Cas9

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Кристаллическая структура S. aureus Cas9 в комплексе с сгРНК и её целевой ДНК в разрешении 2.6 A˚. (Nishimasu, et al. 2015)

Cas9 (англ. CRISPR associated protein 9, CRISPR-ассоциированный белок) — это управляемая при помощи РНК-гидов эндонуклеаза, связанная с адаптивной иммуной системой CRISPR (англ. Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) у ряда бактерий, в частности Streptococcus pyogenes. S. pyogenes использует Cas9 для запоминания[1], последующей проверки и разрезания чужеродной ДНК[2], например, ДНК бактериофагов или плазмид.

Cas9 выполняет проверку посредством раскручивания инородной ДНК и определения её комплементарности с двадцатью спаренными основаниями спейсера управляющей РНК. Если субстрат комплементарен управляющей РНК, Cas9 расщепляет чужую ДНК. В этом смысле механизм CRISPR-Cas9 имеет ряд параллелей с механизмом РНК-интерференции (RNAi) у эукариот.

Использование Cas9 в генной инженерии[править | править код]

Кроме изначальной функции в бактериальном иммунитете, белок Cas9 активно используют для создания точечных разрывов в двойной спирали ДНК, такие разрывы могут приводить к инактивации генов или созданию гетерологичных генов посредством соединения негомологичных концов и соответствующей гомологичной рекомбинации. Вместе с белками ZFN и TALEN, Cas9 становится значимым инструментом редактирования генома. Более того, создана технология, позволяющая вносить точечную мутацию не разрезая цепь ДНК, а путём преобразования одного нуклеотидного основания в другое[3].

Механизм избирательного ингибирования транскрипции с помощью dCas9 путём стерического препятствия
Варианты Cas9, которые связываются с ДНК, но не расщепляют её могут быть использованы для создания искусственных факторов транскрипции для избирательного регулирования транскрипционной активации и репрессии

К 2012 году Cas9 приобрёл популярность, потому что он позволяет расщеплять практически любую нуклеотидную последовательность, комплементарную управляющей РНК[2]. Поскольку избирательность Cas9 является следствием комплементарности управляющей РНК и ДНК, а не модификации самого белка (в отличие от случаев TALEN и ZFN), для новых ДНК-мишеней возможна выработка специфических Cas9[4]. Варианты Cas9, которые связывают ДНК, но не расщепляют её (dCas9), могут быть использованы для доставки транскрипционных активаторов или репрессоров к специфичным последовательностям ДНК с целью регулирования транскрипционной активации и репрессии[5][6]. Хотя природный Cas9 требует составления управляющей РНК из двух в корне различных РНК — CRISPR-РНК (crRNA), и транс-активационную РНК (tracrRNA)[2], нацеливание Cas9 было упрощено при помощи выработки единой химерной управляющей РНК. Предполагается, что Cas9 можно будет использовать для изменения генома целых популяций организмов[7]. В 2015 году посредством Cas9 впервые был модифицирован геном человеческого эмбриона[8]. Разработана технология иммуногеномной инженерии гибридом, позволяющая быстро перепрограммировать специфичность их антител с помощью Cas9[9].

Создана технология, которая позволяет редактировать отдельные «буквы» ДНК и РНК, что позволит лечить врожденные заболевания, вызванные точечными мутациями.[10] Создана технология MAGESTIC (multiplexed accurate genome editing with short, trackable, integrated cellular barcodes), которая не только расщепляет ДНК, но еще и доставляет к месту разрыва кусок ДНК необходимый для точной замены (с помощью гибридного связывающего ДНК белка LexA–Fkh1p), что повышает точность и эффективность редактирования[11][12]

Использование dCas9 в эпигенетике[править | править код]

Соединив инактивированную молекулу dCas9, которая связывает ДНК, но не расщепляет её, с нуклеазой FokI, удается получить нуклеазы и рестриктазы для высокоселективного разрезания ДНК[13][14][15]. Разработан также способ избирательного эпигенетического перепрограммирования активности генов с помощью инактивированной молекулы dCas9, соединенной с ферментом, осуществляющим деметилирование ДНК[16]. Причём такое перепрограммирование эпигенома можно проводить даже in vivo[17]. Позднее выяснилось, что если укоротить управляющую РНК до 14-15 нуклеотидов, то молекула Cas9 теряет способность разрезать ДНК[18][19]. Используя это свойство удалось создать систему для избирательной активации определенных генов in vivo и проверить ее эффективность путем лечения мышек со смоделированными заболеваниями[20] У этого метода есть только одна проблема: обычно система CRISPR загружается в безвредный вирус, называемый аденоассоциированным вирусом (AAV), который переносит систему в клетку. Но весь белок, состоящий из dCas9 и направляющей РНК, слишком велик, чтобы поместиться в один AAV. Чтобы обойти эту проблему, исследователи загрузили dCas9 в один вирус, а управляющую РНК - в другой[20].

Новые способы доставки Cas9 в клетку[править | править код]

Основными требованиями к системе доставки Cas9 помимо высокой эффективности доставки является: (1) конструкция синтезирующая Cas9 не должна встраиваться в геном клетки и не должна быть в клетке постоянно чтобы не мешать работе клетки и не спровоцировать иммунных реакций; (2) средство доставки должно быть способно вместить достаточно большие по размерам фермент Cas9 или кодирующую его мРНК, а также одну или несколько направляющих РНК; (3) оно должно быть удобно для использования в виде инъекций; (4) такое средство вместе с Cas9 и направляющими РНК должно быть достаточно легко воспроизводимым для крупномасштабного производства лекарственного препарата для борьбы с распространенными болезнями. Таким критериям в отличие от вирусных систем доставки, отвечают липидные наночастицы. Так, например, была создана биодеградируемая система доставки Cas9 липидной наночастицей, которая позволила после однократного введения достичь in vivo более 97% ингибирования уровня одного из белков сыворотки крови. При этом такое однократное введение, несмотря на временный характер системы доставки и компонентов системы редактирования, приводило к долговременному ингибированию продолжавшемуся в течение 12 месяцев[21].

См. также[править | править код]

Ссылки[править | править код]

  1. Heler R., Samai P., Modell J. W., Weiner C., Goldberg G. W., Bikard D., Marraffini L. A. Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation. (англ.) // Nature. — 2015. — Vol. 519, no. 7542. — P. 199—202. — DOI:10.1038/nature14245. — PMID 25707807. [исправить]
  2. 1 2 3 Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity // Science. — 2012. — 28 июня (т. 337, № 6096). — С. 816—821. — ISSN 0036-8075. — DOI:10.1126/science.1225829. [исправить]
  3. Komor A. C., Kim Y. B., Packer M. S., Zuris J. A., Liu D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. (англ.) // Nature. — 2016. — DOI:10.1038/nature17946. — PMID 27096365. [исправить]
  4. Mali Prashant, Esvelt Kevin M, Church George M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology // Nature Methods. — 2013. — Vol. 10. — P. 957-963. — ISSN 1548-7091. — DOI:10.1038/nmeth.2649.
  5. Mali Prashant, Aach John, Stranges P Benjamin, Esvelt Kevin M, Moosburner Mark, Kosuri Sriram, Yang Luhan, Church George M. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering // Nature Biotechnology. — 2013. — 1 августа (т. 31, № 9). — С. 833—838. — ISSN 1087-0156. — DOI:10.1038/nbt.2675. [исправить]
  6. Gilbert Luke A., Larson Matthew H., Morsut Leonardo, Liu Zairan, Brar Gloria A., Torres Sandra E., Stern-Ginossar Noam, Brandman Onn, Whitehead Evan H., Doudna Jennifer A., Lim Wendell A., Weissman Jonathan S., Qi Lei S. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes // Cell. — 2013. — Июль (т. 154, № 2). — С. 442—451. — ISSN 0092-8674. — DOI:10.1016/j.cell.2013.06.044. [исправить]
  7. Esvelt Kevin M, Smidler Andrea L, Catteruccia Flaminia, Church George M. Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations // eLife. — 2014. — 17 июля (т. 3). — ISSN 2050-084X. — DOI:10.7554/eLife.03401. [исправить]
  8. Cyranoski David, Reardon Sara. Chinese scientists genetically modify human embryos // Nature. — 2015. — 22 апреля. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature.2015.17378. [исправить]
  9. Pogson M., Parola C., Kelton W. J., Heuberger P., Reddy S. T. Immunogenomic engineering of a plug-and-(dis)play hybridoma platform. (англ.) // Nature communications. — 2016. — Vol. 7. — P. 12535. — DOI:10.1038/ncomms12535. — PMID 27531490. [исправить]
  10. Разработана революционная технология точечного редактирования генома (рус.), INFOX.ru. Проверено 9 ноября 2017.
  11. Kevin R Roy, Justin D Smith, Sibylle C Vonesch, Gen Lin, Chelsea Szu Tu, Alex R Lederer, Angela Chu, Sundari Suresh, Michelle Nguyen, Joe Horecka, Ashutosh Tripathi, Wallace T Burnett, Maddison A Morgan, Julia Schulz, Kevin M Orsley, Wu Wei, Raeka S Aiyar, Ronald W Davis, Vytas A Bankaitis, James E Haber, Marc L Salit, Robert P St.Onge, Lars M Steinmetz. (2018). Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast. Nature Biotechnology, DOI:10.1038/nbt.4137
  12. Taking CRISPR from clipping scissors to word processor. New platform transforms gene editor into precision tool
  13. Tsai S. Q., Wyvekens N., Khayter C., Foden J. A., Thapar V., Reyon D., Goodwin M. J., Aryee M. J., Joung J. K.  Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing // Nature Biotechnology. — 2014. — Vol. 32, no. 6. — P. 569—576. — DOI:10.1038/nbt.2908. — PMID 24770325. [исправить]
  14. Guilinger J. P., Thompson D. B., Liu D. R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. (англ.) // Nature biotechnology. — 2014. — Vol. 32, no. 6. — P. 577—582. — DOI:10.1038/nbt.2909. — PMID 24770324. [исправить]
  15. Wyvekens N., Topkar V. V., Khayter C., Joung J. K., Tsai S. Q. Dimeric CRISPR RNA-Guided FokI-dCas9 Nucleases Directed by Truncated gRNAs for Highly Specific Genome Editing. (англ.) // Human gene therapy. — 2015. — Vol. 26, no. 7. — P. 425—431. — DOI:10.1089/hum.2015.084. — PMID 26068112. [исправить]
  16. Xu X., Tao Y., Gao X., Zhang L., Li X., Zou W., Ruan K., Wang F., Xu G. L., Hu R. A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation. (англ.) // Cell discovery. — 2016. — Vol. 2. — P. 16009. — DOI:10.1038/celldisc.2016.9. — PMID 27462456. [исправить]
  17. Morita S., Noguchi H., Horii T., Nakabayashi K., Kimura M., Okamura K., Sakai A., Nakashima H., Hata K., Nakashima K., Hatada I. Targeted DNA demethylation in vivo using dCas9-peptide repeat and scFv-TET1 catalytic domain fusions. (англ.) // Nature biotechnology. — 2016. — DOI:10.1038/nbt.3658. — PMID 27571369. [исправить]
  18. Dahlman, J. E., Abudayyeh, O. O., Joung, J., Gootenberg, J. S., Zhang, F., & Konermann, S. (2015). Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nature biotechnology, 33(11), 1159-1161. DOI:10.1038/nbt.3390
  19. Kiani, S., Chavez, A., Tuttle, M., Hall, R. N., Chari, R., Ter-Ovanesyan, D., ... & Buchthal, J. (2015). Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nature methods, 12(11), 1051-1054. DOI:10.1038/nmeth.3580
  20. 1 2 Hsin-Kai Liao, Fumiyuki Hatanaka, Toshikazu Araoka, et al., & Juan Carlos Izpisua Belmonte (2017). In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell, DOI:10.1016/j.cell.2017.10.025
  21. Finn J.D., Smith A.R., et al., & Morrissey D.V. (2018). A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports, 22(9), 2227–2235 DOI:10.1016/j.celrep.2018.02.014

Литература[править | править код]

  1. Джагаров Д.Э. (2014). «Умные ножницы для ДНК». «Химия и жизнь -XXI век» (7).
  2. Джагаров Д.Э. (2014). «Новый метод генной инженерии - CRISPR/Cas9». Academia.edu.
  3. Дарья Спасская (2018). CRISPR-активация одного гена превратила «взрослые» клетки обратно в стволовые. N+1
  4. Руководство по пониманию и использованию CRISPR (на англ) Загрузите бесплатную электронную книгу здесь http://powered.synthego.com/crispr-101
  5. How To Conduct Successful CRISPR Experiments eBook Загрузите бесплатную электронную книгу здесь http://powered.synthego.com/how-to-conduct-successful-crispr-experiments-ebook?utm_campaign=TheScientist&utm_source=social&utm_medium=how-to-ebook
  6. Kazuto Yoshimi, Yayoi Kunihiro, Takehito Kaneko, Hitoshi Nagahora, Birger Voigt, Tomoji Mashimo. (2016). «ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes». Nature Communications 7: 10431. DOI:10.1038/NCOMMS10431.
  7. CRISPR: gene editing is just the beginning. The real power of the biological tool lies in exploring how genomes work. Nature 531, 156–159 (10 March 2016) DOI:10.1038/531156a(на англ.) Обзор разных способов применения Cas9. Хорошие иллюстрации.
  8. CRISPR-Cas: A Laboratory Manual Edited by Jennifer Doudna, University of California, Berkeley; Prashant Mali, University of California, San Diego
  9. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., & Zhang, F. (2016). «Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity». Science 351 (6268): 84-88. DOI:10.1126/science.aad5227.
  10. Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., et al., & J. Keith Joung (2016). «High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects». Nature. DOI:10.1038/nature16526.
  11. Mandegar M. A., Huebsch N., Frolov E. B., et al., & Conklin B. R. (2016). «CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs». Cell Stem Cell. DOI:10.1016/j.stem.2016.01.022.
  12. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2015). «Small molecule–triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity». Nature chemical biology 11 (5): 316-318. DOI:10.1038/nchembio.1793.
  13. Zetsche, B., Volz, S. E., & Zhang, F. (2015). «A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation». Nature biotechnology 33 (2): 139-142. DOI:10.1038/nbt.3149.
  14. Zlotorynski, E. (2016). «Genome engineering: Structure-guided improvement of Cas9 specificity». Nature Reviews Molecular Cell Biology: 3-3.
  15. Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: структура и гипотетические функции. Природа 6 (2014), 16-21;
  16. Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: механизм действия и применения. Природа 7 (2014), 3-9.
  17. Артамонова И.(2014). CRISPR-системы: иммунизация прокариот «биомолекула.ру»
  18. Chu, V. T., Weber, T., Wefers, B., Wurst, W., Sander, S., Rajewsky, K., & Kühn, R. (2015). Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nature biotechnology. DOI:10.1038/nbt.3198
  19. van Erp PB et al.(2015). The history and market impact of CRISPR RNA-guided nucleases. Curr Opin Virol.;12:85-90. PMID 25914022
  20. Cong, L., & Zhang, F. (2015). Genome Engineering Using CRISPR-Cas9 System. In Chromosomal Mutagenesis. Methods in Molecular Biology Vol. 1239, 2015, pp 197–217. Springer New York.
  21. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., & Nekrasov, V. (2015). Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current opinion in biotechnology, 32, 76-84. DOI:10.1016/j.copbio.2014.11.007
  22. Kennedy E.M., Cullen B.R. (2015). Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: A revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology, 479—480, 213—220 DOI:10.1016/j.virol.2015.02.024
  23. Junwei Shi, Eric Wang, Joseph P Milazzo, Zihua Wang, Justin B Kinney, Christopher R Vakoc.(2015). Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology,; DOI:10.1038/nbt.3235
  24. Michael Boettcher, Michael T. McManus (2015). Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell, 58(4), p575-585 DOI https://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.04.028
  25. Heidi Ledford (2015). «CRISPR, the disruptor. A powerful gene-editing technology is the biggest game changer to hit biology since PCR. But with its huge potential come pressing concerns.». NATURE 522: 20–24. DOI:10.1038/522020a.
  26. CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes смотри также: Chari R, Mali P, Moosburner M, Church GM (2015). Unraveling CRISPR-Cas9 genome engineering parameters via a library-on-library approach. Nature Methods (in press).
  27. Amanda Andersson-Rolf et al., & Bon-Kyoung Koo (2017). «One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.». Nature Methods. DOI:10.1038/nmeth.4156.CRISPR–FLIP, a strategy that provides an efficient, rapid and scalable method for biallelic conditional gene knockouts in diploid or aneuploid cells.
  28. SØREN HOUGH (2017). COMPARING DNA, RNA AND RNP-BASED CRISPR DELIVERY. DESKGEN
  29. Nakajima, K., Zhou, Y., Tomita, A., Hirade, Y., Gurumurthy, C. B., & Nakada, S. (2018). Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair. Genome research, 28(2), 223-230. PMC 5793786 DOI:10.1101/gr.226027.117
  30. Qiu, X. Y., Zhu, L. Y., Zhu, C. S., Ma, J. X., Hou, T., Wu, X. M., ... & Zhu, L. (2018). Highly Effective and Low-Cost MicroRNA Detection with CRISPR-Cas9. ACS synthetic biology, 7(3), 807-813. DOI:10.1021/acssynbio.7b00446 PMID 29486117

Ссылки[править | править код]

Технологии редактирования генома и наборы OriGene для нокаута любого интересующего гена из генома