоретически даже одной копии обнаруживаемой ДНК в исследуемом образце достаточно, чтобы диагностировать вирусные и бактериальные заболевания либо наследственные болезни. Иммуно-ПЦР сочетает в себе универсальность ИФА и чувствительность ПЦР[3].

На первой стадии иммуно-ПЦР проводят иммунохимическую реакцию между анализируемым соединением в образце и антителом. По аналогии с иммуноферментным анализом возможны разные форматы. В прямом варианте (рис. 1, А) образец наносится на поверхность планшета, а затем антиген в нём непосредственно определяется специфичным антителом, меченным ДНК. Если меченое антитело недоступно, пользуются меченым вторичным (антивидовым) антителом, связанным с ДНК. Такой формат называется непрямым (рис. 1, Б). Для определения антигена в матрицах (сыворотка крови, плазма) используют «сэндвич» (рис. 1, В). Для этого на поверхности планшета предварительно иммобилизуют связывающие антитела, которые связывают антиген при нанесении образца в лунку. Возможен также и непрямой вариант сэндвича (рис. 2, Г)[3].

Рис. 1. Форматы анализа: А — прямой; Б — непрямой; В — прямой сэндвич; Г — непрямой сэндвич

Для определения низкомолекулярных веществ используют конкурентный формат. В этом случае детектирующее меченое антитело взаимодействует не только с антигеном в анализируемом образце, но и с антигеном, иммобилизованном на твёрдой фазе. Чем больше антигена в образце, тем больше комплексов антиген — антитело образуется в растворе. Следовательно, меньше антител связывается с твёрдой фазой, и анализ даёт более низкий сигнал[3].

На второй стадии, когда антиген связан с конъюгатом антитела и сигнальной ДНК, проводят полимеразную цепную реакцию. В первых экспериментах продукты ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле, однако такой для этого приходилось переносить реакционные смеси в гель, а результаты получались количественными или полуколичественными. Альтернативой электрофорезу является ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ): этот метод позволяет установить не только наличие ДНК-метки, но и её количество. При проведении ПЦР-РВ в смесь добавляют интеркалирующий краситель (например, SYBR Green I) или зонд TaqMan. Проводить стадию амплификации можно как в одной пробирке, так и с переносом ДНК-метки в другую пробирку. Во втором случае её нужно предварительно отщепить при помощи ферментов рестрикции или нагреванием до 95-100 °С. При этом отмечается, что анализ в одной пробирке существенно менее чувствителен[3][1].

Практическая реализация[править | править код]

Платформой для анализа, как и в случае ИФА или ПЦР, служит 96-луночный микротитрационный планшет, который должен обладать способностью связывать антигены и быть термоустойчивым, чтобы ПЦР можно было провести прямо в нём, не перенося реакционную смесь в другой планшет. Также распространены поликарбонатные 8-луночные стрипы TopYield с повышенной связывающей способностью, разработанные специально для иммуно-ПЦР. (Хотя и существуют недостатки, связанные с формой их лунок: неравномерное распределение тепла при проведении ПЦР и возникновение зон преломления и отражения света, что затрудняет анализ кривых ПЦР.) Также иммуно-ПЦР проводят в поликарбонатных планшетах Corning Costar 6511 и Greiner Thermoquick polycarbonate plate 651570, а также в планшетах Robostrips[3].

Конъюгаты антитела и ДНК[править | править код]

Конъюгат антитела и ДНК является ключевым элементом в проведении иммуно-ПЦР. От его строения зависит чувствительность и воспроизводимость метода. Существует три основных типа таких конъюгатов[1].

Химерный белок[править | править код]

В работе Сано связующую функцию выполнял особый химерный белок, включавший в себя фрагмент белка А и стрептавидина. Фрагмент белка А связывался с антителом; стрептавидин связывался с ДНК, имеющей биотиновую модификацию (рис. 2, А). Такой конъюгат имеет два недостатка. Во-первых, синтез химерных белков сам по себе является трудоёмким. Во-вторых, белок А не только имеет сродство к указанному антителу, но и неспецифически связывается с улавливающими антителами, которые применяются при постановке иммуно-ПЦР (по аналогии с ИФА) в формате «сэндвича». Из-за этого возникает фоновый сигнал и снижается специфичность[1][3].

Рис. 2. Конъюгаты антитела и ДНК: А — с использованием химерного белка; Б — на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия; В — ковалентный конъюгат

Конъюгаты на основе биотина и стрептавидина[править | править код]

Более простым на практике оказалось создание конъюгата на основе взаимодействия биотина и стрептавидина (рис. 2, Б)[4]. Известно, что тетрамерные белки авидин (природный) и стрептавидин (генноинженерный из культуры Streptomyces avidii) образуют очень устойчивый комплекс с четырьмя молекулами биотина (константа диссоциации 10−13−10−15). В конъюгируемые молекулы — антитело и ДНК — химически вводится биотин, а затем эти молекулы смешивают со стрептавидином (он является более предпочтительным, поскольку, в отличие от авидина, не содержит углеводных фрагментов, приводящих к неспецифическим взаимодействиям) и происходит образование конъюгата[1][5].

Такой подход не совсем оптимален, поскольку из-за четырехвалентности авидина или стрептавидина получаемые конъюгаты могут иметь непостоянный состав, что отразится на вопроизводимости эксперимента[6]. Тем не менее более поздние исследования самосборки подобных комплексов показали, что стрептавидин несмотря на свою четырёхвалентность склонен присоединять преимущственно две биотинилированные молекулы ДНК, а конъюгаты с четырьмя ДНК вообще отсутствовали[7]. Коммерческая доступность необходимых реагентов превратила этот подход в «универсальный протокол иммуно-ПЦР»[8], и он приобрёл большую популярность[9].

Похожими по принципу организации являются конъюгаты на основе замка Tus—Ter (англ. Tus–Ter lock). Tus — это белок, останавливающий процесс репликации; он прочно связывается с короткими нуклеотидными последовательностями Ter. Комплекс Tus—Ter использовали для стехиометрического и сайт-специфического соединения ДНК-метки и антитела[1].

Ковалентные конъюгаты[править | править код]

Благодаря развитию методов биоконъюгации стало возможным синтезировать ковалентные конъюгаты антител с ДНК (рис. 2, В). На рынке доступны многочисленные бифункциональные реагенты для этой цели. Как правило, конъюгация осуществляется путём химической модификации аминогрупп или тиольных групп ДНК или антитела. Разрабатываются также подходы, связанные с реакциями клик-химии. Однако в научной литературе представлены недостаточные или противоречивые данные о выходе таких конъюгатов и об их очистке[1][3].

Поскольку в ковалентных конъюгатах детектирующее антитело и ДНК-метка связаны однозначно, это даёт возможность определять несколько антигенов в одном образце. Один из первых таких анализов был проведён для трёх аналитов с использованием ДНК-меток разной длины[10].

Интересным примером ковалентных конъюгатов являются так называемые «головастики» (англ. tadpoles). Это особые конъюгаты, в которых белковая «голова» присоединена к ДНК-хвосту. Белковая часть в таких конъюгатах имеет особый дизайн: у N-конца находится гистидиновый таг, распознающий целевой антиген, затем идёт интеин, а за ним — хитин-связывающий домен. Белок очищали на хитин-содержащих колонках и в иммобилизованном состоянии вырезание интеина и присоединение олигонуклеотида, содержащего остаток цистеина[11][12].

Развитие метода[править | править код]

Лигирование сближенных проб

Повысить чувствительность иммуно-ПЦР удалось при помощи «двойного узнавания» антигена. Метод лигирования сближенных проб основан на использовании двух антител, специфичных к двум соседним эпитопам определяемого антигена. ДНК-метки этих антител отличаются нуклеотидной последовательностью, но имеют небольшие комплементарные участки. Когда оба антитела взаимодействуют с антигеном, их ДНК-метки сближаются в пространстве и затем соединяются под действием фермента лигазы. Так возникает новая ДНК-цепь, которая и подвергается амплификации. Поскольку положительный сигнал возможен только при узнавании антигена сразу двумя антителами, такая схема позволяет исключить неспецифическое связывание[13].

Возможности иммуно-ПЦР расширяются благодаря использованию в анализе различных наноструктур. Так, например, в качестве носителя антител предложено использовать магнитные или золотые наночастицы. Их использование позволяет легче проводить необходимые манипуляции и снижает влияние посторонних компонентов пробы. В методе биобаркодинга (англ. biobarcode assay) используются и те, и другие наночастицы: на магнитных находятся связывающие антитела, а на золотых — детектирующие антитела и ДНК-метка. Анализ проводится в формате сэндвича, после чего иммунокомплексы собирают магнитом, а ДНК-отщепляют от золотых наночастиц для дальнейшего анализа. Название «биобаркодинг» связано с тем, что в оригинальной публикации предлагался сканометрический метод анализа. Так, отщеплённую ДНК конъюгировали на стеклянную поверхность, на которой предварительно были закреплены олигонуклеотиды, комплементарные половине цепи ДНК. Затем вносили золотые наночастицы, покрытые серебром(I) и содержащие олигонуклеотиды, комплементарные второй половине ДНК-метки. Затем серебро восстанавливали. При наличии в системе ДНК-метки («штрихкода») система давала положительный сигнал. Перспективы этого метода связаны с возможностью одновременного определения нескольких аналитов, поскольку наночастицы можно «кодировать» олигонуклеотидами с уникальной последовательностью олигонуклеотидов[14][15].

Оказалось, что в некоторых случаях для детекции антигенов можно использовать не антитела, а аптамеры. Например, РНК-аптамер R18 специфично связывается с кроличьим IgG. Это позволило создать метод иммуно-аптамерной ПЦР[1].

Предложены также системы для иммуно-ПЦР с использованием вирусных частиц, липосом и фагового дисплея[3].

Применение[править | править код]

Самыми распространёнными антигенами для иммуно-ПЦР являются маркерные белки, имеющие отношение к опухолям и присутствующие на ранних стадиях их развития в очень низкой концентрации. Наиболее важны среди них раково-эмбриональный антиген (РЭА) и простатический специфический антиген (ПСА). В одном из исследований метод иммуно-ПЦР оказался примерно в 1000 раз более чувствительным к РЭА, чем ИФА[16], а позже чувствительность к РЭА была доведена до 13 фг/мл, что в 1500 раз превышает чувствительность клинических методов[17].

ПСА послужил аналитом для испытания трёх форматов иммуно-ПЦР, из которых наиболее чувствительным оказался формат с использованием ковалентного конъюгата антитела и ДНК (предел обнаружения составил 48·105 молекул. Система на основе магнитных наночастиц позволила определить 0,1 пМ ПСА, что в 1000 раз чувствительнее, чем ИФА.

Иммуно-ПЦР применяют для определения вирусных белков, поскольку на ранних стадиях в организме присутствует очень малое число вирионов, и определить их можно только высокочувствительными методами. Описан подход к обнаружению антигена p24, компонента капсида вируса ВИЧ-1. Предел обнаружения составил всего 10-100 молекул на реакцию, что соответствует менее чем одному вириону. ПЦР с обратной транскрипцией имеет чувствительность 50 вирионов/мл. Также при помощи иммуно-ПЦР определяют аденовирусы, причём этот метод имеет преимущество перед ПЦР, поскольку для ПЦР необходимо выделить ДНК из образца, а в методе иммуно-ПЦР очистка от посторонних компонентов происходит на стадиях промывок. Чуствительность иммуно-ПЦР к ротавирусам, согласно литературным данным, совпадает с чувствительностью ПЦР. Также метод иммуно-ПЦР полезен для определения норовирусов[3].

Описаны также примеры определения бактериальных, растительных и микотоксинов. Например, ботулотоксин в деионизованной воде удалось определить в концентрации около 12 молекул/мл (0,02 фг/мл). В другом эксперименте анатоксин А определили при концентрации 90 пг/мл. Также токсины определяли в молоке (3,75 пг/мл для ботулинического токсина типа А, 750 пг/мл для ботулинического анатоксина типа В, 0,1 пг/мл для шига-токсина типа 2). Рицин в пищевых продуктах обнаруживали при концентрации 10-100 пг/мл. Опубликованы также данные по определению афлатоксина и полихлорированных бифенилов[3].

Также метод иммуно-ПЦР хорошо показал себя в определении антител: иммуноглобулины IgE удавалось детектировать в концентрации 180—200 пг/мл, что соответствует чувствительности коммерческих иммунохимических наборов[3].

Недостатки метода[править | править код]

Постановка анализа методом иммуно-ПЦР включает в себя длительный и сложный процесс оптимизации. Для этого чувствительного метода критическим является неспецифическое связывание компонентов реакционной смеси. Единичные сигнальные ДНК оказываются даже в образцах отрицательного контроля, и практически всегда на 30-40 цикле ПЦР проявляется их наличие. Оптимизация иммуно-ПЦР позволяет достичь максимальной разницы между фоновым сигналом и сигналом в пробирках с наличием определяемого антигена. Обычно неспецифическое связывание блокируют БСА, казеином, обезжиренным молоком, ДНК из молок лосося или тимуса телят или нормальной козьей сывороткой[3].

Проведение анализа предусматривает около 20 промывок, а суммарно анализ длится от 26 часов до 2 дней. Время анализа можно сократить за счёт использования готовых конъюгатов антитела с ДНК. В противном случае их необходимо готовить в ходе анализа, и число стадий инкубации и отмывки увеличивается. Кроме того, необходимо предпринимать меры против контаминации реакционных смесей, разделяя в пространстве место иммунохимической работы и место проведения ПЦР[3].

Примечания[править | править код]

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Chang L., Li J., Wang L. Immuno-PCR: An ultrasensitive immunoassay for biomolecular detection : [англ.] // Analytica Chimica Acta. — 2016. — Vol. 910. — P. 12–24. — DOI:10.1016/j.aca.2015.12.039.
  2. Sano T., Smith C. L., Cantor C. R. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates : [англ.] // Science. — 1992. — Vol. 258, no. 5079. — P. 120–122. — DOI:10.1126/science.1439758.
  3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Рязанцев Д. Ю., Воронина Д. В., Завриев С. К. Иммуно-ПЦР: достижения и перспективы // Успехи биологической химии. — 2016. — Т. 56. — С. 377–410.
  4. Ruzicka V., März W., Russ A., Gross W. Immuno-PCR with a commercially available avidin system // Science. — 1993. — Vol. 260, no. 5108. — P. 698–699. — DOI:10.1126/science.8480182.
  5. Diamandis E. P., Christopoulos T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology : [англ.] // Clin. Chem.. — 1991. — Vol. 37, no. 5. — P. 625–636.
  6. Sano T., Smith C. L., Cantor C. R. Response : [англ.] // Science. — 1993. — Vol. 260, no. 5108. — P. 699. — DOI:10.1126/science.260.5108.699.
  7. Niemeyer C. M., Adler M., Pignataro B., Lenhert S., Gao S., Chi L., Fuchs H., Blohm D. Self-assembly of DNA-streptavidin nanostructures and their use as reagents in immuno-PCR // Nucleic Acids Res. — 1999. — Vol. 27, no. 23. — P. 4553–4561.
  8. Zhou H., Fisher R. J., Papas T. S. Universal immuno-PCR for ultra-sensitive target protein detection : [англ.] // Nucleic Acids Res. — 1993. — Vol. 21, no. 25. — P. 6038–6039.
  9. Niemeyer C. M., Adler M., Wacker R. Detecting antigens by quantitative immuno-PCR : [англ.] // Nature Protocols. — 2007. — Vol. 2. — P. 1918–1930. — DOI:10.1038/nprot.2007.267.
  10. Hendrickson E. R., Truby T. M., Joerger R. D., Majarian W. R., Ebersole R. C. High sensitivity multianalyte immunoassay using covalent DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction : [англ.] // Nucleic Acids Res.. — 1995. — Vol. 23, no. 3. — P. 522–529. — DOI:10.1093/nar/23.3.522.
  11. Burbulis I., Yamaguchi K., Gordon A., Carlson R., Brent R. Using protein-DNA chimeras to detect and count small numbers of molecules : [англ.] // Nat. Methods. — 2005. — Vol. 2, no. 1. — P. 31–37. — DOI:10.1038/nmeth729.
  12. Burbulis I., Yamaguchi K., Yu R., Resnekov O., Brent R. Quantifying small numbers of antibodies with a 'near-universal' protein-DNA chimera : [англ.] // Nat. Methods. — 2007. — Vol. 4, no. 12. — P. 1011–1013. — DOI:10.1038/nmeth1127.
  13. Söderberg O., Gullberg M., Jarvius M., Ridderstråle K., Leuchowius K. J., Jarvius J., Wester K., Hydbring P., Bahram F., Larsson L. G., Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation : [англ.] // Nat. Methods. — 2006. — Vol. 3, no. 12. — P. 995–1000. — DOI:10.1038/nmeth947.
  14. Nam J. M., Park S. J., Mirkin C. A. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles : [англ.] // J. Am. Chem. Soc.. — 2002. — Vol. 124, no. 15. — P. 3820–3821. — DOI:10.1021/ja0178766.
  15. Gong H., Holcomb I., Ooi A., Wang X., Majonis D., Unger M. A., Ramakrishnan R. Simple Method To Prepare Oligonucleotide-Conjugated Antibodies and Its Application in Multiplex Protein Detection in Single Cells : [англ.] // Bioconjugate Chemistry. — 2016. — Vol. 27, no. 1. — P. 217–225. — Open Access. — DOI:10.1021/acs.bioconjchem.5b00613.
  16. Niemeyer C. M., Wacker R., Michael Adler M. Combination of DNA-directed immobilization and immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of self-assembled DNA–protein conjugates : [англ.] // Nucleic Acids Res.. — 2003. — Vol. 31, no. 16. — P. e90. — DOI:10.1093/nar/gng090.
  17. He J., Evers D. L., O'Leary T. J., Mason J. T. Immunoliposome-PCR: a generic ultrasensitive quantitative antigen detection system : [англ.] // J. Nanobiotechnology. — 2012. — Vol. 10, no. 1. — P. 26. — DOI:10.1186/1477-3155-10-26.

Литература[править | править код]