Петлевая изотермическая амплификация

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Петлевая изотермическая амплификация (Loop mediated isothermal amplification, LAMP) — техника амплификации ДНК в одной пробирке[1]. Метод LAMP позволяет проводить молекулярную диагностику существенно дешевле и быстрее, по сравнению с ПЦР. При диагностике РНК-вирусов метод LAMP позволяет проводить обратную транскрипцию и амплификацию в одной пробирке, без переноса жидкости.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) - это метод амплификации ДНК в одной пробирке и недорогая альтернатива для выявления некоторых заболеваний. Петлевая изотермическая амплификация с обратной транскрипцией (RT-LAMP) сочетает LAMP с этапом обратной транскрипции, что позволяет выявлять РНК.

LAMP - это метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот. В отличие от технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой реакция проводится с чередованием нескольких температурных этапов или циклов, изотермическая амплификация проводится при постоянной температуре и не требует термоциклера.

Техника[править | править код]

Схема LAMP биомаркеров нуклеиновых кислот из сырых неочищенных образцов сточных вод для быстрого количественного определения специфической для человека митохондриальной ДНК (мтДНК).[2]

В LAMP целевая последовательность амплифицируется при постоянной температуре 60-65 °C (140-149 °F) с использованием двух или трех наборов праймеров и полимеразы с высокой активностью смещения нитей в дополнение к активности репликации. Обычно используется 4 различных праймера для амплификации 6 различных областей целевого гена, что повышает специфичность. Дополнительная пара "петлевых праймеров" может еще больше ускорить реакцию. Количество ДНК, полученной при LAMP, значительно выше, чем при амплификации на основе ПЦР.

Продукт амплификации можно обнаружить с помощью фотометрии, измеряя мутность, вызванную осаждением пирофосфата магния в растворе в качестве побочного продукта амплификации. Это позволяет легко визуализировать продукт невооруженным глазом или с помощью простых фотометрических методов обнаружения для малых объемов. За ходом реакции можно следить в режиме реального времени либо путем измерения мутности, либо с помощью флуоресценции с использованием интеркалирующих красителей, таких как SYTO 9. Красители, такие как SYBR green, могут быть использованы для создания видимого изменения цвета, которое можно наблюдать невооруженным глазом без необходимости использования дорогостоящего оборудования, или для реакции, которая может быть более точно измерена с помощью приборов. Молекулы красителя интеркалируют или непосредственно маркируют ДНК, что, в свою очередь, может быть соотнесено с количеством изначально присутствующих копий. Таким образом, LAMP также может быть количественным.

Обнаружение амплификации ДНК LAMP в пробирке возможно с помощью кальцеина, заряженного марганцем, который начинает флуоресцировать при комплексообразовании марганца с пирофосфатом во время синтеза ДНК in vitro.

Другой метод визуального обнаружения ампликонов LAMP невооруженным глазом основан на их способности гибридизоваться с комплементарной ss-ДНК, связанной с золотом, и таким образом предотвращать обычное изменение цвета от красного до фиолетово-синего, которое могло бы произойти при агрегации частиц золота, вызванной солью. Таким образом, метод LAMP в сочетании с детекцией ампликонов с помощью AuNP может иметь преимущества перед другими методами в плане сокращения времени анализа, подтверждения ампликонов путем гибридизации и использования более простого оборудования (т.е. нет необходимости в термоциклере, оборудовании для электрофореза или УФ-транслюминаторе).

Применение и преимущества[править | править код]

LAMP - относительно новый метод амплификации ДНК, который благодаря своей простоте, прочности и низкой стоимости может обеспечить значительные преимущества. LAMP имеет потенциал для использования в качестве простого скринингового анализа в полевых условиях или в местах оказания медицинской помощи. Поскольку LAMP является изотермическим, что устраняет необходимость в дорогостоящих термоциклерах, используемых в обычной ПЦР, он может быть особенно полезным методом для диагностики инфекционных заболеваний в странах с низким и средним уровнем дохода. LAMP широко изучается для выявления таких инфекционных заболеваний, как филяриатоз, вирус Зика, туберкулез, малярия, сонная болезнь и SARS-CoV-2. В развивающихся регионах он еще не прошел широкую валидацию для других распространенных патогенов.

Было замечено, что LAMP менее чувствителен (более устойчив), чем ПЦР, к ингибиторам в сложных образцах, таких как кровь, что, вероятно, связано с использованием другой ДНК-полимеразы (обычно Bst - Bacillus stearothermophilus - ДНК-полимераза, а не Taq-полимераза, как в ПЦР). В нескольких отчетах описано успешное обнаружение патогенов из минимально обработанных образцов, таких как термически обработанная кровь, или в присутствии матриц клинических образцов. Эта особенность LAMP может быть полезна в условиях ограниченных ресурсов или в полевых условиях, где обычное выделение ДНК или РНК перед диагностическим тестированием может быть нецелесообразным.

Ограничения[править | править код]

LAMP менее универсален, чем ПЦР, наиболее хорошо зарекомендовавший себя метод амплификации нуклеиновых кислот. LAMP полезен, прежде всего, как метод диагностики или обнаружения, но не подходит для клонирования или многих других молекулярно-биологических приложений, которые позволяет использовать ПЦР. Поскольку LAMP использует 4 (или 6) праймеров, нацеленных на 6 (или 8) областей в пределах довольно небольшого сегмента генома, и поскольку дизайн праймеров подвержен многочисленным ограничениям, трудно разработать наборы праймеров для LAMP "на глаз". Бесплатные, открытые или коммерческие пакеты программного обеспечения обычно используются для помощи в разработке праймеров для LAMP, хотя ограничения на разработку праймеров означают меньшую свободу выбора целевого сайта, чем в ПЦР.

В диагностическом приложении это должно быть сбалансировано с необходимостью выбора подходящей мишени (например, консервативного участка в сильно изменчивом вирусном геноме или мишени, специфичной для конкретного штамма патогена). Может потребоваться несколько вырожденных последовательностей, чтобы охватить различные варианты штаммов одного и того же вида. Следствием использования такого коктейля праймеров может быть неспецифическая амплификация в поздней амплификации.

Подходы к мультиплексированию для LAMP менее развиты, чем для ПЦР. Большее количество праймеров на мишень в LAMP увеличивает вероятность взаимодействия праймера с праймером для мультиплексированных наборов мишеней. Продукт LAMP представляет собой серию конкатемеров целевого региона, что приводит к появлению характерной "лестницы" или полосы на геле, а не одной полосы, как в ПЦР. Хотя это не является проблемой при обнаружении одиночных мишеней с помощью LAMP, "традиционные" (конечные) мультиплексные приложения ПЦР, в которых идентичность мишени подтверждается размером полосы на геле, не могут быть реализованы с помощью LAMP. Мультиплексирование в LAMP было достигнуто путем выбора целевого региона с сайтом рестрикции и переваривания до проведения анализа в геле, так что каждый продукт дает фрагмент определенного размера, хотя этот подход добавляет сложности в экспериментальный дизайн и протокол.

Использование в LAMP ДНК-полимеразы, замещающей прядь, также исключает использование гидролизующих зондов, например, зондов TaqMan, которые полагаются на 5'-3' экзонуклеазную активность Taq-полимеразы. Сообщалось об альтернативном подходе к мультиплексированию в реальном времени на основе флуоресцентных тушителей.

Для просмотра LAMP в режиме реального времени можно добавить краситель SYBR green. Однако на поздних стадиях амплификации праймер-димерная амплификация может привести к ложноположительному сигналу. Использование неорганической пирофосфатазы в реакционной смеси SYBR позволяет использовать анализ расплава для различения правильной амплификации.

Несмотря на то, что были предложены различные стратегии борьбы с ложноположительными результатами в анализах, основанных на этом методе, неспецифическая амплификация, обусловленная различными факторами, включая отсутствие механизмов температурного контроля, является одним из основных ограничений изотермической амплификации, опосредованной петлей.

См. также[править | править код]

  • К. Мирошников. Петлевая изотермическая амплификация ДНК[3]

Примечания[править | править код]

  1. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA (англ.) // Nucleic Acids Res. (англ.) : journal. — 2000. — Vol. 28, no. 12. — P. E63. — doi:10.1093/nar/28.12.e63. — PMID 10871386.
  2. Yang, Zhugen; Xu, Gaolian; Reboud, Julien; Kasprzyk-Hordern, Barbara; Cooper, Jonathan M. (19 September 2017). “Monitoring Genetic Population Biomarkers for Wastewater-Based Epidemiology”. Analytical Chemistry. 89 (18): 9941—9945. DOI:10.1021/acs.analchem.7b02257. PMID 28814081.
  3. К. Мирошников. Петлевая изотермическая амплификация ДНК (08.I.2014) - YouTube

Ссылки[править | править код]