Обращённо-фазная хроматография

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Обращённо-фазовая (обратно-фазовая) хроматография (ОФХ) — вариант хроматографии, в котором стационарная фаза является неполярной.[1] Этот вариант хроматографии относится к жидкостной хроматографии (в отличие от газовой).

Термин «обращённо-фазная» имеет под собой историческую подоплеку. В 1970-х годах большинство жидкостных хроматографий проводились с использованием твердой стационарной фазы (также называемой «колонка»), которая содержала немодифицированные кремниевые или алюминиевые составляющие. Сегодня этот метод известен как «нормально фазная хроматография». В случае нормально-фазной хроматографии стационарная фаза гидрофильна и таким образом у нее большая аффинность к гидрофильным молекулам в мобильной фазе. Поэтому, гидрофильные молекулы в мобильной фазе имели тенденцию связываться (или «адсобрироваться») на колонке, в то время как гидрофобные молекулы проходили сквозь колонку и элюировались в первую очередь. В нормаль-фазной хроматографии гидрофильные молекулы могут быть элюированы с колонки путев увеличения полярности раствора подвижной фазы.

Введение в оборот методов, использовавших алкильные цепи, ковалентно связанные с solid support, позволили создать гидрофобную неподвижную фазу, имеющую сильную аффинность к гидрофобным соединениям. Использование гидрофобной неподвижной фазы может рассматриваться как противоположность или «обратное» по отношению к нормально-фазной хроматографии — отсюда и произошел термин «обратно-фазная хроматография».[2][3] Обратно-фазная хроматография использует полярную (водную) подвижную фазу. В результате, гидрофобные молекулы в полярной мобильной фазе адсорбируются на гидрофобной неподвижной фазе, а гидрофильные молекулы в мобильной фазе будут проходить через колонку и элюироваться в первую очередь.[2][4] Гидрофобные молекулы могут быть элюированы с колонки путем уменьшения полярности мобильной фазы, используя органические (неполярные) растворители, которые снижают гидрофобные взаимодействия. Чем более молекула гидрофобна, тем тем сильнее она свяжется с неподвижной фазой и тем выше концентрация органического растворителя, которая потребуется для элюирования этой молекулы.

Многие математические и экспериментальные предположения, используемые в других хроматографических методах, также применимы в ОФХ (например, "разрешение разделения" зависит от длины колонки). Она также может использоваться для разделения большого количества видов молекул. Этот метод обычно не используется для разделения белков, потому что используемые органические растворители могут денатурировать большинство белков. Поэтому, в данном случае нормально-фазная хроматография является более приемлемым методом.

Сегодня ОФХ часто используется в аналитических целях. Существует целый ряд различных неподвижных фаз для ОФХ, что позволяет быть более гибким в выборе методов разделения.

Стационарная фаза[править | править вики-текст]

Подвижная фаза[править | править вики-текст]

Для элюирования анализируемых веществ с обращённо-фазной колонки используются смеси воды или водных буферных растворов и органических растворителей.[2] Органические растворители должны смешиваться с водой. Самыми распространенными являются ацетонитрил, метанол и тетрагидрофуран (THF). Возможно также использовать этанол или изопропанол. Элюирование можно провозить изократично (смесь вода-органический растворитель не меняет процентного соотношения во время всего процесса разделения), либо используя градиент (соотношение вода-органический растворитель меняется в ходе процесса, обычно в сторону уменьшения полярности). Значение pH подвижной фазы может иметь большое влияние на разделение смеси, а также может изменять избирательность определенных аналитов.

Заряженные аналиты могут быть разделены на образенно фазовой колонке с использованием ионных пар (также: ионное взаимодействие). Эта техника известна как обращенно фазная ионно-парная хроматография.

Примечания[править | править вики-текст]

  1. IUPAC Gold Book internet edition: "reversed-phase chromatography".
  2. 1 2 3 Akul Mehta. Principle of Reversed-Phase Chromatography HPLC/UPLC (with Animation). PharmaXChange (December 27, 2012). Проверено 10 января 2013.
  3. I Molnár and C Horváth (September 1976). «Reverse-phase chromatography of polar biological substances: separation of catechol compounds by high-performance liquid chromatography». Clinical Chemistry 22 (9): 1497–1502. PMID 8221. Проверено 10 January 2013.
  4. (Clinical Biochemistry, T.W.Hrubey, 54)

Ссылки[править | править вики-текст]