Эта статья входит в число добротных статей

FAIRE-Seq

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

FAIRE-Seq (англ. Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements sequencing) — метод молекулярной биологии, используемый для определения регуляторных последовательностей (участков)[en] ДНК[1][2]. FAIRE-Seq является комбинацией метода выделения регуляторных элементов хроматина (FAIRE) и высокопроизводительного секвенирования.

Описание метода[править | править код]

Принцип метода FAIRE

FAIRE — один из методов картирования областей открытого хроматина, наряду с методом определения участков, гиперчувствительных к ДНКазе I (DNase-seq) и методом иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq, ChIP-on-chip). Идея метода была предложена в 2003 г. для фракционирования хроматина Saccharomyces cerevisiae на 2 части: первая — участки, транскрибируемые РНК-полимеразой II, вторая — некодирующие последовательности и участки, транскрибируемые РНК-полимеразами I или III[3]. Разделение осуществляется за счет разной степени сшивания формальдегидом отдельных регионов хроматина. В 2007 г. с помощью данного метода были определены регионы, связанные с регуляторной активностью в хроматине человека; таким образом, метод прошел проверку и получил своё название FAIRE[4]. В первоначальном варианте для анализа данных использовалась гибридизация флуоресцентномеченных фрагментов ДНК с ДНК-микрочипами[4], что в дальнейшем получило название FAIRE-chip. В последующих работах были предложены другие способы анализа полученных участков ДНК, среди которых самым распространённым является FAIRE-seq[1].

На сегодняшний день существует несколько вариантов метода, предназначенных для тканей животных и растений. При работе с растениями требуются более жесткие условия и продолжительное время фиксации формальдегидом из-за клеточной стенки, восковой кутикулы листьев и воздушных пространств в губчатом мезофилле[5]. Кроме картирования регуляторных участков, метод позволяет сравнивать активные элементы в разных тканях (как опухолевых, так и здоровых). Эксперименты с использованием FAIRE-seq занимают в среднем около трех дней, не включая анализ и интерпретацию полученных данных[6].

Идея метода[править | править код]

В эукариотических клетках открытый хроматин наблюдается в активных регуляторных областях, поэтому выделение участков, небогатых нуклеосомами, позволило бы картировать регуляторные элементы генома вне зависимости от типа клеток[2]. При добавлении формальдегида к культуре ткани образуются сшивки (англ. cross-links) между белками, белками и нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК и гистонами или между гистонами. Далее геномная ДНК подвергается ультразвуковой фрагментации на участки длиной в среднем 300—400 пар оснований. При последующей экстракции фенол-хлороформом свободная от белков ДНК будет находиться в водной фазе, а ковалентно связанные ДНК-белковые комплексы — на границе раздела фаз. Таким образом, участки генома, ассоциированные с регуляторной активностью и свободные от нуклеосом (или с небольшим их количеством), находятся над границей раздела фаз в воде. Они могут быть извлечены оттуда, ещё раз очищены от оставшихся белков с помощью фенол-хлороформа, обработаны рибонуклеазой А и переосаждены для последующего анализа. В качестве контроля используется образец ДНК, полученный из той же культуры ткани с помощью тех же процедур, но без фиксации формальдегидом[6].

Схематичное представление метода FAIRE

Далее в зависимости от метода анализа полученных участков ДНК выделяют FAIRE-seq (высокопроизводительное секвенирование фрагментов ДНК, например используя Illumina), FAIRE-chip (гибридизация флуоресцентномеченных фрагметов ДНК с ДНК-микрочипами), FAIRE-qPCR (количественный анализ участков ДНК с помощью ПЦР в реальном времени). Сейчас FAIRE-seq почти полностью вытеснил другие способы определения экстрагированных фрагментов ДНК[6].

Анализ данных секвенирования[править | править код]

Для анализа данных секвенирования требуется выравнивать последовательности с референсным геномом, для чего используется, например, Bowtie. Затем производится поиск значимых участков (significant enrichment regions). Для этих целей рекомендуется использование ZINBA. В отличие от FAIRE-chip и FAIRE-qPCR, при использовании FAIRE-seq с достаточной глубиной покрытия генома контрольный образец может отсутствовать[6].

Применение[править | править код]

С помощью FAIRE-seq можно осуществлять поиск целевых промоторов опухолевых факторов, обнаружение и проверку потенциальных участков свободного, не связанного с нуклеосомами, хроматина, идентификацию индуцируемых регуляторных участков генома и описание активных регуляторных элементов генома. Метод также позволяет оценивать вариабельность нуклеотидного состава регуляторных участков в различных популяциях[7].

Применение FAIRE-seq совместно с другими методами, например с DNase-seq, дает более надежный и качественный результат[2].

Преимущества[править | править код]

Для метода FAIRE не требуется предварительной обработки клеток, так как формальдегид добавляется в питательную среду или напрямую к ткани, быстро приводит к клеточной смерти, что позволяет получить хроматин в состоянии, предшествующем фиксации. При этом разное время фиксации формальдегидом при постоянной концентрации дает одинаковый результат. В отличие от ChIP[8], метод не зависит от надежности и вариабельности антител. Кроме того, FAIRE не требует использования ферментов, таких как DNase или MNase, которые обычно используются в аналогичных методах для обнаружения областей, свободных от нуклеосом. Отсутствие ферментативной обработки делает этот метод менее вариабельным, более надежным и воспроизводимым[6].

FAIRE легко адаптируется для использования на образцах тканей, потому что FAIRE не требует одноклеточной суспензии или ядерной изоляции. В этом случае единственным дополнительным шагом является измельчение замороженной ткани в крупный порошок перед фиксацией[6].

С помощью FAIRE можно выявлять дистальные регуляторные элементы, расположенные далеко от промотеров (например, транскрипционные энхансеры), которые не находятся DNase-seq[2].

Ограничения[править | править код]

Несмотря на простоту экспериментальной части, для FAIRE-seq, как и для других методов, связанных с обширным секвенированием, необходимо значительное количество вычислительных ресурсов и памяти для интерпретации результатов. В этом плане FAIRE-chip и FAIRE-qPCR могут быть привлекательнее[6].

По сравнению с DNase-seq и ChIP-seq, FAIRE имеет более низкое отношение сигнал/шум. Поэтому сайты, обнаруженные FAIRE, время от времени могут лишь незначительно отличаться от фонового сигнала, что снижает доверие к идентифицированным сайтам. Этот эффект усугубляется при использовании методов обнаружения, не связанных с секвенированием. Несмотря на низкое отношение сигнал/шум, стоит отметить, что результаты FAIRE имеют хорошую воспроизводимость. Однако обнаружение некоторых промотеров активно экспрессируемых генов осуществляется хуже, чем другими методами, такими как DNase-seq[2].

Эффективность фиксации тканей варьирует в зависимости от её свойств (чистота, проницаемость, плотность клеток, содержание жира и площадь поверхности), что может затруднять сравнение результатов, полученных для разных тканей[6].

Доступность данных[править | править код]

Данные по геному человека, полученные при помощи FAIRE-seq, доступны как часть проекта ENCODE (энциклопедия элементов ДНК) в интерактивном веб-сайте UCSC Genome Browser[en], который предлагает доступ к данным о геномах различных видов позвоночных, беспозвоночных и крупных модельных организмах, интегрированных с большой коллекцией согласованных аннотаций[9].

Примечания[править | править код]

  1. ↑ 1 2 Kyle J. Gaulton, Takao Nammo, Lorenzo Pasquali, Jeremy M. Simon, Paul G. Giresi. A map of open chromatin in human pancreatic islets // Nature Genetics. — March 2010. — Т. 42, вып. 3. — С. 255—259. — ISSN 1546-1718. — doi:10.1038/ng.530. Архивировано 23 июля 2018 года.
  2. ↑ 1 2 3 4 5 Song L., Zhang Z., Grasfeder L. L., Boyle A. P., Giresi P. G., Lee B. K., Sheffield N. C., Gräf S., Huss M., Keefe D., Liu Z., London D., McDaniell R. M., Shibata Y., Showers K. A., Simon J. M., Vales T., Wang T., Winter D., Zhang Z., Clarke N. D., Birney E., Iyer V. R., Crawford G. E., Lieb J. D., Furey T. S. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. (англ.) // Genome research. — 2011. — Vol. 21, no. 10. — P. 1757—1767. — doi:10.1101/gr.121541.111. — PMID 21750106. [исправить]
  3. ↑ Nagy P. L., Cleary M. L., Brown P. O., Lieb J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2003. — Vol. 100, no. 11. — P. 6364—6369. — doi:10.1073/pnas.1131966100. — PMID 12750471. [исправить]
  4. ↑ 1 2 Giresi P. G., Kim J., McDaniell R. M., Iyer V. R., Lieb J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. (англ.) // Genome research. — 2007. — Vol. 17, no. 6. — P. 877—885. — doi:10.1101/gr.5533506. — PMID 17179217. [исправить]
  5. ↑ Omidbakhshfard M. A., Winck F. V., Arvidsson S., Riaño-Pachón D. M., Mueller-Roeber B. A step-by-step protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements from Arabidopsis thaliana. (англ.) // Journal of integrative plant biology. — 2014. — Vol. 56, no. 6. — P. 527—538. — doi:10.1111/jipb.12151. — PMID 24373132. [исправить]
  6. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 Simon J. M., Giresi P. G., Davis I. J., Lieb J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. (англ.) // Nature protocols. — 2012. — Vol. 7, no. 2. — P. 256—267. — doi:10.1038/nprot.2011.444. — PMID 22262007. [исправить]
  7. ↑ Yang C. C., Buck M. J., Chen M. H., Chen Y. F., Lan H. C., Chen J. J., Cheng C., Liu C. C. Discovering chromatin motifs using FAIRE sequencing and the human diploid genome. (англ.) // BMC genomics. — 2013. — Vol. 14. — P. 310. — doi:10.1186/1471-2164-14-310. — PMID 23656909. [исправить]
  8. ↑ Thea A. Egelhofer, Aki Minoda, Sarit Klugman, Kyungjoon Lee, Paulina Kolasinska-Zwierz. An assessment of histone-modification antibody quality // Nature structural & molecular biology. — 2011-1. — Т. 18, вып. 1. — С. 91—93. — ISSN 1545-9993. — doi:10.1038/nsmb.1972. Архивировано 5 апреля 2018 года.
  9. ↑ Laura L. Elnitski, Prachi Shah, R. Travis Moreland, Lowell Umayam, Tyra G. Wolfsberg. The ENCODEdb portal: Simplified access to ENCODE Consortium data (англ.) // Genome Research. — 2007-06-01. — Vol. 17, iss. 6. — P. 954—959. — ISSN 1549-5469 1088-9051, 1549-5469. — doi:10.1101/gr.5582207. Архивировано 11 июня 2018 года.
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=FAIRE-Seq&oldid=122158417