Тирозинкиназа

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Тирозинкиназа
Тирозинкиназа zap-70
Тирозинкиназа zap-70
Обозначения
Символы Pkinase_Tyr
Wikidata-logo S.svg Информация в Викиданных ?

Тирозинкиназа, Олигонуклеотид синтезирузется в направлении от 3'- к 5'-концу. В ходе синтеза 3'-концевой олигонуклеотид ковалентно связан с твердофазным носителем - CPG (controlled pore glass). Мономерами при синтезе служат фосфорамидиты нуклеозидов:

Следующая стадия - конденсация, при которой активированный фосфорамидит нуклеозида кавалентно присоединяется к свободной 5'-гидроксильной группе концевого детритилированного нуклеозида (стадия 2, рис.2). Эффективность такого присоединения около 99%. Для того, чтобы не накапливалось ошибочных олигонуклеотидов за счет оставшегося 1% непрореагировавших 5'-концевых гидроксильных групп - их блокируют ("кэпируют") с помощью реакции ацетилирования. Минимальное количество молекул, которые оказались незаблокированными в процессе реакции "кэпирования" продолжают участвовать в ситнезе, и в результате после последнего цикла синтеза образуются более короткие продукты (олигонуклеотиды с пропущенными основаниями).

После реакции конденсации и "кэпирования" два концевых основания синтезируемого олигонуклеотида оказываются связанными нестабильной фосфитной триэфирной связью. Перевод ее в стабильную фосфотриэфирную связь осуществяется за счет реакции окисления (стадия 3, рис. 2), которая завершает цикл присоединения одного основания. Далее вновь следует стадия детритилирования (стадия 4, рис. 2) и цикл повторяется. После присоединения последнего основания олигонуклеотид снимается с твердой фазы и с него удаляются оставшиеся защиты, что приводит к получению целевого олигонуклеотида.

Структура[править | править код]

Для чего необходимо очищать синтезированный олигонуклеотид? Во-первых, как говорилось выше, в процессе синтеза из-за того, что не все молекулы "кэпируются", наряду с целевым олигонуклеотидом накапливаются более короткие продукты, содержацие делеции. Во-вторых, после удаления защитных групп с олигонуклеотида, сами защитные группы остаются как примесь. В-третьих, в неочищенном конечном продукте обязательно присутствуют существенные количества неорганических солей. Очистка с помощью гель-фильтрации (так называемое обессоливание), или с помощью переосаждения - убирает примеси защитных групп и солей, но основная проблема, из-за которой необходимо очищать олигонуклеотиды - короткие олигонуклеотидные продукты с неправильной последовательностью - этими способами не решается. Поэтому ВСЕ олигонуклеотиды, синтезируемые в нашей компании очищаются с помощью полиакриламидного гель-электрофореза и/или ВЭЖХ.

Контроль качества синтезируемых олигонуклеотидов. Существуют два критерия качества олигонуклеотидов. Первый - химическая чистота продукта (примеси более коротких олигонуклеотидов не допускаются). Контроль за этим осуществляется с помощью ВЭЖХ и электрофореза в ПААГе. Второй - точность последовательности, которую можно контролировать с помощью MALDI-TOF масс-спектрального анализа (для олигонуклеотидов длиной менее 45 оснований). Быть абсолютно уверенным в качестве олигонуклеотидов особенно важно при проведении продолжительных и сложных работ, таких как сайт-специфический мутагенез, клонирование с введением сайтов рестрикций и других.

Функции[править | править код]

К семейству тирозинкиназ относятся рецепторы инсулина, рецепторы факторов роста, включая тромбоцитарный фактор роста и фактор роста эпидермиса. При активации рецепторы с тирозинкиназной активностью могут фосфорилировать сами себя. Такое аутофосфорилирование, обычно сопряженное с формированием димеров рецептора, повышает активность фермента по типу положительной обратной связи[1]. Активированная тирозинкиназа фосфорилирует различные белки-мишени, что приводит к изменениям мембранного транспорта, транскрипции генов и других клеточных процессов.

Примечания[править | править код]

  1. Dengjel J, Kratchmarova I, Blagoev B. Receptor tyrosine kinase signaling: a view from quantitative proteomics (англ.) // Mol Biosyst. — 2009. — Vol. 5, no. 10. — P. 1112–1121.

Ссылки[править | править код]