Фаговый дисплей

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Фаговый дисплей (англ. phage display) — это лабораторный метод изучения белок-белковых, белок-пептидных и ДНК-белковых взаимодействий, использующий бактериофагов для того, чтобы соотнести белки и генетическую информацию, кодирующую их. Суть метода в том, что ген, который кодирует белок, интересующий исследователя, встраивают в ген фага, отвечающий за синтез белка капсида, в результате чего фаг начинает «отображать» исследуемый белок на своей оболочке. Так получают соответствие между генотипом и фенотипом фага, а затем исследуют взаимодействие данного белка с другими белками, пептидами или последовательностями ДНК. С помощью in vitro селекции, аналогичной естественному отбору, и амплификации таким образом могут быть получены большие белковые библиотеки.

Наиболее часто используемыми бактериофагами для фагового дисплея являются M13, T4, T7, филаментные фаги[1] и фаг λ.[2]

История[править | править вики-текст]

Метод фагового дисплея был впервые описан Джорджем Смитом (George P. Smith) в 1985 г.[3], который продемонстрировал «отображение» пептида на филаментном фаге после внесения изменений в ген III этого фага. В том же году получает патент Джордж Печеник (George Pieczenik), который также описывает получение библиотек фагового дисплея. Впоследствии в развитии этой технологии принимали участие группы Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже, Исследовательского института Скриппса (США), Национального центра исследования рака (Германия).

Общий вид процедуры[править | править вики-текст]

Последовательность шагов исследования методом фагового дисплея

Далее приведены типичные шаги исследования методом фагового дисплея для определения полипептидов, которые связываются с высокой аффинностью с целевыми белками или последовательностями ДНК:

  1. Целевые белки или последовательности ДНК помещаются в ячейки микротитрационного планшета.
  2. Различные генетические последовательности, вставленные в ген синтеза капсида, экспрессируются в бактериофагах, таким образом, на оболочке каждого фага «отображается» свой белок, соответствующий внесенным генетическим изменениям.
  3. Эти бактериофаги помещаются на планшет, и спустя некоторое время, которое требуется для связывания, смываются с него.
  4. Таким образом, на планшете останутся только те фаги, которые хорошо связались с целевыми молекулами, а остальные будут смыты.
  5. Связавшиеся фаги могут быть элюированы (отмыты) и использованы для получения новых фагов путём заражения подходящих бактерий-носителей. Новая популяция фагов представляет собой смесь, в которой намного меньше нерелевантных (не связывающихся с целевыми молекулами) фагов, чем в изначальной смеси.
  6. Шаги 3-5 опционально можно повторить несколько раз для получения более богатой специфичными фагами популяции.
  7. После амплификации с помощью бактерий секвенируется ДНК полученных специфичных фагов для определения белков или их фрагментов, взаимодействующих с целевыми молекулами.

Применения[править | править вики-текст]

Применения технологии фагового дисплея включают в себя определение взаимодействующих веществ для определённого белка, позволяя впоследствии установить функцию или механизм работы этого белка. Фаговый дисплей широко используется для белковой эволюции in vitro — так называемой белковой инженерии. В этом применении он является полезным инструментом для поиска и обнаружения новых лекарств. Также он используется для поиска новых лигандов (ингибиторов ферментов, агонистов и антагонистов рецепторов) целевых белков. [4][5][6]

С помощью этого метода определяют опухолевые антигены[7] (для целей диагностического и терапевтического таргетирования), а также исследуют ДНК-белковые взаимодействия[8], используя библиотеки специальных последовательностей ДНК с рандомизированными сегментами.

Получение антител in vitro[править | править вики-текст]

Изобретение метода фагового дисплея привело к прорыву в области поиска новых антител. В 1991 г. группа Исследовательского центра Скриппса сообщила о первом «отображении» человеческих антител на фаге. Фаговый дисплей библиотек антител стал мощным методом как для изучения иммунного ответа, так и для быстрой селекции и эволюции человеческих антител для последующего использования в терапевтических целях.

Библиотеки антител, отображающие на фагах миллионы различных антител, часто используются в фармацевтической индустрии для выделения узкоспецифичных терапевтических антител с последующей разработкой лекарств, основанных на них, прежде всего противораковых и противовоспалительных.

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Kehoe JW, Kay BK (2005). «Filamentous phage display in the new millennium». Chem. Rev. 105 (11): 4056–4072. DOI:10.1021/cr000261r.
  2. Smith GP, Petrenko VA (1997). «Phage display». Chem. Rev. 97 (2): 391–410. DOI:10.1021/cr960065d.
  3. Smith GP (1985). «Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface». Science 228 (4705): 1315–1317. DOI:10.1126/science.4001944. PMID 4001944.
  4. (November 2005) «Comparison of bacterial and phage display peptide libraries in search of target-binding motif». Appl. Biochem. Biotechnol. 127 (2): 125–31. DOI:10.1385/ABAB:127:2:125. PMID 16258189.
  5. (July 2005) «Affinity selection to papain yields potent peptide inhibitors of cathepsins L, B, H, and K». Biochem. Biophys. Res. Commun. 332 (3): 897–903. DOI:10.1016/j.bbrc.2005.05.028. PMID 15913550.
  6. (July 2005) «Peptide inhibitor of pancreatic lipase selected by phage display using different elution strategies». J. Lipid Res. 46 (7): 1512–6. DOI:10.1194/jlr.M500048-JLR200. PMID 15863836.
  7. (December 1999) «Phage display of cDNA repertoires: the pVI display system and its applications for the selection of immunogenic ligands». J. Immunol. Methods 231 (1–2): 39–51. DOI:10.1016/S0022-1759(99)00139-8. PMID 10648926.
  8. (December 2005) «Engineering zinc finger protein transcription factors: the therapeutic relevance of switching endogenous gene expression on or off at command». J. Mol. Biol. 354 (3): 507–19. DOI:10.1016/j.jmb.2005.06.082. PMID 16253273.