Метод ДНК-комет

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Внешний вид и ранжирование ДНК-комет:
Ранжирование ДНК-комет.png

Пять условных типов ДНК-комет, которые учитываются при анализе степени поврежденности ДНК

Метод ДНК-комет — это метод регистрации повреждения ДНК и изучения репарации на уровне одиночных клеток. Метод способен выявлять разрывы нитей ДНК в отдельных клетках. Является быстрым и весьма чувствительным[1].

История[править | править код]

Первым успешным опытом исследования поврежденности ДНК индивидуальных клеток принято считать работу Rydberg и Johanson (1978 г.)[2]. Впоследствии метод неоднократно модифицировался и усовершенствовался с целью его упрощения и повышения чувствительности выявления повреждений клеточной ДНК[2].

Применимость[править | править код]

Метод ДНК-комет применим в системах in vivo и in vitro. В настоящее время метод широко используется в исследованиях генотоксичности ионизирующего излучения, фармацевтических препаратов и промышленных химических веществ, репарации ДНК, апоптоза, клинических исследованиях по пренатальной диагностике, предрасположенности к онкологическим заболеваниям, терапии при раке, катаракте. Данный метод постепенно становится неотъемлемой частью программ по биомониторингу:

  • оценке влияния пищевого рациона, факторов внешней среды, изменений метаболизма и физиологического состояния, старения организма на накопление и репарацию повреждений ДНК;
  • по изучению механизмов радиопротекторных воздействий, формирования радиоадаптивного ответа;
  • исследований по экологии.

Использование метода позволяет учитывать гетерогенность сложных популяций, изучать выход повреждений ДНК и репарацию практически в любых эукариотических клетках. При этом для анализа необходимо всего несколько тысяч клеток исследуемого образца[1][3].

Постановка метода[править | править код]

Проводится иммобилизация, подвергнутых воздействию изучаемого фактора клеток в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло для микроскопии. Обработка образцов в буфере с высоким содержанием соли приводит к лизису клеточных мембран и экстракции белков. Молекулы ДНК разделяют электрофорезом, треки ДНК визуализируют посредством окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучают микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит к релаксации этой биомакромолекулы, формируются фрагменты ДНК, не связанные с клеткой. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, что и придает наблюдаемым объектам вид «комет» (отсюда и произошло название «comet assay», ставшее общеупотребительным). Количество ДНК, мигрировавшей по направлению к аноду и определяемое микрофотометром, может использоваться в качестве показателя, характеризующего уровень повреждений ДНК в изучаемых клетках. «Кометы» анализируют либо путём визуального наблюдения и дифференциации «комет» по степени поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных программных средств обработки изображений. Последний метод анализа «комет» особенно необходим для объективной оценки влияния небольшой концентрации повреждающего агента, или для выявления незначительных различий между субпопуляциями клеток[1].

Стандартизация метода[править | править код]

В настоящее время большинство лабораторий, внедривших данный методологический подход в исследования, разработали многочисленные вариации протокола, в частности продолжительности и условий лизиса клеток, денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК. Подсчитывают 25-500 клеток на одном стекле в двух повторах. Результаты эксперимента являются достоверными при повторении не менее 6 раз. Анализ ДНК-комет может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса. При визуальном анализе ДНК-кометы ранжируют на пять условных типов с соответствующим числовым значением от 0 до 4.

Расчет индексов[править | править код]

Обозначение Характеристика Расчёт

Индекс ДНК-comet (index of DNA comet)

 — Степень поврежденности ДНК
Индекс ДНК-комет — рассчитывается
как отношение суммы «ДНК—комет» каждого типа,
к общей сумме подсчитанных «ДНК-комет».

, где  — число «ДНК-комет» каждого типа, а
 — сумма подсчитанных «ДНК-комет».

Программы для работы с изображением и анализа[править | править код]

  • CometScore — бесплатная программа для полуавтоматических расчетов показателей ДНК-комет, совместима с Windows 5 и 6.
  • CaspLab — GPL software.
  • Коммерческая программа — listed by Comet Assay Interest Group

См. также[править | править код]

Примечания[править | править код]

  1. 1 2 3 Сорочинская, Михайленко, 2008, с. 303—309.
  2. 1 2 Rydberg B, Johanson KJ. Estimation of DNA strand breaks in single mammalian cells // Academic Press. — New York, 1978. — С. 465—468.
  3. S. Cotelle and J. F. Ferard. Comet Assay in Genetic Ecotoxicology: A Review // Environmental and Molecular Mutagenesis. — Wiley-Liss, 1999. — Т. 34. — С. :246-25. Архивировано 4 марта 2016 года.

Литература[править | править код]