Просмотр кода страницы Метод Illumina/Solexa

'''Метод Illumina/Solexa''' — метод [[Методы секвенирования нового поколения|секвенирования нового поколения]], разработанный компанией [[Illumina|Solexa]].

В основе метода лежит принцип [[Секвенирование|секвенирования]] путём синтеза<ref>Carl W Fuller. The challenges of sequencing by synthesis. {{doi|10.1038/nbt.1585}}</ref>:
* Одноцепочечные фрагменты [[ДНК]] закрепляются на твердой подложке.
* [[ДНК-полимераза|ДНК-зависимая ДНК-полимераза]] синтезирует [[Комплементарность (биология)|комплементарную]] цепь.
* Встраивание каждого нового [[нуклеотид]]а регистрируется с помощью камеры.

В методе Solexa используются 3'-модифицированные [[нуклеотид]]ы с присоединенными [[Флюорофор|флюоресцентными метками]] разных цветов. Модификация нуклеотидов не позволяет ДНК-полимеразе присоединить больше одного нуклеотида. [[Флюоресценция]] инициируется коротким импульсом лазера и тип присоединенного нуклеотида определяется по цвету флюоресцентной метки. Модификация нуклеотида блокируется (полимераза теперь может двигаться дальше) и цикл повторяется снова<ref>Jay Shendure & Hanlee Ji. Next-generation DNA sequencing. {{doi|10.1038/nbt1486}}</ref><ref>Nicole Rusk, Veronique Kiermer. Primer: Sequencing—the next generation. Nature methods, 2008. {{doi|10.1038/nmeth1155}}.</ref>. В результате удается определить последовательность ДНК длиной до 250 нуклеотидов. Такую последовательность ДНК называют прочтением или ридом (калька с английского).

Первый секвенатор Genome Analyzer 1G был представлен компанией Solexa в [[2006 год]]у. Длина прочтения составляла 30-35 нуклеотида, можно было получить около 1 Gb информации. HiSeq 2000 ([[2011 год]]) способен секвенировать 6 человеческих геномов за 11 дней. Длина прочтения составляет 100 нуклеотидов, можно получить 600 Gb информации<ref name=autogenerated1>Elaine R. Mardis. Next-Generation Sequencing Platforms. Annu. Rev. Anal. Chem. 2013. 6:287-303. {{doi|10.1146/annurev-anchem-062012-092628}}</ref>.

== Принцип метода<ref>David R. Bentley et. al. Accurate Whole Human Genome Sequencing using Reversible Terminator Chemistry. Nature. 2008 November 6; 456(7218): 53-59. {{doi|10.1038/nature07517}}</ref><ref>Illumina sequencing technology. 2010. http://www.illumina.com/ {{Wayback|url=http://www.illumina.com/ |date=20170315024356 }}</ref> ==

=== Подготовка ДНК ===
(про подготовку РНК смотри ниже: [[#Варианты секвенирования|Варианты секвенирования]])

# Исследуемая двуцепочечная ДНК фрагментируется.
# К двуцепочечным фрагментам с помощью [[Лигаза|ДНК-лигазы]] пришивается небольшой ДНК-фрагмент — адаптер. Адаптер состоит из двух [[олигонуклеотид]]ов, частично [[Комплементарность (биология)|комплементарных]] друг другу. При смешении таких олигонуклеотидов образуется «вилка», «ножка» которой состоит из двуцепочечной ДНК (там где олигонуклеотиды комплементарны), две «ручки» состоят из одноцепочечной ДНК. Лигаза пришивает два адаптера за «ножку» к каждому концу исследуемого фрагмента ДНК.
# Далее происходит [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификация]] полученных фрагментов ДНК с помощью [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]]. В результате образуется множество фрагментов двуцепочечной ДНК, на одном конце — первый олигонуклеотид, составляющий адаптер, на другом конце — второй.

=== Подготовка ячейки (flowcell) ===
Ячейка содержит внутри 8 дорожек. В каждой дорожке может секвенироваться отдельный образец.

# На поверхность каждой дорожки пришиваются одноцепочечные олигонуклеотиды. Такие же, что использовались при создании адаптера. Эти олигонуклеотиды в будущем будут связывать исследуемую ДНК (так как они комплементарны адаптеру) и служить [[праймер]]ами для мостиковой амплификации. В одном из олигонуклеотидов есть сайт для [[Рестриктаза|рестриктазы]].

=== Мостиковая амплификация ===
# Производится плавление исследуемой ДНК и уже одноцепочечные её фрагменты отжигаются на закрепленных на подложке праймерах.
# В систему добавляется все необходимое для [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]], кроме праймеров. Праймеры уже есть — это иммобилизованные олигонуклеотиды.
# Полимераза достраивает комплементарную цепь. Теперь каждый исследуемый фрагмент выглядит как двуцепочечная ДНК, конец одной из цепей пришит к поверхности ячейки.
# Проводится [[Денатурация нуклеиновых кислот|плавление]] двуцепочечной ДНК, в результате которого комплементарные цепи ДНК расходятся. Цепь ДНК, которая не была закреплена на поверхности, удаляется. Каждый исследуемый фрагмент представляет собой одноцепочечную ДНК, пришитую к поверхности ячейки.
# Своим незакрепленным концом цепь ДНК может образовать комплементарное взаимодействие со вторым иммобилизованным олигонуклеотидом. Теперь фрагмент расположен в виде «мостика» — один конец пришит к поверхности, другой держится за счет комплементарных взаимодействий.
# Полимераза снова достраивает комплементарную цепь, используя в качестве праймера второй олигонуклеотид.
# После плавления и удаления незакрепленных цепей ДНК фрагмент выглядит как две одноцепочечные ДНК, прикрепленные к поверхности. Одна цепь расположена «вверх ногами» относительно прикрепленной ДНК в пункте 1. Свободный конец каждой из цепей может образовать мостик с иммобилизованным олигонуклеотидом. Далее повторяются пункты 6 и 7.
# После амплификации вокруг каждого закрепленного фрагмента появляется большое количество его копий. Половина из копий расположена «вверх ногами». Добавляется рестриктаза, которая расщепляет один из прикрепленных олигонуклеотидов — ненужные копии вымываются. Теперь все копии ДНК, получившиеся в результате амплификации из начального фрагмента, расположены одинаково.

=== Секвенирование ===
[[ДНК-полимераза|ДНК-зависимая ДНК-полимераза]] синтезирует [[Комплементарность (биология)|комплементарную]] цепь.
Встраивание каждого нового [[нуклеотид]]а регистрируется с помощью камеры.
[[Файл:Solexa nucleotide modification.jpg|thumb|3′-O-azidomethyl 2′-deoxynucleoside triphosphate]]
# В систему добавляются праймеры и ДНК-полимераза.
# В систему добавляются 3′-O-азидометил 2′-деоксинуклеозид трифосфаты (A, C, G и T), каждый с отделяемой [[Флюорофор|флюоресцентной меткой]] своего цвета. Наличие 3′-O-азидометила не позволяет ДНК-полимеразе присоединить больше одного нуклеотида.
# Полимераза присоединяет один модифицированный нуклеотид, оставшиеся нуклеотиды вымываются.
# Ячейка освещается коротким импульсом лазера. Присоединенный [[флюорофор]] светится своим цветом. Так как после амплификации вокруг каждой молекулы ДНК есть множество её копий, свет множества одинаковых флюорофоров можно зарегистрировать.
# В систему добавляется вещество (TCEP), из-за которого флюорофор и азидометил отделяются и вымываются. 3′-[[Гидроксильная группа|гидроксильная]] группа становится доступной для присоединения ещё одного нуклеотида.
# Повторяются пункты 2-5.

== Варианты секвенирования ==
Возможны несколько вариантов секвенирования:
* ''Секвенирование одиночных прочтений ({{lang-en|Single-read sequencing}})''. Данный метод позволяет секвенировать до 8 различных образцов в одной ячейке. За один прогон получается до 100 миллионов прочтений длиной 75 нуклеотидов.
* ''Секвенирование парных прочтений ({{lang-en|Paired-end Sequencing}})''. Позволяет секвенировать два конца длинного фрагмента ДНК; если использовать короткие фрагменты — то будет секвенирована и прямая, и обратная цепь, что повышает точность секвенирования. За один прогон получается до 200 миллионов прочтений длиной 75 пар оснований. <br /> ДНК фрагментируют на участки длиной по 200—500 нуклеотидов. К концам ДНК пришивают '''два''' вида адаптеров, так чтобы к разным концам одного фрагмента ДНК были присоединены разные адаптеры. После мостиковой амплификации противоположно ориентированные копии исходного фрагмента '''не''' удаляются. В систему добавляется праймер к одному виду адаптера и секвенируется прямую цепь ДНК. Затем добавляется праймер ко второму адаптеру и секвенируют комплементарную цепь.
* ''Множественное (мультиплексное) секвенирование ({{lang-en|Multiplex Sequencing}})''. Позволяет одновременно секвенировать до 12 различных образцов на одной дорожке и до 96 образцов в одной ячейке ({{lang-en|flowcell}}). При подготовке ДНК, кроме стандартного адаптера, к образцу пришивается ещё последовательность-индекс. Удобно для одновременного секвенирования небольших геномов.
* ''[[Секвенирование спаренных концов]] ({{lang-en|Mate Pair Sequencing}})''. Позволяет секвенировать две последовательности, изначально располагающиеся в геноме на расстоянии до 5000 нуклеотидов друг от друга, как единое целое. Такой подход может быть полезен при ''de novo'' секвенировании, при поиске [[SNP|мутаций]], для корректной [[Сборка генома|сборки генома]].
* ''[[Секвенирование РНК]]''. Секвенирование [[РНК]] отличается от секвенирования ДНК на стадии подготовки образцов. Если требуется секвенировать только [[мРНК]], то мРНК выделяют по наличию поли-А. Если необходимо секвенировать как мРНК, так и [[некодирующие РНК]], то сначала из клетки выделяют все РНК, а затем [[рРНК]] удаляют химическим путём. <br /> РНК фрагментируют на участки по 100—200 нуклеотидов. На матрице РНК с помощью [[Обратная транскриптаза|обратной транскриптазы]] синтезируют комплементарную цепь ДНК ([[кДНК]]). На матрице полученной ДНК синтезируют комплементарную цепь ДНК. Дальше процесс секвенирования РНК совпадает с секвенированием ДНК — лигируют адаптеры, и отжигают на закрепленных на подложке праймерах.

С помощью Illumina/Solexa можно как определять последовательность [[мРНК]], так и анализировать полный [[транскриптом]] клетки. С помощью РНК-секвенирования можно изучать [[альтернативный сплайсинг]], [[Импринтинг генов|аллель-зависимую экспрессию генов]] или искать новые [[транскрипт]]ы.

== Существующие системы ==
Первым секвенатором, выпущенным компанией Illumina, был Genome Analyzer 1G. На данный момент{{когда}} существует несколько моделей. Genome Analyzer IIx — самый популярный секвенатор нового поколения. HiScanSQ — совмещает в себе секвенатор и анализатор для работы с микрочипами. HiSeq 2500 и HiSeq 1500 могут запускаться в двух разных режимах: высокопроизводительное секвенирование (много коротких прочтений по 100 нуклеотидов) и быстрое секвенирование (мало длинных прочтений по 150 нуклеотидов).

{| class="wikitable"
|-
! !! HiSeq 2500/2000 !! HiSeq 1500/1000 !! HiScanSQ !! Genome Analyzer IIx !! MiSeq
|-
| Время работы || 11 дней || 8,5 дней || 8,5 дней || 14 дней || 39 часов
|-
| Длина прочтений || 100 bp || 100 bp || 100 bp || 150 bp || 250 bp
|-
| Количество прочтений || 6 млрд || 3 млрд || 1,5 млрд|| 640 млн || 34 млн
|-
| Качество секвенирования Q30|| >80 %|| >80 % || >80 % || >70 % || >70 %
|}
Качество секвенирования Q30 означает процент нуклеотидов, для которых вероятность быть ошибочно определенными меньше 0,001.

== Преимущества и недостатки метода ==
По сравнению с другими методами секвенирования нового поколения метод Illumina наиболее высокопроизводительный — 600 Gb за одно прочтение. Следовательно, стоимость секвенирования на 1 Gb информации будет небольшая. К положительным особенностям можно отнести и точность при небольшой длине прочтения<ref>Michael A Quail. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics 2012, 13:341</ref><ref>Michael L. Metzker. Sequencing technologies — the next generation. 2010. [[Nature Genetics]].</ref>.

Большинство возникающих ошибок секвенирования — неправильное определение присоединенного нуклеотида. Средняя частота ошибок составляет 0,5 % — одна ошибка на прочтение длиной 200 нуклеотидов<ref name=autogenerated1 />. К недостаткам можно отнести высокую стоимость приборов и небольшую длину прочтений (до 250 нуклеотидов).

== См. также ==
* [[Методы секвенирования нового поколения]]
* [[Полимеразная цепная реакция]]

== Примечания ==
{{примечания}}

[[Категория:Методы молекулярной биологии]]
[[Категория:Секвенирование]]
[[Категория:Биоинформатика]]