РНК-полимераза

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
РНК-полимераза из клетки T. aquaticus в процессе репликации. Некоторые элементы фермента сделаны прозрачными, и цепи РНК и ДНК видны более отчётливо. Ион магния (жёлтый) располагается на активном участке фермента.
Транскрипция ДНК в РНК используя фермент РНК полимеразу II.

РНК-полимераза — фермент, осуществляющий синтез молекул РНК. В узком смысле, РНК-полимеразой обычно называют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, осуществляющие синтез молекул РНК на матрице ДНК, то есть осуществляющие транскрипцию. Ферменты класса РНК-полимераз очень важны для функционирования клетки, поэтому они имеются во всех организмах и во многих вирусах. Химически РНК-полимеразы являются нуклеотидил-трансферазами, полимеризующими рибонуклеотиды на 3'-конце цепи РНК.

История изучения[править | править код]

РНК-полимераза была открыта независимо Сэмом Вайссом и Джерардом Хурвицем (1928-2019) в 1960.[1] К этому моменту Нобелевская премия по медицине в 1959 году уже была присуждена Северо Охоа и Артуру Корнбергу за открытие вещества, которое считали РНК-полимеразой[2], впоследствии оказавшегося рибонуклеазой.

Нобелевская премия по химии в 2006 году была присуждена Роджеру Корнбергу за получение точных изображений молекул РНК-полимеразы в различные моменты процесса транскрипции.[3]

Управление транскрипцией[править | править код]

Электронная микрофотография нитей ДНК, обвешанных сотнями молекул РНК-полимеразы, слишком маленьких для такого разрешения. Каждая РНК-полимераза транскрибирует нить РНК, которая видна на фотографии как ответвление от ДНК. Отметкой «Begin» указан 5'-конец ДНК, с которого РНК-полимераза начинает транскрипцию; «End» — 3'-конец, у которого транскрипция более длинных молекул РНК завершается.

Управление процессом транскрипции генов позволяет контролировать экспрессию генов и таким образом позволяет клетке адаптироваться к изменяющимся условиям внешней среды, поддерживать метаболические процессы на должном уровне, а также выполнять специфические функции, необходимые для существования организма. Неудивительно, что действие РНК-полимеразы очень сложно и зависит от множества факторов (так, у Escherichia coli идентифицировано более 100 факторов, тем или иным способом влияющих на РНК-полимеразу[4]).

РНК-полимераза начинает транскрипцию с особых участков ДНК, называемых промоторами и производит цепочку РНК, комплементарную соответствующей части нити ДНК.

Процесс наращивания молекулы РНК нуклеотидами называется элонгацией. В эукариотических клетках РНК-полимераза может собирать цепочки из более 2,4 млн элементов (например, такую длину имеет полный ген белка дистрофина).

РНК-полимераза завершает формирование цепочки РНК, когда встречает в ДНК специфическую последовательность, называемую терминатором.

РНК-полимераза производит следующие разновидности РНК:

  • Матричная РНК (мРНК) — шаблон для синтеза белков в рибосомах.
  • Некодирующая РНК или «РНК-ген» — большой класс генов, кодирующих РНК, на которых не может быть построено белка. Самые известные представители этого класса — транспортная РНК (тРНК) и рибосомная РНК (рРНК), сами участвующие в процессе синтеза белка. Однако начиная с поздних 90-х годов XX столетия было обнаружено много других РНК-генов. Это дало возможность предположить, что РНК-гены играют более значительную роль в клетке, чем было принято считать раньше.

РНК-полимераза осуществляет синтез с нуля. Это возможно вследствие того, что взаимодействие начального нуклеотида гена и РНК-полимеразы позволяет ей закрепиться на цепочке и обрабатывать следующие нуклеотиды. Это отчасти объясняет, почему РНК-полимераза обычно начинает транксрипцию с АТФ, за которым следует ГТФ, УТФ и затем ЦТФ. В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза обладает также геликазным действием.

Действие РНК-полимеразы[править | править код]

Связывание и инициирование транскрипции[править | править код]

Схема инициализации транскрипции

В связывании РНК-полимеразы участвует α-субъединица, распознающая элемент ДНК, предшествующий гену (-40…-70 шагов), и σ-фактор, распознающий участок −10…-35. Существует большое количество σ-факторов, контролирующих экспрессию генов. Например: σ70, который синтезируется в нормальных условиях и позволяет РНК-полимеразе связываться с генами, отвечающими за метаболические процессы клетки; или σ32, блокирующий связывание РНК-полимеразы с генами белков теплового шока.

После связывания с ДНК структура РНК-полимеразы превращается из закрытой в открытую. Это превращение включает в себя разделение моноспиралей ДНК с образованием раскрученного участка длиной около 13 шагов. Рибонуклеотиды затем собираются в цепочку в соответствии с базовой нитью ДНК, используемой в качестве шаблона. Суперскрученность молекул ДНК играет существенную роль в деятельности РНК-полимеразы: поскольку участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручен, в нем существуют положительные компенсационные супервитки. Участки ДНК позади РНК-полимеразы снова закручиваются и в них присутствуют отрицательные супервитки.

Элонгация[править | править код]

Во время элонгационной фазы транскрипции происходит добавление рибонуклеотидов к цепи и переход от структуры РНК-полимеразного комплекса от открытой к транскрипционной. По мере сборки молекулы РНК участок ДНК перед РНК-полимеразой раскручивается далее, и 13-парный открытый комплекс превращается в 17-парный транскрипционный комплекс. В этот момент промотор (участок ДНК −10…-35 шагов) завершается, и σ-фактор отделяется от РНК-полимеразы. Это позволяет остальному РНК-полимеразному комплексу начать движение вперед, так как σ-фактор удерживал его на месте.

17-парный транскрипционный комплекс содержит гибрид ДНК и РНК, содержащий 8 пар оснований — 8-шаговый участок РНК, соединенный с шаблонной цепью ДНК. По мере выполнения транскрипции рибонуклеотиды добавляются к 3'-концу собираемой РНК, и РНК-полимеразный комплекс движется по цепи ДНК. Хотя в РНК-полимеразе не обнаружено свойств, характерных для 3'-экзонуклеазы, аналогичных проверочной деятельности ДНК-полимеразы, есть свидетельства того, что РНК-полимераза останавливается и корректирует ошибки в случаях ошибочного формирования пар оснований ДНК-РНК.

Добавление рибонуклеотидов к РНК обладает механизмом, очень близким к полимеризации ДНК. Считается, что ДНК- и РНК-полимеразы могут быть эволюционно связаны. Аспарагиновые остатки в РНК-полимеразе связываются с ионами Mg2+, которые, в свою очередь, осуществляют выравнивание фосфатных групп рибонуклеотидов: первый Mg2+ удерживает α-фосфат нуклеотидтрифосфата, подлежащего добавлению в цепочку. Это позволяет осуществить связывание нуклеотида с 3' OH-группой конца собираемой цепочки и таким образом добавить НТФ в цепочку. Второй Mg2+ удерживает пирофосфат НТФ. Общее уравнение реакции таким образом имеет вид:

(НМФ)n + НТФ --> (НМФ)n+1 + ПФi

Терминация[править | править код]

Терминация транскрипции РНК может быть ρ-независимой либо ρ-зависимой.

ρ-независимая терминация осуществляется без помощи ρ-фактора. Транскрипция палиндромного участка ДНК приводит к формированию шпильки из РНК, зацикленной и связанной с самой собой. Эта шпилька богата гуанином и цитозином, что делает её более стабильной, нежели гибрид ДНК-РНК. В результате 8-парный гибрид ДНК-РНК в транскрипционном комплексе сокращается до 4-парного. В случае если эти 4 последние пары оснований составлены слабыми аденином и уридином, молекула РНК отделяется.[5]

Бактериальная РНК-полимераза[править | править код]

Структура бактериальной РНК-полимеразы из Thermus aquaticus, PDB ID 1HQM [6]. Покрашены субъединицы: α1 – оранжевый, α2 – желтый, β – бежевый , β' – красный, ω – розовый.

У бактерий один и тот же фермент катализирует синтез трёх типов РНК: мРНК, рРНК и тРНК.

РНК-полимераза — достаточно большая молекула. Основной фермент содержит 5 субъединиц (~400 кДа):

  • α2: две α-субъединицы связывают остальные элементы фермента и распознают регулирующие факторы. Каждая субъединица состоит из двух доменов: αСКД (С-концевой домен) связывает первый элемент промотора, и αNКД (N-концевой домен) связывается с остальными компонентами полимеразы.
  • β: эта субъединица обладает собственно полимеразным действием, катализируя синтез РНК. Она осуществляет инициацию процесса и управляет элонгацией.
  • β': неспецифически связывается с ДНК.
  • ω: восстанавливает денатурированную РНК-полимеразу обратно в дееспособную форму in vitro. Также обнаружено её защитное/шаперонное действие на β'-субъединицу у Mycobacterium smegmatis.

Для связывания с промоторными областями ДНК, основной фермент нуждается в еще одной субъединице — сигма (σ). Сигма-фактор значительно снижает сродство РНК-полимеразы к неспецифичным областям ДНК, и в то же время повышает её чувствительность к определенным промоторам, в зависимости от своей структуры. С его помощью транскрипция начинается с нужного участка ДНК.

Полный голоэнзим таким образом состоит из 6 субъединиц: α2ββ'σω (~480 кДа). В структуре РНК-полимеразы присутствует канавка длиной 55 Å (5,5 нм) и шириной 25 Å (2,5 нм). Именно в эту канавку помещается двойная спираль ДНК, имеющая ширину 20 Å (2 нм). На длине канавки укладывается 16 нуклеотидов.

Молекулы РНК-полимеразы не растворены в цитоплазме. Когда РНК-полимераза не используется, она связывается с неспецифичными областями ДНК в ожидании открытия активного промотора.

Транскрипционные кофакторы[править | править код]

Существуют белки, связывающиеся с РНК-полимеразой и влияющие на её поведение. Например greA и greB из E. coli усиливают способность РНК-полимеразы расщеплять шаблон РНК у растущего конца цепи. Такое расщепление может «спасти» застрявшую молекулу РНК-полимеразы, а также, вероятно, участвует в устранении ошибок сборки цепи РНК.

Отдельный кофактор Mfd задействован в транскрипционном восстановлении ДНК. Во время этого процесса РНК-полимераза обнаруживает поврежденные участки ДНК и привлекает другие ферменты для её восстановления.

Многие другие кофакторы обладают регулирующим влиянием, заставляя РНК-полимеразу экспрессировать или не экспрессировать определенные гены.

РНК-полимераза в эукариотических клетках[править | править код]

Структура эукариотической РНК-полимеразы II из Saccharomyces cerevisiae, PDB ID 1WCM [7]. Покрашены субъединицы, гомологичные субъединицам бактериальной полимеразы: RPB3 – оранжевый , RPB11 – желтый , RPB2 – бежевый, RPB1 – красный, RPB6 – розовый, остальные 7 субъединиц покрашены серым.

Эукариоты обладают различными типами РНК-полимераз, классифицируемыми по типам РНК, которые они производят:

Существуют также и другие типы РНК-полимеразы, используемые в митохондриях и хлоропластах. Молекулярная масса этих ферментов составляет величину порядка 500 000. Они различаются по чувствительности к альфа-аманитину. РНК-полимераза I нечувствительна к нему, РНК-полимераза III умеренно чувствительна, а РНК-полимераза II сильно ингибируется им.[11]

РНК-полимераза у архей[править | править код]

Археи используют один вид РНК-полимеразы, который тем не менее очень похож на три основных типа РНК-полимераз у эукариот. Некоторые ученые предполагают, что архейная РНК-полимераза в определенном приближении может являться эволюционным предком специализированных эукариотических полимераз.[12]

РНК-полимераза у вирусов[править | править код]

Структура РНК-полимеразы бактериофага T7 с фрагментами ДНК и РНК , PDB ID 1MSW [13]. Белок покрашен серым, ДНК синим, РНК персиковым.

Многие вирусы содержат РНК-полимеразу. Пожалуй, наиболее хорошо изученная вирусная РНК-полимераза имеется у бактериофага Т7. Эта РНК-полимераза, состоящая из одной субъединицы, похожа на митохондриальную и хлоропластную, а также на ДНК-полимеразу.[14] Считается, что большинство вирусных полимераз произошли от ДНК-полимеразы, а не от сложных многокомпонентных РНК-полимераз.

Вирусные полимеразы очень многочисленны. Многие из них могут использовать в качестве шаблона РНК, а не ДНК, как, например, у вирусов с двуцепочечной РНК или с одноцепочечной РНК негативной полярности. Некоторые вирусы с одноцепочечной РНК позитивной полярности также содержат РНК-зависимые РНК-полимеразы.[15]

Функциональные области[править | править код]

C-концевой домен РНК-полимеразы[править | править код]

Инициирование транскрипции[править | править код]

Домен, расположенный на углекислом конце РНК-полимеразы II осуществляет инициирование транскрипции ДНК. C-концевой домен обычно состоит из порядка 52 повторений последовательности Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser [16]. Фактор транскрипции TFIIH, являющийся киназой, гиперфосфорилирует C-концевой домен РНК-полимеразы, тем самым заставляя полимеразный комплекс начать движение от места инициирования транскрипции.

5'-кэпирование[править | править код]

Основная статья: 5'-кэп

С-концевой домен также является местом связывания комплекса кэпирования. У эукариот после синтеза 5'-конца мРНК фосфатаза концевой фосфат с 5'-конца полирибонуклеотида фермент гуанозинтрансфераза присоединяет к нему гуанозинмонофосфат. При этом образуется 5',5'-трифосфатная связь. Кэпирующий комплекс затем диссоциирует от мРНК, 5'-кэп из ГТФ связывается с кэп-связывающим комплексом, C-концевого домена РНК-полимеразы. 5'-кэп в структуре мРНК эукариот имеет большое значение для связывания молекул мРНК с рибосомами, а также предотвращает деградацию РНК.

Сплайсосома[править | править код]

С-концевой домен РНК-полимеразы также является областью связывания со сплайсосомными факторами, участвующими в процессе сплайсинга РНК. Эти факторы способствуют осуществлению сплайсинга и удалению интронов в процессе транскрипции РНК.

Мутация в C-концевом домене[править | править код]

Был проведен ряд исследований поведения РНК-полимеразы при удалении определенных аминокислот из её C-концевого домена. Показано, что мутации усечения C-концевого домена РНК-полимеразы II влияют на её способность начинать транскрипцию набора генов in vivo, снижая чувствительность к активационным последовательностям этих генов.

Очистка РНК-полимеразы[править | править код]

РНК-полимераза может быть выделена следующими способами:

А также комбинациями вышеуказанных методов.

См. также[править | править код]

Примечания[править | править код]

  1. Jerard Hurwitz. The Discovery of RNA Polymerase (англ.) // Journal of Biological Chemistry : journal. — 2005. — December (vol. 280, no. 52). — P. 42477—42485. — DOI:10.1074/jbc.X500006200. — PMID 16230341.
  2. Nobel Prize 1959
  3. Nobel Prize in Chemistry 2006
  4. Akira Ishihama. Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase (англ.) : journal. — 2000. — Vol. 54. — P. 499—518. — PMID 11018136.
  5. Farnham PJ; Platt T. Rho-independent termination: dyad symmetry in DNA causes RNA polymerase to pause during transcription in vitro (англ.) // Nucleic Acids Res. (англ.) : journal. — 1981. — February (vol. 9, no. 3). — P. 563—577. — PMID 7012794.
  6. Minakhin L., Bhagat S., Brunning A., Campbell E. A., Darst S. A., Ebright R. H., Severinov K. Bacterial RNA polymerase subunit omega and eukaryotic RNA polymerase subunit RPB6 are sequence, structural, and functional homologs and promote RNA polymerase assembly (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. — 2001. — 30 January (vol. 98, no. 3). — P. 892—897. — DOI:10.1073/pnas.98.3.892. — PMID 11158566.
  7. Armache K. J., Mitterweger S., Meinhart A., Cramer P. Structures of complete RNA polymerase II and its subcomplex, Rpb4/7 (англ.) // J Biol Chem : journal. — 2005. — 25 February (vol. 280, no. 8). — P. 7131—7134. — DOI:10.1074/jbc.M413038200. — PMID 15591044.
  8. Grummt I. Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I. (англ.) // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. : journal. — 1999. — Vol. 62. — P. 109—154. — PMID 9932453.
  9. Lee Y; Kim M; Han J; Yeom KH; Lee S; Baek SH; Kim VN. Гены микроРНК, транскрибируемые РНК-полимеразой II (англ.) // EMBO J. (англ.) : journal. — 2004. — October (vol. 23, no. 20). — P. 4051—4060. — PMID 15372072.
  10. Willis IM. RNA polymerase III. Genes, factors and transcriptional specificity (англ.) // Eur J Biochem. : journal. — 1993. — February (vol. 212, no. 1). — P. 1—11. — PMID 8444147.
  11. РНК-полимеразы: общие сведения. Дата обращения 20 февраля 2011. Архивировано 16 февраля 2012 года.
  12. Langer D., Hain J., Thuriaux P., Zillig W. Transcription in archaea: similarity to that in eucarya. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1995. — Vol. 92, no. 13. — P. 5768–5772. — PMID 7597027. [исправить]
  13. Yin Y. W., Steitz T. A. Structural basis for the transition from initiation to elongation transcription in T7 RNA polymerase (англ.) // Science : journal. — 2002. — 15 October (vol. 298, no. 5597). — P. 1387—1395. — DOI:10.1126/science.1077464. — PMID 12242451.
  14. Hedtke B., Börner T., Weihe A. Mitochondrial and chloroplast phage-type RNA polymerases in Arabidopsis. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 1997. — Vol. 277, no. 5327. — P. 809—811. — PMID 9242608. [исправить]
  15. Ahlquist P. RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing. (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2002. — Vol. 296, no. 5571. — P. 1270—1273. — DOI:10.1126/science.1069132. — PMID 12016304. [исправить]
  16. Anton Meinhart1; Patrick Cramer. Recognition of RNA polymerase II carboxy-terminal domain by 3'-RNA-processing factors (англ.) // Nature : journal. — 2004. — July (vol. 430, no. 6996). — P. 223—226. — DOI:10.1038/nature02679. — PMID 15241417.
  17. Kelly JL; Lehman IR. Yeast mitochondrial RNA polymerase. Purification and properties of the catalytic subunit. (англ.) // J Biol Chem. : journal. — 1986. — August (vol. 261, no. 22). — P. 10340—10347. — PMID 3525543.
  18. Honda A et al. Purification and molecular structure of RNA polymerase from influenza virus A/PR8. (англ.) // J Biochem (Tokyo) (англ.) : journal. — 1990. — April (vol. 107, no. 4). — P. 624—628. — PMID 2358436.
  19. Hager D. A., Jin D. J., Burgess R. R. Use of Mono Q high-resolution ion-exchange chromatography to obtain highly pure and active Escherichia coli RNA polymerase. (англ.) // Biochemistry. — 1990. — Vol. 29, no. 34. — P. 7890—7894. — PMID 2261443. [исправить]

Литература[править | править код]

  • Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, David L. Nelson & Michael M. Cox

Ссылки[править | править код]