Иммунохроматографический анализ

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схема тест-полоски.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) — иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет.

ЛФТ работают по тем же принципам, что и иммуноферментный анализ (ELISA). По сути, эти тесты проводят жидким образцом по поверхности планшета с реактивными молекулами, которые показывают визуальный положительный или отрицательный результат. В основе планшетов лежит ряд капилляров, например, кусочки пористой бумаги, микроструктурированного полимера или спеченного полимера. Каждая из этих подушечек способна самопроизвольно транспортировать жидкость (например, мочу, кровь, слюну).

Прокладка для образца действует как губка и удерживает избыток жидкости для образца. После впитывания жидкость перетекает во вторую конъюгатную подушечку, в которой производитель хранит сублимированные высушенные биологически активные частицы, называемые конъюгатами (см. ниже), в соляно-сахарной матрице. Конъюгат содержит все реагенты, необходимые для оптимизированной химической реакции между целевой молекулой (например, антигеном) и ее химическим партнером (например, антителом), который был иммобилизован на поверхности частицы. Это маркирует частицы-мишени, когда они проходят через планшет и попадают на тестовую и контрольную линии. На тестовой линии появляется сигнал, часто цветной, как в тестах на беременность. Контрольная линия содержит аффинные лиганды, которые показывают, прошел ли образец и активны ли биомолекулы в конъюгате. После прохождения этих реакционных зон жидкость попадает в конечный пористый материал - фитиль, который служит просто контейнером для отходов.

LFT могут работать как конкурентные или сэндвич-анализы.

Сущность метода[править | править код]

Принцип действия состоит в том, что при погружении тест-полоски в биологическую жидкость (или другой жидкий образец), она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом.

Различают 2 формата ИХА: прямой и конкурентный метод.

  1. В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат антитела-метка, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии — антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. Избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2 линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.
    Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений — вирусов, в том числе ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.
  2. Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит: белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат аналит: белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце, конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг: белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота его и легкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в том числе «полевых».

Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.

Метки, используемые в ИХА[править | править код]

В качестве меток в ИХА используются различные частицы, обладающие следующими свойствами:

  1. Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мильтианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота.
  2. Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.
  3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.
  4. Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.
  5. Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.).

Количественные тесты[править | править код]

Большинство ЛФТ предназначены для работы исключительно на качественной основе. Однако можно измерить интенсивность тестовой линии, чтобы определить количество аналита в образце. Для получения полностью количественных результатов анализа некоторые компании используют портативные диагностические устройства, известные как считыватели бокового потока. Благодаря использованию уникальных длин волн света для освещения в сочетании с технологией детектирования CMOS или CCD можно получить насыщенное сигналом изображение фактических тестовых линий. Используя алгоритмы обработки изображений, специально разработанные для конкретного типа теста и среды, интенсивность линий может быть соотнесена с концентрацией аналита. Одна из таких портативных платформ для устройств бокового потока производится компанией Detekt Biomedical L.L.C.. Альтернативные неоптические методы также способны сообщать о результатах количественного анализа. Один из таких примеров - магнитный иммуноанализ (MIA) в форме LFT также позволяет получить количественный результат. Уменьшение вариаций в капиллярной прокачке жидкости образца - еще один подход к переходу от качественных результатов к количественным. Недавние работы, например, продемонстрировали капиллярную откачку с постоянной скоростью потока, не зависящей от вязкости жидкости и поверхностной энергии.

Мобильные телефоны продемонстрировали большой потенциал для количественной оценки в анализах бокового потока, используя не только камеру устройства, но и датчик света или энергию, поставляемую батареей мобильного телефона.

Контрольная линия[править | править код]

Хотя это не является строго необходимым, большинство анализов включают вторую линию, содержащую антитело, которое улавливает свободный латекс или золото, чтобы подтвердить правильность работы теста.

Выделение плазмы крови[править | править код]

Поскольку интенсивный красный цвет гемоглобина мешает считыванию данных колориметрических или оптических диагностических тестов, отделение плазмы крови является обычным первым шагом для повышения точности диагностических тестов. Плазма может быть выделена из цельной крови через встроенные фильтры или путем агглютинации.

Скорость и простота[править | править код]

Время получения результата теста является ключевым фактором для этих продуктов. Разработка тестов может занимать всего несколько минут. Как правило, существует компромисс между временем и чувствительностью: более чувствительные тесты могут требовать больше времени на разработку. Другим ключевым преимуществом данного формата теста по сравнению с другими иммуноферментными анализами является простота теста, поскольку он обычно не требует или почти не требует подготовки образца или реагента.

Патенты[править | править код]

Это высококонкурентная область, и несколько человек претендуют на патенты в этой области, в первую очередь Alere (бывшая Inverness Medical Innovations, ныне принадлежащая Abbott), которая владеет патентами, первоначально поданными Unipath. Группа конкурентов оспаривает действительность этих патентов. Ряд других компаний также владеют патентами в этой области.

Применение[править | править код]

Анализы бокового потока имеют широкий спектр применения и могут тестировать различные образцы, такие как моча, кровь, слюна, пот, сыворотка и другие жидкости. В настоящее время они используются клиническими лабораториями, больницами и врачами для быстрого и точного тестирования специфических целевых молекул и экспрессии генов. Другие области применения анализа бокового потока - безопасность пищевых продуктов и окружающей среды, а также ветеринария для выявления химических веществ, таких как болезни и токсины. LFT также широко используются для идентификации заболеваний, таких как эбола, но наиболее распространенным LFT является домашний тест на беременность.

Тестирование на COVID-19[править | править код]

Анализы бокового потока сыграли решающую роль в тестировании COVID-19, поскольку их преимущество заключается в получении результата через 15-30 минут. Систематическая оценка анализа бокового потока во время пандемии COVID-19 была начата в Оксфордском университете в рамках сотрудничества Великобритании с Public Health England. Исследование FALCON-C19, которое началось в июне 2020 года в Великобритании, подтвердило чувствительность некоторых устройств латерального потока (LFD) в этих условиях. Четыре из 64 протестированных ЛФД имели желаемые характеристики; в частности, быстрый качественный тест на антиген SARS-CoV-2 Innova прошел расширенную клиническую оценку в полевых исследованиях и показал хорошую чувствительность к обнаружению вирусного антигена и отличную специфичность, хотя потенциальными проблемами являются частота отказов комплектов и влияние обучения. После проведения оценки правительство Великобритании приняло решение в январе 2021 года открыть средние школы в Англии, в которых ученики и учителя будут ежедневно сдавать анализы на ЛФТ, что стало частью так называемой "операции Moonshot". Однако 19 января 2021 года MHRA не разрешило проведение ежедневных быстрых тестов в качестве альтернативы самоизоляции.

ЛФТ использовались для массового тестирования на COVID-19 во всем мире и дополняют другие меры общественного здравоохранения в отношении COVID-19.

Некоторые ученые за пределами правительства выразили серьезные сомнения по поводу использования ЛФД Innova для скрининга на Ковид. По мнению Джона Дикса, профессора биостатистики Бирмингемского университета (Англия), тест Innova "совершенно непригоден" для тестирования населения: "поскольку тест может пропустить до половины случаев, отрицательный результат теста указывает на снижение риска Ковида, но не исключает Ковид". После критики со стороны экспертов и отсутствия разрешения регулирующего органа правительство Великобритании "приостановило" проведение ежедневных LFT в английских школах в середине января 2021 года.

История[править | править код]

ЛФТ происходит от бумажной хроматографии, которая была разработана в 1943 году Мартином и Синджем[1], а в 1944 году Консденом, Гордоном и Мартином.[2][3] После 1945 года в этой области наблюдался бурный рост активности.[1]

Литература[править | править код]

  • Raphael C. Wong l Harley Y. Tse (Editors) Lateral Flow Immunoassay. Springer, USA, 2009.

Примечания[править | править код]

  1. 1 2 Haslam E (2007). “Vegetable tannins - lessons of a phytochemical lifetime”. Phytochemistry. 68 (22—24): 2713—21. DOI:10.1016/j.phytochem.2007.09.009. PMID 18037145.
  2. Consden R, Gordon AH, Martin AJ (1944). “Qualitative analysis of proteins: a partition chromatographic method using paper”. The Biochemical Journal. 38 (3): 224—32. DOI:10.1042/bj0380224. PMC 1258072. PMID 16747784.
  3. Paper chromatography | chemistry (англ.), Encyclopedia Britannica.

Ссылки[править | править код]