Просмотр отдельных изменений

''''CRISPR''' (от {{lang-en|clustered regularly interspaced short palindromic repeats}} — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами<ref>{{cite web |url=http://biomolecula.ru/content/1498 |title=Биомолекула. CRISPR-системы: иммунизация прокариот}}</ref>) — особые [[локус]]ы [[бактерии|бактерий]] и [[археи|архей]]<ref name="Makarova2011">{{Cite pmid|21552286}}</ref>, состоящие из прямых [[Повторяющиеся последовательности ДНК|повторяющихся последовательностей]], которые разделены уникальными последовательностями ([[Спейсер (биология)|спейсерами]]). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась [[Клетка (биология)|клетка]] ([[бактериофаг]]ов, [[Плазмиды|плазмид]]). [[РНК]], [[Транскрипция (биология)|транскрибирующиеся]] с локусов CRISPR, совместно с ассоциированными [[Белок|белками]] Cas обеспечивают [[адаптивный иммунитет]] за счёт [[Комплементарность (биология)|комплементарного]] связывания РНК с [[Нуклеиновые кислоты|нуклеиновыми кислотами]] чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas. Впрочем, к настоящему моменту имеется немало свидетельств участия CRISPR в процессах, не связанных с [[иммунитет]]ом. Использование {{нп5|Методика CRISPR-Cas|методик CRISPR-Cas|de|CRISPR/Cas-Methode}} для направленного [[Редактирование генома|редактирования]] [[геном]]ов является перспективным направлением в современной [[Генная инженерия|генной инженерии]]. {{на|2016|вр=1}} учёные широко используют подходы, основанные на системах CRISPR-Cas; возможно, в будущем эти подходы будут применять в [[Медицина|медицине]] для лечения [[Наследственные заболевания|наследственных заболеваний]]<ref>{{публикация|статья |автор=Панчин |автор имя=Александр |заглавие=Homo sapiens: работа над ошибками |тип= журн |издание=[[Популярная механика]] |год=2016 |месяц=5 |страницы=38–41 |ссылка=http://www.popmech.ru/magazine/2016/163-issue/ |архив= |архив дата= }}</ref>. Также CRISP-Cas имеет значение для адресной доставки лекарств и их высвобождения при внешнем воздействии — для этого используются материалы, в состав которых входят участки ДНК<ref>{{публикация|статья |язык=en |автор=English |автор имя=Max A. |автор2=Soenksen |автор2 имя=Luis R. |автор3=Gayet |автор3 имя=Raphael V. |автор4=de Puig |автор4 имя=Helena |автор5=Nicolaas M. Angenent-Mari, Angelo S. Mao, Peter Q. Nguyen, James J. Collins |заглавие=Programmable CRISPR-responsive smart materials |тип= J |издание=Science |год=2019 |месяц=08 |день=23 |volume=365 |issue=6455 |pages=780–785 |doi=10.1126/science.aaw5122 |pmid=31439791 }}</ref>. == История изучения == Первый локус CRISPR был обнаружен у бактерии ''[[Escherichia coli]]'' в 1987 году группой [[Япония|японских]] учёных во главе с {{нп5|Исино, Ёсидзуми|Ёсидзуми Исино||Yoshizumi Ishino}}. Они заметили в геноме этой бактерии повторяющиеся элементы, разделённые неповторяющимися последовательностями ([[спейсер (биология)|спейсерами]])<ref>{{cite pmid|3316184}}</ref>; впрочем, учёные не придали своему наблюдению большого значения. Масштабное изучение CRISPR начал [[Испания|испанский]] исследователь {{нп5|Мохика, Франсиско Хуан Мартинес|Франсиско Мохика|es|Francisco Juan Martínez Mojica}}, в 1993 году обнаруживший повторяющиеся последовательности, разделённые промежутками, в геноме археи ''Haloferax mediterranei''. Он обратил внимание, что повторы в геномах этой археи и ''E. coli'' очень похожи по структуре, однако не имеют ничего общего в [[нуклеотидная последовательность|последовательностях нуклеотидов]]. По предположению Мохика, столь похожие по структуре повторы, имеющиеся у систематически весьма далёких групп [[прокариоты|прокариот]], должны выполнять какую-то очень важную функцию. Первоначально он назвал новый класс повторов «короткими повторами, регулярно разделёнными промежутками» ({{lang-en|short regularly spaced repeats, SRSRs}}), однако впоследствии, по его предложению, это название было заменено на «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами» ({{lang-en|clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR}}). Мохика продолжил поиски CRISPR в геномах других микробов, и к 2000 году он обнаружил их у 20 микроорганизмов, в том числе чумной палочки ''[[Yersinia pestis]]'' и других [[патоген]]ов<ref name="history">{{cite pmid|26771483}}</ref>. В 2002 году были открыты ''[[ген]]ы cas'' — гены локусов CRISPR, кодирующие белки Cas<ref>{{cite pmid|11952905}}</ref>. Несмотря на обнаружение систем CRISPR-Cas у самых разнообразных прокариот, о функциях CRISPR практически ничего не было известно вплоть до 2005 года. В 2005 году Мохика и его коллеги опубликовали<ref>{{cite pmid|15791728}}</ref> результаты своих новых исследований, в которых было установлено, что спейсеры соответствуют последовательностям из геномов бактериофагов, а также участкам плазмид. Они также обнаружили, что штаммы ''E. coli'', чьи локусы CRISPR содержат спейсер, соответствующий {{нп5|Бактериофаг P1|фагу Р1|en|P1 phage}}, устойчивы к этому фагу, и сделали вывод о связи локусов CRISPR с [[Приобретённый иммунитет|адаптивным иммунитетом]] прокариот. В том же году появились публикации<ref>{{cite pmid|15758212}}</ref><ref>{{cite pmid|16079334}}</ref> ещё двух исследовательских групп, которые пришли к такому же заключению<ref name="history" />. В 2006 году была разработана классификация известных CRISPR и предложен возможный механизм работы основанного на CRISPR адаптивного иммунитета<ref>{{cite pmid|16545108}}</ref>. В 2007 году исследовательской группой во главе с {{нп5|Хорват, Филипп|Филиппом Хорватом||Philippe Horvath}} было окончательно установлено и экспериментально доказано<ref name="history" /> участие CRISPR в обеспечении работы специфичного к последовательностям-мишеням адаптивного иммунитета; одновременно была выявлена ключевая роль белков Cas в этом процессе<ref>{{cite pmid|17379808}}</ref>. За это достижение в 2015 году он был удостоен [[Премия Мэссри|премии Мэссри]] ({{lang-en|Massry Prize}}) вместе с другими учёными, внёсшими значительный вклад в изучение CRISPR ([[Дудна, Дженнифер|Дженнифер Дудна]] и [[Шарпентье, Эммануэль|Эммануэль Шарпентье]])<ref>{{cite web|url=http://www.dupont.com/corporate-functions/media-center/press-releases/dupont-scientist-philippe-horvath-awarded-2015-massry-prize.html |title=DuPont Scientist Philippe Horvath Awarded 2015 Massry Prize}}</ref>. В 2008 году было показано, что для работы системы CRISPR необходима особым образом [[Процессинг РНК|процессированная]] CRISPR-РНК (crРНК), а также была продемонстрирована способность системы CRISPR осуществлять [[ДНК]]-[[РНК-интерференция|интерференцию]]. Интерференция, направляющие РНК и нацеленность против специфических последовательностей ДНК — три открытия 2007—2008 годов, которые положили начало развитию основанных на CRISPR методов [[Генетическая инженерия|генетической инженерии]]<ref name="br1" />. Ряд последующих важных открытий, касающихся устройства систем CRISPR типа II (в частности, выяснение необходимости для её работы белка [[Cas9]] и дополнительной — помимо crРНК — малой РНК, названной tracrРНК), позволил в 2012 году экспериментально опробовать первую искусственно разработанную систему CRISPR типа II. В начале 2013 года (с интервалом около двух недель друг от друга) несколько групп показали, что искусственные системы CRISPR-Cas могут работать не только в клетках бактерий и ''[[in vitro]]'', но и в клетках [[Эукариоты|эукариот]]<ref name="br1" />. Последующие два с половиной года происходила разработка методов CRISPR и применение этого метода в различных группах [[организм]]ов. В апреле 2015 года группа учёных из Китая опубликовала результаты своего исследования, в котором с помощью CRISPR-Cas9 были отредактированы геномы [[Человек|человеческих]] эмбрионов<ref name="human"/>. Однако точность редактирования в этом эксперименте была очень низка<ref name="human">{{cite pmid|25894090}}</ref>, а сам эксперимент был неоднозначно воспринят научным сообществом<ref>{{cite doi|10.1038/nature.2015.18947|noedit}}</ref>. В начале 2016 года учёные из США сообщили, что смогли понизить количество ошибок при работе CRISPR-Cas9 почти до нуля<ref name="zero">{{cite pmid|26628643}}</ref>. К настоящему моменту CRISPR считают наиболее важным технологическим новшеством в науках о жизни со времён изобретения [[Полимеразная цепная реакция|полимеразной цепной реакции]] (ПЦР), открытой тремя десятилетиями ранее<ref name="br1">{{cite pmid|26078042}}</ref>. == Общие принципы == [[Файл:SimpleCRISPR_-_ru.jpg|thumb|350px|Упрощённая схема строения CRISPR]] Системы CRISPR-Cas различаются как структурно, так и функционально. Тем не менее, всем системам CRISPR-Cas присущ ряд общих черт<ref name="br1" />. Локусы CRISPR могут выполнять функцию иммунитета только при наличии генов ''cas'', которые обычно располагаются в непосредственной близости от CRISPR. Набор генов ''cas'' определяет тип системы CRISPR-Cas. Локусы CRISPR представлены короткими (обычно около 30—40 [[нуклеотид]]ов длиной) прямыми повторами, которые отделяются друг от друга неповторяющимися спейсерами, произошедшими из ДНК тех чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка или её предшественники. Длина спейсеров обычно сопоставима с длиной повторов. Перед рядом повторов и спейсеров располагается лидерная последовательность, содержащая, как правило, [[промотор]], с которого начинается однонаправленная транскрипция повторов и спейсеров CRISPR. Спейсеры полностью интегрированы в геном клетки и передаются её потомкам при [[Деление клетки|делении]]<ref name="br1" />. Стоит отметить, что у бактерий интеграция новых спейсеров в геном сочетается с утратой избыточных и чужеродных генов; поэтому бактериям удаётся избежать значительного увеличения размера генома — в отличие от высших [[эукариоты|эукариот]], у которых повторяющиеся последовательности, произошедшие из экзогенных генетических элементов, составляют существенную часть генома<ref name="b15" />. Кроме структурного сходства, различные системы CRISPR-Cas объединяют три ключевых этапа работы CRISPR-опосредованного иммунитета: ''приобретение'' ({{lang-en|acquisition}}), или ''адаптация'' ({{lang-en|adaptation}})<ref name="b15">{{cite pmid|25574773}}</ref>, ''экспрессия'' ({{lang-en|expression}}) и ''интерференция'' ({{lang-en|interference}}). На этапе приобретения в CRISPR встраивается новый спейсер, образованный из инородного генетического элемента, проникшего в клетку. На стадии экспрессии происходят транскрипция CRISPR и процессинг коротких CRISPR-РНК (crРНК), нацеленных на определённую мишень. В ходе интерференции рибонуклеопротеиновый комплекс crРНК-Cas распознаёт нуклеиновую кислоту-мишень за счёт комплементарного [[Спаренные основания|спаривания оснований]] мишени с crРНК, после чего разрезает мишень благодаря [[Эндонуклеазы|эндо]]- и/или [[Экзонуклеазы|экзонуклеазной]] активности белков Cas<ref name="br1" /><ref name="Nemudry">{{статья|автор=Немудрый А. А., Валетдинова К. Р., Медведев С. П., Закиян С. М. |заглавие=Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas — инструменты открытий|ссылка=http://cyberleninka.ru/article/n/sistemy-redaktirovaniya-genomov-talen-i-crispr-cas-instrumenty-otkrytiy|издание=[[Acta Naturae]]|год=2014|номер=3 (22)|страницы=20—42}}</ref>. Интересно, что работа систем CRISPR-Cas имеет много общих принципиальных моментов с работой [[Иммунная система|иммунной системы]] [[Млекопитающие|млекопитающих]]. Так, [[Иммунизация|иммунизацию]] CRISPR (то есть вставку нового спейсера) может вызвать даже дефектный бактериофаг — подобно тому, как [[иммунный ответ]] млекопитающих может развиться и при введении убитого патогена<ref name="b15" />. Системы CRISPR-Cas могут передаваться от микроорганизма к микроорганизму с помощью [[Горизонтальный перенос генов|горизонтального переноса генов]]. Стоит отметить, что противодействие вторжению в бактерию чужеродных генетических элементов не всегда оказывается полезным для бактерии. Например, у бактерии ''{{нп5|Staphylococcus epidermidis|||Staphylococcus epidermidis}}'' может наблюдаться снижение устойчивости к [[антибиотик]]ам, обусловленное уничтожением системой CRISPR-Cas тех [[Конъюгация у бактерий|конъюгативных]] плазмид, которые обеспечивали эту устойчивость. У ''[[Staphylococcus aureus]]'' пониженное количество локусов CRISPR приводит к увеличению числа [[профаг]]ов, плазмид и мобильных генетических элементов в клетке, что усиливает [[вирулентность]] бактерии. Впрочем, локусы CRISPR-Cas, препятствующие распространению полезных в данных условиях мобильных генетических элементов, могут исчезать<ref name="b15" /><ref>{{cite pmid|24086164}}</ref>. === Приобретение спейсеров === Поскольку опосредованный CRISPR [[приобретённый иммунитет]] закодирован в ДНК, процесс [[Вакцина|иммунизации]] включает копирование и вставку чужеродных генетических элементов в CRISPR в качестве новых спейсеров. Спейсеры составляют иммунологическую память, в которой хранится информация о прошлых [[инфекция]]х, и именно она лежит в основе ответа на повторное вторжение сходных генетических элементов. Большая часть данных о молекулярных механизмах приобретения новых спейсеров получена при изучении системы CRISPR I типа ''Escherichia coli'' и II типа ''{{нп5|Streptococcus thermophilus||en|Streptococcus thermophilus}}''. Правильная ориентация и вставка нового спейсера происходит при участии последовательности, расположенной непосредственно выше первого повтора; таким образом, новые спейсеры добавляются к 5'-концу локуса CRISPR. Интеграция нового спейсера в промежуток между лидерной последовательностью и первым повтором осуществляется комплексом Cas1-Cas2-протоспейсер. У некоторых систем CRISPR-Cas в этом процессе участвуют дополнительные белки. При вставке нового спейсера происходит дупликация повтора, за счёт чего сохраняется правильная структура локуса, который должен начинаться с повтора<ref name="br1" /><ref name="t">{{cite pmid|26104549}}</ref>. Поскольку спейсеры передаются от предков к потомкам при делении клеток, при наличии схожих спейсеров можно устанавливать [[Филогенетика|филогенетические]] связи между [[штамм]]ами, имеющими общие предковые спейсеры, а также штаммами, имеющими новые, недавно приобретённые спейсеры<ref name="br1" />. У систем I и II типа может происходить вставка спейсера лишь от тех инородных элементов, у которых к протоспейсеру прилегает особая последовательность PAM ({{lang-en|protospacer adjacent motif}} — мотив, смежный с протоспейсером)<ref name="t" />. Кроме того, бактерия должна отличать инородный генетический материал от своего, чтобы не вставить в качестве спейсера фрагмент собственной хромосомы и не нацелить систему CRISPR-Cas на свой геном, что было бы для клетки фатальным. Система CRISPR-Cas I типа ''E. coli'' отличает свою ДНК по наличию {{нп5|Chi-сайт|Chi-сайтов||Chi site}} — 8-нуклеотидных [[Мотив (молекулярная биология)|мотивов]], которые повторяются в её геноме в среднем каждые 5 тысяч пар оснований<ref name="mar">{{cite pmid|26432244}}</ref>. Хотя из одного и того же инородного генетического элемента можно образовать множество спейсеров, в генетическом элементе некоторые мотивы оказываются при выборе будущего спейсера более предпочтительными. Вероятно, такие мотивы были зафиксированы в результате [[естественный отбор|естественного отбора]], связанного с эффективностью работы спейсеров; так, некоторые спейсеры дают начало crРНК, нацеливающим белки Cas и на частично комплементарные последовательности<ref name="br1" />. Стоит отметить, что при столкновении с одним и тем же фагом разные клетки будут вставлять в качестве спейсера несколько отличающиеся фрагменты его генома, так что большие [[популяции]], имеющие большое разнообразие спейсеров против одного и того же фага, оказывают более эффективное сопротивление: если фаг [[Мутации|мутирует]] так, что один из имеющихся в популяции спейсеров станет неэффективен, то другие по-прежнему будут обеспечивать защиту<ref>{{cite pmid|27074511}}</ref>. === Экспрессия и образование crРНК === [[Файл:DNA palindrome.svg|мини|right|350px|Палиндромы в [[ДНК-полимераза|ДНК]]: A. Палиндром, B. Кольцо, C. Стебель]] После интеграции в CRISPR частей чужеродных генетических элементов требуется перевести их в форму, способную нацеливать белки Cas на последовательности-мишени для их распознавания и разрушения. Такой формой служит направляющая crРНК, которая содержит уникальную последовательность, комплементарную определённой мишени. Сначала ряд повторов и спейсеров CRISPR транскрибируется в единый длинный транскрипт — пре-crРНК, который далее разрезается на короткие crРНК. Большинство повторов в CRISPR являются [[Палиндром#В биологии|палиндромами]], поэтому соответствующие им участки пре-crРНК формируют [[Шпилька (биология)|шпильки]]. Во многих случаях именно эти шпильки распознаются белками Cas, [[Процессинг РНК|процессирующими]] пре-crРНК в crРНК<ref name="br1" />. Как правило, транскрипция CRISPR зависит от лидерной последовательности и происходит постоянно, но с низкой скоростью. Однако скорость значительно увеличивается в [[стресс]]овых условиях или при столкновении клетки с фагами, обеспечивая ей быструю и эффективную защиту. [[Промотор]]ные элементы были найдены не только в лидерной последовательности, но и в повторах. Несмотря на то, что за один раз может транскрибироваться весь локус, было показано, что некоторые спейсеры в локусе транскрибируются чаще других — в частности, таковы первые несколько спейсеров, располагающиеся после лидерной последовательности и первого повтора. Действительно, для клетки гораздо более выгодно иметь более сильную защиту от инвазивных элементов, с которыми она сталкивалась в недавнем прошлом, чем от тех, с которыми она встречалась давно<ref name="br1" />. === Интерференция === На стадии интерференции crРНК связываются со своими мишенями за счёт спаривания оснований и, таким образом, направляют [[эндонуклеазы]] Cas на разрезание и разрушение мишени. Формирование комплекса crРНК и белков Cas обеспечивает эндонуклеолитическое разрушение комплементарных crРНК последовательностей НК. Хотя мишенями, в основном, являются двуцепочечные ДНК (дцДНК), некоторые системы CRISPR-Cas могут разрушать комплементарные одноцепочечные РНК (оцРНК). Системы CRISPR-Cas, распознающие дцДНК, требовательны по отношению к соседним с протоспейсером последовательностям: в частности, в системах типов I и II распознаются только мишени, содержащие мотив PAM (требование наличия PAM может служить для защиты от разрезания системой CRISPR-Cas клеточного генома). У систем, работающих с оцРНК, подобных требований нет. После начальной эндонуклеолитической атаки (внесения разрыва в мишень), производимой Cas, дальнейшее разрушение мишени может происходить под действием других [[Нуклеаза|нуклеаз]]<ref name="br1" />. == Разнообразие систем CRISPR-Cas == Все известные системы CRISPR-Cas можно подразделить на два основных класса, 5 типов и 16 подтипов на основании наличия или отсутствия определённых генов ''cas'', строения [[оперон]]а ''cas'', [[Аминокислоты|аминокислотных]] последовательностей белков Cas и механизмов, обеспечивающих работу CRISPR-опосредованного иммунитета<ref name="diver">{{cite pmid|26549499}}</ref><ref name="km">{{cite pmid|25981466}}</ref>. Системы первого класса характеризуются [[Мультибелковый комплекс|мультибелковыми]] эффекторными комплексами (Cascade, Cmr, Csm). К этому классу относятся системы типов I, III и IV. Системы типа I являются наиболее распространёнными CRISPR-Cas-системами. Их мишенями служат дцДНК, содержащие мотив PAM, а разрушение осуществляет [[Эффектор (биология)|эффекторный]] мультибелковый комплекс Cascade, связанный с белком Cas3. Системы типа III часто встречаются у [[археи|архей]] и характеризуются мультибелковыми комплексами Csm и Cmr. Они могут распознавать как ДНК, так и РНК, причём для распознавания ДНК нет необходимости в PAM. В системах этого типа разрушение мишеней осуществляет белок Cas10 вместе с эффекторными нуклеазами, а именно Cmr4 у подтипа IIIA ([[Рибонуклеазы|РНКаза]], входящая в состав комплекса Cmr) и Csm3 у подтипа IIIB (РНКаза, входящая в комплекс Csm). Системы типа IV довольно редки, их распространение и механизм действия изучены недостаточно<ref name="diver" />. Системы второго класса имеют единственный эффекторный белок. К этому классу относятся типы II и V. Системы типа II активно используются в генной инженерии; для них характерно наличие [[эндонуклеазы]] Cas9. В системах этого типа направляющей РНК выступает не одна crРНК, а дуплекс crРНК и дополнительной РНК — tracrРНК. Дуплекс crРНК:tracrРНК направляет {{нп5|Никаза|никазные|en|Nicking enzyme}} [[Домен белка|домены]] RuvC и HNH Cas9 для внесения разрывов с образованием {{нп5|Липкие и тупые концы|тупых концов|en|Sticky and blunt ends}} в ДНК-мишени, которая должна иметь PAM около 3'-конца{{пояснить}}. Системы типа V редки и характеризуются наличием нуклеазы Cpf1, которую crРНК направляет к ДНК-мишени. Эта {{нп5|RuvAB|RuvC|en|Sticky and blunt ends}}-подобная нуклеаза производит разрез на участке, находящемся дистально от 3'-конца PAM. В отличие от Сas9 эта нуклеаза режет дцДНК с образованием не тупых, а липких концов длиной 5 нуклеотидов<ref name="Zetsche">{{статья |автор=Zetsche B. et al. |заглавие=Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system |ссылка=http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(15)01200-3 |язык= en|издание=Cell |тип= |год=2015 |месяц= |число= |том=163 |номер=3 |страницы= 759—771|doi= |issn=}}</ref>. В таблице ниже перечислены сигнатурные гены изученных систем CRISPR-Cas, а также указаны функции кодируемых ими белков. Наличие определённых сигнатурных генов служит характеристическим признаком типов и подтипов систем CRISPR-Cas. {|class="wikitable" |+ Сигнатурные гены подтипов систем CRISPR-Cas ! Подтип !! Сигнатурные гены !! Функции белковых продуктов<ref name="br1" /><ref name="diver" /><ref name="km" /><ref name="evol" /> |- | I-A || Cas8a2, Csa5 || Cas8a2 участвует в интерференции (связывает crРНК и мишень). Csa5 — малая субъединица эффекторного комплекса |- | I-B || Cas8b || Участвует в интерференции (распознаёт РАМ) |- | I-C || Cas8c || Участвует в интерференции (распознаёт РАМ) |- | I-D || Cas10d || Участвует в интерференции (связывает crРНК и мишень и вносит разрыв в мишень) |- | I-E || Cse1, Cse2 || Cse1, возможно, взаимодействует с Cas3 и рекрутирует его к эффекторному комплексу<ref>{{cite web |url=http://www.uniprot.org/uniprot/Q53VY1 |title=UniProtKB - Q53VY1 (CSE1_THET8)}}</ref>. Cse2 — малая субъединица эффекторного комплекса |- | I-F || Csy1, Csy2, Csy3, Cas6f || Csy2 и, в меньшей степени, Csy1 и Csy3 участвуют в образовании crРНК<ref>{{cite pmid|21398535}}</ref>. Cas6f — [[металл]]-зависимая эндорибонуклеаза, участвующая в образовании crРНК |- | II-A || Csn2 || Участвует в приобретении спейсеров, возможно, защищая хромосомную ДНК от внесения двуцепочечных разрывов |- | II-B || Cas9 || Содержит два эндонуклеазных домена, которые поодиночке вносят одноцепочечные разрывы, а действуя совместно — двуцепочечный разрыв. Участвует в процессинге crРНК, её накоплении, а также разрушении мишени |- | II-C || Неизвестен || — |- | III-A || Csm2 || Малая субъединица эффекторного комплекса |- | III-B || Cmr5 || Малая субъединица эффекторного комплекса |- | IV || Csf1 || Участвует в интерференции (распознает РАМ) |- | V || Cpf1 || Участвует в интерференции (содержит нуклеазный домен) |} === Системы I и III типов === Как упоминалось выше, и системы I типа, и системы III типа используют мультибелковые эффекторные комплексы. Их также объединяет использование белка Cas6 для процессинга пре-crРНК (иногда его заменяет [[ортолог]], Cas5). Эти и некоторые другие сходства между системами типов I и III говорят в пользу их происхождения от общего предка<ref name="br1" />. ==== I тип ==== [[Файл:CRISPR_type_I_system_-_ru.svg|thumb|left|450px|Схема функционирования системы CRISPR-Cas I типа. Несколько белков Cas, в том числе Cas6 (пурпурный) и Cas7 (зелёный), но не Cas1 или Cas2, собираются в комплекс Cascade, связанный с пре-crРНК. Cascade разрезает транскрипт в области повтора на crРНК и остаётся связанным с образовавшейся молекулой crРНК. После связывания Cascade с ДНК-мишенью с ним связывается белок Cas3 (жёлтый) — белок систем I типа. Он производит одноцепочечный разрыв в мишени, отсоединяется от Cascade и движется вдоль ДНК, внося дополнительные разрывы и разрушая её]] Системы типа I подразделяют на шесть подтипов (I-A, I-B, I-C, I-D, I-E, I-F) на основании аминокислотных последовательностей белков эффекторного комплекса и взаимного расположения их генов ([[Синтения|синтении]])<ref>{{cite pmid|26182359}}</ref>. Наиболее изучена система подтипа I-E ''E. coli''<ref name="br1" />. В системах I типа эффекторный комплекс — Cascade — включает Cas6 в качестве интегральной [[Белковая субъединица|субъединицы]], так что процессинг crРНК происходит в пределах эффекторного комплекса, и зрелая crРНК остаётся связанной с ним. После этого комплекс ищет свою последовательность-мишень; при этом он, вероятно, сначала распознаёт её РАМ и лишь после этого проверяет ключевые позиции протоспейсера на [[Комплементарность (биология)|комплементарность]] crРНК. Поскольку в повторах CRISPR нет PAM, геном бактерии, имеющей систему CRISPR-Cas I типа, надёжно защищён от разрушения этой системой. При связывании с Cascade протоспейсер в дцДНК-мишени образует {{нп5|R-петля|R-петлю|en|R-loop}}, для чего необходима отрицательная [[Сверхспирализация ДНК|сверхспирализация]]; вероятно, это облегчает расплетание ДНК, независимое от [[нуклеотидтрифосфат]]ов (НТФ). Комплекс Cascade-протоспейсер распознаётся белком Cas3. Cas3 имеет нуклеазный домен HD, а также расплетающий-транслоцирующий домен, для работы которого необходимы НТФ. Cas3 может расплетать дуплексы ДНК:ДНК и ДНК:РНК. Домен НD, как правило, располагается на [[N-конец|N-конце]] Cas3<ref name="evol">{{cite pmid|26411297}}</ref>. Домен HD вносит одноцепочечный разрыв в мишень вблизи РАМ, после этого Cas3 отделяется от Cascade и использует свой домен гидролиза нуклеозидтрифосфатов для дальнейшего продвижения вдоль ДНК, по пути внося дополнительные одноцепочечные разрывы<ref name="br1" />. Структура Cascade (свободного и связанного с ДНК) ''E. coli'' была визуализирована с около[[атом]]ным [[Разрешение (оптика)|разрешением]]. Мишень распознаётся за счёт [[Спаренные основания|Уотсон—Криковского спаривания оснований]], хотя каждый шестой нуклеотид протоспейсера не комплементарен соответствующему нуклеотиду crРНК. В связи с этим общая геометрия комплекса ДНК с crРНК не соответствует {{нп5|Двойная спираль нуклеиновых кислот|двойной спирали|en|Nucleic acid double helix}}: повторяющиеся полуспиральные витки дуплекса прерываются неспаренными [[Азотистые основания|основаниями]], что позволяет ДНК перегнуться через crРНК, не обвиваясь вокруг неё. Связывание Cascade с мишенью и родственной ей последовательностью имеет разную кинетику и структурные особенности, что позволяет комплексу различать мишень и близкие к ней последовательности. В первом случае следует интерференция и разрушение мишени, а во втором — вставка нового спейсера. Такая направленная адаптация, в отличие от первичной, «наивной» адаптации, требует работы не только белков Cas1 и Cas2, но и Cas3<ref name="br1" />. Помимо 6 подтипов систем I типа (I-A — I-F) известен ещё один подтип, I-U (U от {{lang-en|uncharacterized}} — неохарактеризованный, так как для него неизвестны механизм разрезания пре-crРНК и архитектура эффекторного комплекса). В отличие от большинства систем I типа, у белка Cas3 в I-U домен HD находится на [[C-конец|С-конце]]<ref name="evol" />. ==== III тип ==== [[Файл:The Type I and Type III CRISPR interference pathways - ru.svg|thumb|470px|Система CRISPR-Cas III типа. Пре-crРНК связывается белком Cas6 (пурпурный). На зрелой crРНК собирается комплекс Csm (системы типа III-A) или Cmr (системы III-B), в которые входят белки Cas7 (зелёный) и сигнатурный белок Cas10 (жёлтый)]] Системы III типа подразделяются на два подтипа: III-A и III-B. Для них характерно наличие белка Cas10 — самой крупной субъединицы эффекторного комплекса Csm (в случае подтипа III-A) и Cmr (в случае подтипа III-B). Кроме того, все системы III типа кодируют один белок Cas5 и, как правило, несколько [[паралог]]ичных белков Cas7<ref name="evol" />. Для обоих подтипов характерно использование ортолога Cas6 для процессинга пре-crРНК, хотя процессирующий [[фермент]] не всегда является стабильным компонентом соответствующего эффекторного комплекса (как у систем I типа). В 2008 году было показано, что система III-A ''{{нп5|Staphylococcus epidermidis||en|Staphylococcus epidermidis}}'' работает с ДНК-мишенями, а в 2009 году было установлено, что система III-B ''{{нп5|Pyrococcus furiosus||en|Pyrococcus furiosus}}'' — с РНК. Для успешного распознавания мишеней системам III-A и III-B не требуется наличие мотива РАМ<ref name="br1" />. Дальнейшее изучение систем III типа обнаружило новые загадки [[Субстрат (биохимия)|субстратной]] специфичности подтипов III-A и III-B. Так, выяснилось, что система III-A ''S. epidermidis'' может работать только с транскрибирующимися протоспейсерами. Кроме того, оказалось, что комплексы Csm ''S. thermophilus'' и ''[[Thermus thermophilus]]'' имеют скрытую РНК-деградирующую активность, причём они вносят разрывы в РНК через каждые 6 нуклеотидов. Такая же активность была показана и для комплексов Cmr. Система III-A ''S. epidermidis'' не только разрушает синтезирующиеся транскрипты, но и разрезает ДНК-мишень зависимым от транскрипции образом за счёт специфических аминокислотных [[Остаток (химия)|остатков]] Cas10, которые не связаны с распознаванием мишени. [[Гидролиз]] РНК, опосредуемый комплексами Csm и Cmr, катализируется не белком Cas10, а субъединицами Csm3 и Cmr4, соответственно. Таким образом, система III-A может разрушать как ДНК, так и РНК; предполагается, что хорошо описанная РНК-деградирующая активность систем III-B дополняется способностью разрушать ДНК<ref name="br1" />. Поскольку системы III типа не требуют наличия РАМ у мишеней, в их случае должен существовать другой, нежели у систем I, механизм различения своей дцДНК и чужой. В случае комплекса Csm crРНК комплементарна не только спейсеру CRISPR, но и прилежащему повтору. Таким образом, при связывании с молекулой-мишенью crРНК будет связываться только с протоспейсером, а при связывании с ДНК клетки — ещё и с соседним повтором, на основании чего система III может отличить ДНК клетки от чужеродной. Интересно, что в системах типа III ДНК разрезается очень близко к местам, где соответствующие основания crРНК и ДНК-мишени не спарены. О механизмах приобретения новых спейсеров в системах типа III практически ничего не известно<ref name="br1" />. Кроме обычно выделяемых подтипов III-A и III-B, в 2015 году было предложено выделять также подтипы III-C и III-D, встречающиеся у некоторых архей. В системах типа III-C у белка Cas10 наблюдается инактивация {{нп5|Циклаза|циклазного|en|Cyclase}} домена; кроме того, его аминокислотная последовательность значительно отличается от таковой у Cas10 систем III-A и III-B. В системах III-D у Cas10 отсутствует домен HD; кроме того, имеется уникальный ген ''csx10'', похожий на ''cas5''. И у систем III-C, и у систем III-D отсутствуют гены ''cas1'' и ''cas2''<ref name="evol" />. В феврале 2016 года появились сведения, что у некоторых бактерий с системами CRISPR-Cas III типа (например, морской бактерии ''Marinomonas mediterranea'') вместо обычного белка Cas1 функционирует [[Гибридный белок|химерный белок]] Cas1-RT, сшитый с [[Обратная транскриптаза|обратной транскриптазой]]. Благодаря наличию такого белка бактерия может интегрировать в свой геном спейсеры, образованные от геномов патогенов с РНК-геномами посредством [[Обратная транскрипция|обратной транскрипции]]<ref>{{cite pmid|26917774}}</ref>. Обнаружено, что системы типа III, в частности Cas10, производят циклические олигоаденилатные вторичные мессенджеры, превращая [[АТФ]] в циклический продукт, который аллостерически активирует Csm6, который затем помогает разрушить РНК вируса<ref>Niewoehner O. et al., & Jinek M/ (2017). [https://www.nature.com/nature/journal/vaap/ncurrent/full/nature23467.html Type III CRISPR-Cas systems produce cyclic oligoadenylate second messengers]. Nature {{doi|10.1038/nature23467}}</ref>. === Системы II типа === [[Файл:The_Type_II_CRISPR_interference_pathway_-_ru.svg|thumb|470px|Схема работы системы CRISPR-Cas II типа]] Системы CRISPR-Cas II типа стоят особняком из-за своей необычной генетической основы и молекулярных механизмов. В частности, мультибелковые комплексы, осуществляющие процессинг crРНК в системах типов I и III, в системах типа II заменены единственным белком — Cas9, который принимает участие во всех трёх фундаментальных этапах работы этой системы. Таким образом, системы II типа — наиболее простой тип системы CRISPR-Cas<ref name="evol" />. Более того, в [[биогенез]]е crРНК принимают участие дополнительные элементы, уникальные для систем II типа. Системы II типа встречаются только у бактерий и среди систем типов I, II и III являются самыми малораспространёнными. Тем не менее, именно системы II типа нашли применение в качестве средства для редактирования геномов<ref name="br1" />. Среди систем II типа на основании наличия и последовательностей ассоциированных генов ''cas'' выделяют три подтипа: II-A, II-B и II-C. Помимо генов ''{{нп5|cas1||en|Cas1}}'' и ''cas2'', присущих всем системам типов I—III, системы типа II имеют дополнительный ген ''cas9'', который кодирует эндонуклеазу Cas9. Cas9 принимает участие в приобретении новых спейсеров, накоплении crРНК и интерференции. Помимо этого, системы II-A содержат ген ''csn2'', чей белковый продукт принимает участие в приобретении спейсеров. В системах II-B этот ген заменён геном ''cas4'', а системы II-C не имеют ни ''csn2'', ни ''cas4''. Длина ''Cas9'' варьирует в разных подтипах, причём для систем II-C, как правило, характерны самые короткие [[ортолог]]и<ref name="br1" />. Коровая часть Cas9, которую составляют нуклеазный домен и характерный для этого белка обогащённый [[аргинин]]ом кластер, вероятнее всего, кодируется генами, произошедшими от мобильных генетических элементов, никак не связанных с CRISPR. Принимая во внимание значительное сходство в последовательностях аминокислот между Cas9 и его гомологами, которые не связаны с системами CRISPR-Cas, Cas9 нельзя рассматривать как в полном смысле сигнатурный белок систем II типа. Тем не менее, его можно считать отличительным признаком этих систем<ref name="evol" />. [[Файл:Cas9 Anders DNA bound structure.png|thumb|270px|left|Кристаллическая структура Cas9, связанного с ДНК]] Биогенез crРНК в системах II типа имеет ряд уникальных особенностей. В частности, для него необходим процессинг [[Рибонуклеаза III|РНКазой III]] и связывание с пре-crРНК особых ''транс''-кодируемых CRISPR-РНК (tracrРНК). В составе tracrРНК присутствует участок, комплементарный той области crРНК, которая была транскрибирована с повтора CRISPR. В ходе процессинга crРНК tracrРНК связывается с ещё не вырезанными crРНК в составе пре-crРНК, благодаря чему образуются зрелые crРНК. Получающийся в результате зрелый комплекс crРНК-tracrРНК-Cas9 содержит короткую crРНК, у которой 20—24 нуклеотида комплементарны 3'-концу спейсера и 20—24 нуклеотида комплементарны 5'-концу повтора. Первый этап процессинга пре-crРНК происходит в областях, комплементарных повторам CRISPR; в результате образуется 3'-конец crРНК. Последующая стадия обрезания 5'-конца неизвестными нуклеазами происходит внутри последовательностей, соответствующих спейсерам CRISPR. Для накопления crРНК в клетках необходим белок Cas9, хотя неизвестно, вызвано ли это участием Cas9 в процессинге crРНК или стабилизацией crРНК при помощи Cas9 после процессинга, или же и тем, и другим<ref name="br1" />. Комплекс crРНК-tracrРНК-Cas9 распознаёт ДНК-мишени, комплементарные crРНК и содержащие РАМ. Как и в системах I типа, отсутствие РАМ в локусах CRISPR предохраняет клеточную ДНК от разрезания. Сначала Cas9 распознаёт РАМ, а после этого прилегающая ДНК проверяется на комплементарность crРНК. Разрезание ДНК-мишени осуществляется путём внесения двух одноцепочечных разрывов мотивами RuvC и HNH белка Cas9, в результате чего образуется двуцепочечный разрыв с тупыми концами в ближнем к РАМ конце протоспейсера в R-петле, за три нуклеотида до РАМ<ref name="br1" />. В системах III-C (в частности, в CRISPR-Cas системе ''[[Neisseria meningitidis]]'') был описан альтернативный механизм биогенеза crРНК, который использует промоторы, располагающиеся в повторах CRISPR. Альтернативное направление транскрипции может происходить даже без участия РНКазы III<ref name="br1" />. == Функции вне иммунитета прокариот == Несмотря на то, что функции систем CRISPR-Cas, как правило, связывают с адаптивным иммунитетом [[Прокариоты|прокариот]], имеется немало свидетельств участия этих систем и в совершенно других процессах, не связанных с защитой от чужеродных генетических элементов (например, в регуляции [[Групповая динамика|группового поведения]], [[Вирулентность|вирулентности]], [[Репарация ДНК|репарации ДНК]] и {{нп5|Эволюция генома|эволюции генома|en|Genome evolution}}). Ниже кратко перечислены некоторые известные примеры участия CRISPR-Cas в процессах, не связанных с иммунитетом<ref name="out">{{cite pmid|24704746}}</ref>. <center>'''Функции CRISPR, не связанные с адаптивным иммунитетом'''<ref name="out" /></center> {|class="wide" ! Функция !! Тип системы !! Механизм !! Участие генов ''cas'' !! Участие CRISPR || Вид || Экспериментальное подтверждение |- | Регуляция генов || III-B || Разрушение комплементарной [[мРНК]] || Да || Да || ''Pyrococcus furiosus'' || Нет |- | Гены регуляции<br> группового поведения || I-F <br><br> I-C || На основании<br> частичной комплементарности<br> Неизвестен || Да<br><br> Да || Да<br><br> Неизвестно || ''[[Pseudomonas aeruginosa]]''<br><br> ''[[Myxococcus xanthus]]'' || Да<br><br> Да |- | Гены регуляции <br>вирулентности || II-C<br><br> II-B<br><br><br> II-B<br> CRISPR неизвестного типа || Cas9-зависимая модификация<br> поверхности клеток<br> Cas9-опосредованная отрицательная<br> регуляция образования бактериального [[липопротеин]]а <br> Неизвестен<br> Регуляция оперона ''feoAB''<br> за счёт частичной комплементарности || Да <br><br> Да<br><br> Да<br> Нет || Нет<br><br> Нет<br><br> Нет<br> Да || ''{{нп5|Campylobacter jejuni||en|Campylobacter jejuni}}''<br><br> ''{{нп5|Francisella novicida||en|Francisella novicida}}''<br><br> ''[[Legionella pneumophila]]''<br> ''{{нп5|Listeria monocytogenes||en|Listeria monocytogenes}}'' || Да <br><br> Да<br><br> Да<br> Да |- | Ремоделирование генома || I-F || Удаление участков генома<br> посредством самонацеливания || Да || Да || ''{{нп5|Pectobacterium atrosepticum||en|Pectobacterium atrosepticum}}'' || Да |- | Репарация ДНК || I-E || Репарация ДНК при <br>помощи Cas1 || Да || Нет || ''Escherichia coli'' || Да |- | Конкуренция между<br> мобильными генетическими элементами (МГЭ) || I-F || Специфичное нацеливание на<br> МГЭ-конкурентов || Да || Да || Фаг ICP1 <br>''[[Vibrio cholerae]]'' || Да |- | Покой клеток || Не определён || Cas1 и Cas2 функционируют аналогично <br>[[Система токсин-антитоксин|системам токсин-антитоксин]], <br> запуская покой и последующую смерть <br> клеток при фаговой инфекции || Да || Нет || Не определён || Нет |} [[Файл:Myxococcus xanthus.png|thumb|Плодовые тела ''Myxococcus xanthus'']] Примером может служить система CRISPR-Cas у хищной [[Протеобактерии|дельта-протеобактерии]] ''[[Myxococcus xanthus]]'', повсеместно распространённой в [[Почва|почве]]. Её [[Жизненный цикл (биология)|жизненный цикл]] включает стадии образования [[Плодовое тело|плодового тела]] и споруляции, в ходе которых индивидуальные клетки собираются в агрегаты и дифференцируются в [[миксоспоры]], образуя плодовое тело. Отделяясь, миксоспоры превращаются в отдельные бактериальные клетки, причём этот процесс жёстко регулируется сигналами [[Чувство кворума|чувства кворума]] и [[Передача сигнала (биология)|внутриклеточными сигнальными каскадами]]. Система CRISPR-Cas данной бактерии относится к I-C типу и включает 7 генов Cas и локус CRISPR, содержащий 22 спейсера. При нехватке питательных веществ система запускает [[синтез]] в клетках А-сигнала, состоящего из аминокислот и [[пептид]]ов, который активирует транскрипцию гена ''fruA'' (оперон ''cas'' тоже может активировать этот ген через белок Cas8c). При контакте клеток друг с другом в них образуется С-сигнал, кодируемый геном ''csgA'', который тоже активирует ''fruA'', способствующий затем [[Экспрессия генов|экспрессии генов]] ''cas''. Таким образом, гены ''cas'' входят в состав петли [[Положительная обратная связь|положительной обратной связи]] вместе с геном ''fruA'' и принимают участие в образовании плодового тела и споруляции бактерии<ref name="out" />. Системы CRISPR-Cas могут быть задействованы в регуляции вирулентности у [[патоген]]ных бактерий. Например, у {{нп5|Francisella novicida|''Francisella novicida''||Francisella novicida}} имеется система II типа, состоящая из четырёх генов ''cas'' и обратно ориентированного локуса CRISPR, содержащего 13 спейсеров. Она отрицательно регулирует экспрессию бактериального липопротеина (BLP) — поверхностного фактора вирулентности. Именно он распознаётся [[Толл-подобный рецептор 2|Toll-подобными рецепторами 2]] [[Иммунная система|иммунной системы]] хозяина, поэтому для успешного развития инфекции необходима отрицательная регуляция BLP. Предполагается, что комплекс Cas9, малой crРНК (scaРНК) и tracrРНК связывается с транскриптом ''blp'' и разрушает его по неизвестному механизму. Системы CRISPR-Cas задействованы в регуляции вирулентности у таких бактерий, как ''Campylobacter jejuni'', ''Neisseria meningitidis'', ''Legionella pneumophila'' (в случае этой бактерии в регуляции вирулентности из всех генов ''cas'' участвует только ''cas2''), ''Listeria monocytogenes'' (см. табл.)<ref name="out" />. У многих бактерий системы CRISPR-Cas используются для регуляции собственных генов, не связанных с вирулентностью. В частности, у ''[[Pseudomonas aeruginosa]]'' система типа I-F участвует в регуляции генов, связанных с образованием [[Биоплёнка|биоплёнки]]. Кроме того, имеются предположения, что белки Cas1 и Cas2 могут обеспечивать защиту от бактериофагов, действуя аналогично системам токсин-антитоксин, то есть вызывая покой и последующую гибель инфицированных клеток. Имеются свидетельства участия систем CRISPR-Cas в репарации ДНК. Так, Cas1, входящий в состав системы типа I-E ''E. coli'', может физически взаимодействовать с ферментами репарации и [[Рекомбинация (биология)|рекомбинации]]. [[Делеция]] гена ''cas1'' или ассоциированных локусов CRISPR приводила к усилению чувствительности к агентам, повреждающим ДНК, и нарушениям в разделении хромосом при делении<ref name="out" />. Системы CRISPR-Cas, нацеленные на бактериальную хромосому, могут играть важную роль в геномных перестройках у бактерий и обеспечивать генетические основы [[Эволюция (биологическая)|эволюции]] — несмотря на то, что в большинстве случаев самонацеленные белки Cas приводят к гибели клетки. Было показано, что у бактерии ''Pectobacterium atrosepticum'' crРНК, нацеленные на {{нп5|Геномные островки|хромосомные островки|en|Genomic island}}, приобретённые посредством [[Горизонтальный перенос генов|горизонтального переноса генов]], обычно приводят к гибели клетки, но у некоторых выживших клеток наблюдались масштабные хромосомные делеции, в том числе полное удаление островка-мишени длиной около 100 пар оснований. В этих редких случаях делеции увеличивали общую приспособленность [[мутант]]ов<ref name="out" />. Интересно, что системы CRISPR-Cas имеются не только у прокариот, но также у бактериофагов и ряда других мобильных генетических элементов (МГЭ). Возможно, данное обстоятельство связано с распространением систем CRISPR-Cas у бактерий и архей путём горизонтального переноса генов. Системы CRISPR-Cas таких элементов могут быть нацелены на другие МГЭ, обеспечивая механизмы конкуренции между МГЭ. МГЭ, несущие системы CRISPR-Cas, могут конкурировать с {{нп5|Островки патогенности|островками патогенности|en|Pathogenicity island}} бактерий, которые вырезаются из генома при фаговой инфекции и передаются другим бактериям в [[капсид]]ах фага. Используя фаговые капсиды для собственной передачи, островки патогенности могут полностью блокировать размножение фагов. Примером может служить система CRISPR-Cas фага ICP1 ''Vibrio cholerae'', которая относится к типу I-F и имеет 2 гена ''cas'' и 9 спейсеров (по-видимому, она [[Гомология (биология)|гомологична]] системе ''[[Yersinia pestis]]''). Один из спейсеров комплементарен островку патогенности ''Vibrio cholerae'', так что фаг может конкурировать с островками патогенности за капсиды. Кроме того, система CRISPR-Cas ICP1 может приобретать новые спейсеры, что даёт фагу возможность коэволюционировать вместе с бактерией-хозяином<ref name="out" /><ref>{{cite pmid|23446421}}</ref>. В 2016 году появились сведения о том, что у [[Крупные ядерно-цитоплазматические ДНК-содержащие вирусы|крупных ядерно-цитоплазматических ДНК-содержащих вирусов]] имеется защитная система, напоминающая CRISPR и предназначенная для защиты от [[Вирофаг Спутник|вирофагов]] (в частности, вирофага Zamilon у [[мимивирус]]а). Эта защитная система получила название MIMIVIRE<ref name="mimivire">{{cite pmid|26934229}}</ref>. == Противодействие CRISPR == {{main|Анти-CRISPR}} Установлено, что в ответ на распространение определённых спейсеров CRISPR в популяции бактерий (и, следовательно, распространение устойчивости к соответствующим бактериофагам) бактериофаги усиленно [[Мутации|мутируют]] и даже утрачивают те участки генома, которые наиболее часто служат мишенями систем CRISPR-Cas и интегрируются в бактериальный геном в качестве спейсеров<ref name="b15" />. Некоторые фаги кодируют особые белки (анти-CRISPR белки, Acr), которые мешают работе CRISPR-Cas систем и способствуют развитию инфекции. Анализ фагов ''Pseudomonas aeruginosa'' позволил выделить несколько разновидностей Acr-белков. Первоначально белки Acr были описаны у штаммов ''P. aeruginosa'', несущих [[профаг]]и в своих хромосомах. Хотя у большинства из этих штаммов имелась активная система CRISPR-Cas типа I-F, у некоторых штаммов система оставалось неактивной даже при наличии спейсеров, нацеленных на фаги. Молекулярный анализ штаммов с неактивными системами выявил ряд малых белков, кодируемых фагом, которые были ответственны за развитие чувствительного к фагам [[фенотип]]а. Белки Acr могут подавлять работу систем CRISPR-Cas различными способами, в частности (в случае систем типа I-F) — через связывание с комплексом Cascade и блокирование связывания им ДНК-мишени или через связывание с белками Cas, приводящее к утрате ими нуклеазной активности<ref name="sabotage" />. Известен белок Acr, который препятствует связыванию [[хеликазы]]-нуклеазы Cas3 с уже связавшимся со своей ДНК-мишенью комплексом crРНК и других белков Cas. Поскольку связанный с ДНК комплекс Cas и crРНК не даёт возможности связаться с ДНК транскрипционному аппарату, этот белок Acr превращает комплекс crРНК и Cas в репрессор транскрипции. По состоянию на октябрь 2015 года это — первый известный пример регуляции активности системы CRISPR-Cas при помощи белкового фактора<ref>{{cite pmid|26416740}}</ref>. Белки Acr могут проявлять строгую специфичность относительно системы CRISPR-Cas; в частности, белки, блокировавшие систему I-F ''P. aeruginosa'', не оказывали никакого эффекта на систему I-E ''P. aeruginosa'' или I-F ''E. coli''. Впрочем, некоторые фаги, имеющие гены-супрессоры системы I-F ''P. aeruginosa'', кодировали также небольшие супрессорные белки, подавляющие систему I-E ''P. aeruginosa'', но не I-E ''E. coli''<ref name="sabotage">{{cite pmid|26553202}}</ref>. Появление у фагов защитных механизмов против CRISPR-интерференции считают результатом длительной [[коэволюция|коэволюции]] фагов и их [[хозяин (биология)|хозяев]]<ref name="Nemudry" />. == Эволюционное значение == По мнению [[Кунин, Евгений Викторович|Е. В. Кунина]], работу систем CRISPR-Cas можно рассматривать как эволюционный процесс, удовлетворяющий [[Ламаркизм|эволюционному сценарию Ламарка]], а именно, следующим критериям: * Геномные изменения в локусах CRISPR (вставка новых спейсеров) вызываются воздействием среды (точнее, чужеродных генетических элементов). * Изменения ограничены специфическими геномными локусами. * Изменения обеспечивают адаптацию к конкретному воздействию (к конкретному чужеродному генетическому элементу)<ref name=autogenerated1>{{cite pmid|26411613}}</ref><ref name="кунин">{{книга|автор=Кунин Е. В. |заглавие=Логика случая. О природе и происхождении биологической эволюции|место=М.|издательство=Центрполиграф|год=2014|страниц=527|isbn=978-5-227-04982-7}} — С. 311.</ref>. Впрочем, такой взгляд на CRISPR подвергается критике. По мнению А. Висса, соответствие CRISPR-Cas ламарковским критериям носит лишь поверхностный характер<ref name=autogenerated1 />. Стоит отметить, что системы CRISPR-Cas проявляют некоторые свойства [[Дарвинизм|эволюции по Дарвину]] — в частности, выглядящее на уровне [[популяции]] случайным приобретение спейсеров, вслед за чем следует отбор выживающих клонов с наилучшей [[приспособленность]]ю<ref name="b15" />. == Идентификация == Системы CRISPR-Cas широко распространены среди бактерий и архей<ref>{{cite pmid|24728998}}</ref>, и их характерной чертой является чередование повторяющихся последовательностей и спейсеров. Благодаря этой особенности локусы CRIPSR довольно просто найти в длинных последовательностях ДНК, поскольку с увеличением количества повторов в локусе уменьшается вероятность ложноположительного нахождения. Среди программ, использующихся для поиска CRISPR на основе нахождения в длинных последовательностях повторов, разделённых промежутками, можно назвать CRT<ref>{{cite pmid|17577412}}</ref>, PILER-CR<ref>{{cite pmid|17239253}}</ref> и CRISPRfinder<ref>{{cite pmid|17537822}}</ref>. Нахождение CRISPR в [[Метагеномика|метагеномных данных]] более сложно: при помощи стандартных алгоритмов локусы CRISPR собрать нельзя из-за наличия множества повторов, а также вариаций, специфичных для штамма. Для увеличения количества локусов CRISPR и последующего анализа содержимого спейсеров можно использовать полимеразную цепную реакцию, однако этот метод даёт информацию только о конкретном локусе CRISPR и применим только к организмам, геномы которых доступны в [[База данных|базах данных]] (чтобы можно было создать подходящие [[праймер]]ы)<ref>{{cite pmid|18065539}}</ref><ref>{{cite pmid|21149389}}</ref><ref>{{cite pmid|22583485}}</ref><ref>{{cite pmid|23701169}}</ref><ref>{{cite pmid|20927396}}</ref>. == Применение в генной инженерии == [[Файл:CRISPR transfection - ru.svg|thumb|470px|Принцип использования CRISPR-Cas для редактирования генома]] До открытия функций и механизмов действия систем CRISPR-Cas в качестве методов для локус-специфичного редактирования генома наиболее интенсивно разрабатывались методы, основанные на использовании {{нп5|ZFN|нуклеаз, содержащих цинковые пальцы|en|Zinc finger nuclease}} ({{lang-en|Zinc-finger nucleases, ZFNs}}), а также {{нп5|TALEN|эндонуклеазы TAL|en|Transcription activator-like effector nuclease}} ({{lang-en|Transcription activator-like effector nuclease, TALEN}}). Эти методы довольно трудоёмки, не очень эффективны и дорогостоящи: для каждого нового локуса-мишени требуется разработка, экспрессия и проверка совершенно новой пары [[полипептид]]ов, что значительно ограничивает область применения этих методов<ref name="br1" /><ref name="Vlasov">{{статья|автор=[[Власов, Валентин Викторович|Власов В. В.]], Медведев С. П., Закиян С. М. |заглавие=«Редакторы» геномов. От цинковых пальцев до CRISPR|ссылка=http://cyberleninka.ru/article/n/redaktory-genomov-ot-tsinkovyh-paltsev-do-crispr|издание=Наука из первых рук|год=2014|номер=2 (56)|страницы=44—53}}</ref>. Однако в 2012—2013 годах в генной инженерии появились принципиально новые методы манипулирования генетическим материалом, основанные на применении систем CRISPR-Cas. Данные методы пригодны для целенаправленного редактирования геномов как прокариот, так и эукариот (хотя последние не имеют собственных систем CRISPR-Cas, однако выяснилось, что искусственно введённые в эукариотную клетку элементы системы CRISPR-Cas бактериального происхождения способны функционировать и в новой среде). При этом современные технологии CRISPR-Cas используют белок Cas9, одинаковый для всех локусов-мишеней, а специфичность действия определяется не белком, а crРНК. Методы, основанные на ZFN и TALEN, используются и по сей день и даже являются предпочтительными для клинических исследований, однако простота, эффективность и экономичность методов, использующих систему CRISPR-Cas9, вывели их на первое место среди методов для направленного редактирования генома, а также связывания с ДНК<ref name="br1" /><ref name="Vlasov" />. Методы, основанные на CRISPR-Cas9, близки к естественным механизмам действия этих систем: для распознавания последовательности-мишени, которая располагается рядом с PAM, используется РНК, и направляемая ею нуклеаза Cas9 производит двуцепочечный разрыв в сайте-мишени. При редактировании генома эукариот, впрочем, результатом работы CRISPR-Cas9 является не разрушение всей молекулы ДНК, а репарация двуцепочечного разрыва, произведённого Cas9. Репарация может проводиться как за счёт [[Негомологичное соединение концов|негомологичного соединения концов]] ({{lang-en|non-homologous end joining, NHEJ}}), так и путём [[Гомологичная рекомбинация|гомологичной рекомбинации]]. В результате репарации, сопровождавшейся негомологичным соединением концов, часто возникают небольшие вставки или [[Делеция|делеции]], способные разрушить [[Рамка считывания|рамку считывания]] белок-кодирующих генов, что приводит к утрате функции гена-мишени. Вызвав множество двуцепочечных разрывов, можно добиться появления крупных делеций и даже [[Инверсия (биология)|инверсий]]<ref name="br1" />. Репарация путём гомологичной рекомбинации, напротив, подразумевает замену удалённой последовательности новой последовательностью, комплементарной матрице для репарации, которую создаёт сам исследователь. Таким образом, гомологичная рекомбинация может использоваться для удаления нежелательных [[Мутации|мутаций]], создания новых аллелей, вставки или слияния функциональных доменов. Кроме того, мутационная инактивация доменов RuvC или HNH Cas9 превращает этот белок в РНК-направляемую [[Эндонуклеазы|никазу]], производящую не двуцепочечные, а одноцепочечные разрывы. Инактивация обоих доменов превращает Cas9 в направляемый РНК {{нп5|ДНК-связывающий белок||en|DNA-binding protein}}, не разрезающий мишень. В этом случае к ДНК-связывающему домену можно присоединить домен с другими функциями, что, в свою очередь, может вызвать различные изменения в локусе-мишени: активацию или репрессию транскрипции, модификацию [[хроматин]]а, усиление образования петель и многие другие. Кроме того, инактивированная форма Cas9 (dCas9, «мёртвая» Cas9) служит основой для новых исследовательских приёмов — например, визуализации посредством [[Флуоресценция|флуоресценции]] или создания меток для последующей физической изоляции локусов<ref name="br1" />. Несмотря на эффективность использования систем CRISPR-Cas, происхождение Cas9 накладывает некоторые ограничения на выбор ДНК-мишеней: например при использовании Cas9 ''[[Streptococcus pyogenes]]'' в качестве мишеней можно выбирать только последовательности, за которыми следует PAM, а именно 5'-NGG (где N — любой нуклеотид). Впрочем, необходимость в PAM не накладывает серьёзных ограничений на применение систем CRISPR-Cas9: в человеческом геноме такие последовательности встречаются почти каждые 8—12 нуклеотидов. Перед использованием в генетических конструкциях ген Cas9 должен быть предварительно [[Предпочтение кодонов|оптимизирован]] по используемым [[кодон]]ам в соответствии с организмом, геном которого предполагается модифицировать<ref name="enj13">{{cite pmid|24157548}}</ref>: ген ''cas9'' ''S. pyogenes'' отличается низким [[GC-состав]]ом (35 %), и для организмов, чьи геномы имеют высокий GC-состав, может быть необходима оптимизация кодонов Cas9<ref name="peters15" />. [[Файл:CRISPR-Cas9 mode of action - ru.svg|thumb|450px|Механизм действия CRISPR-Cas9 при редактировании генома эукариотический клетки]] В настоящий момент для редактирования генома применяют систему CRISPR-Cas II типа, причём чаще всего используется белок SpyCas9 (нуклеаза Cas9 бактерии ''S. pyogenes''); однако ведётся разработка альтернативных белков Cas9, которые позволят увеличить область применения CRISPR-Cas. Например, укороченные формы Cas9 могут распознавать различные последовательности PAM. Хотя редактирование генома можно эффективно осуществлять с помощью crРНК и tracrРНК, транскрибируемых отдельно, разработка технологии единой направляющей РНК (sgРНК) позволила упростить эту систему. В этом случае четырёхкомпонентная система РНКаза III:crРНК:tracrРНК:Cas9 заменяется двухкомпонентной системой sgРНК:Cas9. В настоящее время sgРНК используется значительно чаще, чем раздельные crРНК и tracrРНК. Наконец, ведутся разработки по улучшению специфичности Cas9 и уменьшению побочных эффектов<ref name="br1" /><ref name="Vlasov" />. В начале 2016 года были опубликованы результаты работы американских исследователей, которым удалось снизить количество ошибок практически до нуля<ref name="zero" />. [[Файл:CRISPR_overview_-_ru.svg|thumb|470px|left|Принцип конструирования плазмиды CRISPR-Cas9]] Доставку sgРНК и Cas9 в клетки-мишени обеспечивают различными способами. Например, для этого можно использовать плазмиды, кодирующие sgРНК и Cas9, и [[Трансфекция|трансфецировать]] (или [[Трансформация (генетика)|трансформировать]], в случае прокариот) ими клетки. Такие плазмиды можно доставлять в клетки при помощи [[Электропорация|электропорации]]<ref>{{cite pmid|26857612}}</ref>. В некоторых случаях оказывается более удобным использовать плазмиды, кодирующие Cas9, а РНК доставлять в виде наработанных с помощью ПЦР {{нп5|ампликон|ампликонов|en|Amplicon}}<ref name="enj13" />. В 2015 году был предложен новый способ доставки sgРНК и Cas9 в клетку внутри особых наноклубков. Такой наноклубок состоит из одной, плотно обвитой цепи ДНК, один из участков которой комплементарен переносимой sgРНК; таким образом комплекс sgРНК:Саs9 закрепляется внутри клубка. Более того, наноклубок способен к самосборке. К одному наноклубку можно присоединить множество различных комплексов sgРНК:Cas9. При контакте с клеткой наноклубок попадает в [[Эндосома|эндосому]], однако особый [[полимер]], покрывающий наноклубок, обеспечивает разрушение эндосомы и даёт возможность sgРНК:Cas9 достичь [[Клеточное ядро|ядра]]<ref>{{cite pmid|26310292}}</ref>. === Модификации методов === Для направленного редактирования генома эукариотических клеток используют не только Cas9 ''S. pyogenes'', но и Cas9 ''Streptococcus thermophilus'', ''Neisseria meningitidis''<ref>{{cite pmid|23940360}}</ref><ref>{{cite pmid|24270795}}</ref>, а также Cas9 из ''[[Staphylococcus aureus]]'' (SaCas9), которая на 25 % меньше по размерам, чем SpyCas9, что позволяет упаковывать её в [[аденоассоциированный вирус]] (AAV) для доставки [[Вектор (биология)|вектора]] в клетки живого организма в качестве терапевтического средства<ref>{{cite pmid|25830891}}</ref>. Широкое применение нашла неспособная к разрезанию ДНК форма Cas9 (dCas9). Использование dCas9, сшитой с [[Зелёный флуоресцентный белок|флуоресцентным белком]], лежит в основе нового метода CASFISH ([[Флуоресцентная гибридизация in situ|флуоресцентной гибридизации ''in situ'']], опосредуемой CRISPR-Cas9), который позволяет флуоресцентно метить локусы-мишени<ref>{{cite pmid|26324940}}</ref>. С помощью такой dCas9 можно отслеживать длину [[Теломеры|теломер]], а также наблюдать за динамикой определённых локусов в ходе [[Клеточный цикл|клеточного цикла]]<ref>{{cite pmid|24360272}}</ref>. Форму dCas9 можно использовать для подавления транскрипции гена-мишени (в случае, когда она связывается с последним в области [[промотор]]а, регуляторных областей или начала кодирующей области); кроме того, для подавления транскрипции к dCas9 может быть пришит репрессорный [[пептид]]. Напротив, dCas9, сшитая с белками-активаторами транскрипции ([[Фактор транскрипции|факторами транскрипции]] и эффекторами<ref>{{cite pmid|24346702}}</ref>), может активировать транскрипцию гена-мишени. Кроме того, к dCas9 можно пришивать искусственные [[эндонуклеазы рестрикции]], а также ферменты, модифицирующие {{нп5|эпигеном||en|Epigenome}} ([[ДНК-метилтрансфераза|ДНК-метилтрансферазы]], [[Гистонацетилтрансфераза|гистонацетилтрансферазы]]) и регулирующие за счёт этого активность генов-мишеней<ref>{{cite pmid|23849981}}</ref><ref>{{cite pmid|23892895}}</ref><ref>{{cite pmid|25849900}}</ref>. В 2016 году удалось перепрограммировать [[мыши]]ные [[эмбриональные стволовые клетки]] в две внезародышевые линии ([[трофобласт]] и клетки внезародышевой [[Энтодерма|энтодермы]]), активируя гены {{нп5|Cdx2||en|Cdx2}} и {{нп5|Gata6||en|Gata6}} с помощью CRISPR-опосредованных активаторов<ref>{{cite pmid|26782778}}</ref>. Далее, dCas9 может быть сшита с [[мономер]]ом эндонуклеазы {{нп5|FokI||en|FokI}}, функционирующей в виде [[димер]]ов. Димеры FokI могут вносить двуцепочечные разрывы в последовательности-мишени. Для направления dCas9, сшитой с мономером FokI, используются две sgРНК, что значительно увеличивает точность системы. Когда два мономера, каждый из которых направляем своей sgРНК, располагаются на расстоянии около 30 пар оснований друг от друга, то FokI димеризуется и вносит двуцепочечный разрыв<ref>{{cite pmid|24770325}}</ref>. Для очистки локусов, связанных с sgРНК, можно использовать dCas9, несущую определённые [[эпитоп]]ы. Фактически этот метод представляет собой особый вариант {{нп5|Иммунопреципитация хроматина|иммунопреципитации хроматина|en|Chromatin immunoprecipitation}}<ref>{{cite pmid|23942116}}</ref>. [[Файл:Self-cloning CRISPR - ru.svg|thumb|400px|Схема метода самоклонирующихся CRISPR]] Найдены аналоги Cas9, способные расщеплять вместо ДНК молекулы РНК. Применение этих белков позволит редактировать или избирательно подавлять активность [[микроРНК]]<ref>{{cite pmid|25274302}}</ref><ref>{{cite pmid|19945378}}</ref>. Cas9 ''Francisella novicida'' (FnCas9) может быть перепрограммирована так, чтобы быть нацеленной на РНК-геном [[Вирус гепатита C|вируса гепатита C]], что приводит к подавлению жизненного цикла [[вирус]]а в клетках эукариот. На основе этой системы можно создать сотни средств против различных вирусов<ref>{{cite pmid|25918406}}</ref>. Осенью 2015 года был предложен новый метод, альтернативный CRISPR-Cas9 — {{нп5|CRISPR-Cpf1||en|CRISPR/Cpf1}}. Cpf1 — эндонуклеаза, являющаяся эффекторным белком систем CRISPR-Cas V типа. Она мельче, чем Cas9, а для её функционирования нужна только crРНК, но не tracrРНК. В связи с этим, возможно, в некоторых случаях метод CRISPR-Cpf1 будет удобнее метода CRISPR-Cas9<ref>{{cite pmid|26578176}}</ref>. В 2015 году был предложен также новый метод самоклонирующихся CRISPR ({{lang-en|self-cloning CRISPR}}). В этом случае в клетки вводят плазмиду, содержащую самоклонирующуюся палиндромную sgРНК, а также короткую двуцепочечную ДНК, которая содержит последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. Когда плазмида транскрибируется, образующаяся sgРНК в комплексе с Cas9 комплементарно связывается с последовательностью в плазмиде, кодирующей эту sgРНК. Cas9 вносит двуцепочечный разрыв, который репарируется путём гомологичной рекомбинации с использованием введённой двуцепочечной ДНК в качестве матрицы; в итоге плазмида вновь содержит последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. В отличие от стандартного метода CRISPR, для которого требуется длительная и трудоёмкая наработка специальных плазмид для каждого нового локуса-мишени, метод самоклонирующихся CRISPR позволяет сократить время эксперимента с шести дней до трёх часов и уменьшить его стоимость в шесть раз<ref>{{cite pmid|26527385}}</ref>. В настоящее время интенсивно разрабатываются химические методы контроля работы CRISPR-Cas: дозы, времени действия, специфичности и других параметров<ref>{{cite pmid|27820801}}</ref><ref>{{cite pmid|27820804}}</ref>. === Биотехнологическое и медицинское значение === В настоящее время методы CRISPR-Cas успешно применяются в генной инженерии самых разных организмов: как многоклеточных и одноклеточных ([[дрожжи]]) эукариот, так и прокариот<ref name="peters15">{{cite pmid|26363124}}</ref><ref name="enj14">{{cite pmid|24592315}}</ref>. Применение CRISPR-Cas у [[микроорганизм]]ов позволяет модифицировать их [[Метаболический путь|метаболические пути]], что открывает возможности для развития новых [[Биотехнологии|биотехнологических]] стратегий<ref>{{cite pmid|26707540}}</ref>. Кроме того, важное значение для биотехнологии имеет создание штаммов технологически важных бактерий, устойчивых к различным фагам за счёт CRISPR-Cas<ref name="b15" />. Разработаны методы редактирования геномов с помощью CRISPR-Cas для [[Модельный организм|модельных организмов]] (например, [[Мыши|мышей]]<ref>{{cite pmid|26832693}}</ref>, плодовой мушки ''[[Drosophila melanogaster]]''<ref>{{cite pmid|26850642}}</ref>, [[нематоды]] ''[[Caenorhabditis elegans]]''<ref>{{cite pmid|26837755}}</ref>, рыбки [[данио-рерио]]<ref>{{cite pmid|27836208}}</ref> и других). Такие методы применялись для редактирования генома грибов<ref>{{cite pmid|27811178}}</ref>, в частности, нитчатого [[Грибы|гриба]] ''{{нп5|Aspergillus oryzae||en|Aspergillus oryzae}}'', который используют в промышленности для сбраживания [[соя|сои]]<ref>{{cite pmid|26687199}}</ref> и шампиньона<ref>''Стивен Холл'' Редактируя гриб // [[В мире науки]]. — 2016. — № 12. — С. 85—93.</ref>. Важное значение имеют работы по редактированию с помощью CRISPR-Cas культур клеток [[Млекопитающие|млекопитающих]], в том числе человека<ref>{{cite pmid|27803249}}</ref>. В 2017 году этим методом был отредактирован геном человеческих эмбрионов<ref name="NKJ201801">{{статья |автор=Кирилл Стасевич|заглавие=[http://www.nkj.ru/archive/articles/32964/ От генной инженерии до любви: чем занимались биологи в 2017 году]|издание=[[Наука и жизнь]]|год=2018|номер=1|страницы=2—7}}</ref> . Ведутся работы по редактированию геномов с помощью CRISPR-Cas у [[Крупный рогатый скот|крупного рогатого скота]]<ref>{{cite pmid|25596824}}</ref>, [[Свиньи|свиней]]<ref>{{cite pmid|26820415}}</ref> и других [[Животные|животных]], имеющих важное хозяйственное значение, например, [[Пчёлы|пчёл]]<ref>{{cite pmid|27715425}}</ref>. В ноябре 2015 года были опубликованы результаты эксперимента, в ходе которого при помощи технологии CRISPR-Cas в геноме свиньи были разом инактивированы 62 эндогенных [[ретровирус]]а. Авторы исследования надеются, что благодаря этим результатам в будущем станет возможной [[ксенотрансплантация]] органов от свиньи к человеку<ref>{{cite pmid|26456528}}</ref>. Наконец, мутагенез с использованием CRISPR-Cas может использоваться в борьбе с [[Инвазивный вид|инвазивными видами]] (например, инвазивной мухой ''{{нп5|Drosophila suzukii||en|Drosophila suzukii}}'')<ref>{{cite pmid|26721433}}</ref>. Технология CRISPR-Cas успешно применяется в генной инженерии [[Растения|растений]]<ref>{{cite pmid|26823677}}</ref>, в том числе [[Декоративные растения|декоративных]] растений (например, [[Петуния|петунии]]<ref>{{cite pmid|26837606}}</ref>) и многих важных сельскохозяйственных культур: [[рис]]а<ref>{{cite pmid|26617267}}</ref>, [[Соя|сои]]<ref>{{cite pmid|26603121}}</ref>, [[Пшеница|пшеницы]], [[сорго]], [[кукуруза|кукурузы]], [[томат]]а<ref>{{cite pmid|26408904}}</ref> и [[апельсин]]а<ref>{{cite pmid|25437637}}</ref>. Исследуются возможности внедрения систем CRISPR-Cas в культурные растения для создания противовирусного иммунитета<ref>{{cite pmid|26556628}}</ref><ref>{{cite pmid|27877187}}</ref>. Для генной инженерии растений также может использоваться система CRISPR-Cpf1<ref>{{cite pmid|27875019}}</ref>. Методы, основанные на CRISPR-Cas, могут найти применение и в медицине для лечения самых разнообразных заболеваний: [[Вирусные заболевания|вирусных]] (в том числе [[ВИЧ-инфекция|ВИЧ-инфекции]]<ref>{{cite pmid|26787519}}</ref><ref>{{cite pmid|27755113}}</ref> и [[Герпесвирусы|герпесвирусных]] инфекций<ref>{{cite pmid|27860066}}</ref>), [[Аллергия|аллергии]] и [[Иммунология|иммунологических заболеваний]] (в том числе [[Аутоиммунные заболевания|аутоиммунных]]<ref>{{cite pmid|27584931}}</ref>)<ref>{{cite pmid|27687572}}</ref>, [[онкология|онкологических]]<ref>{{cite pmid|25748654}}</ref><ref>{{cite pmid|26806808}}</ref><ref>{{cite pmid|26787518}}</ref>, [[Сердечно-сосудистое заболевание|сердечно-сосудистых заболеваний]]<ref>{{cite pmid|27847153}}</ref> и даже [[ревматизм]]а<ref>{{cite pmid|27825565}}</ref>, а также наследственных расстройств<ref>{{cite pmid|26686765}}</ref> — таких, как [[синдром Дауна]], [[серповидно-клеточная анемия]]<ref>{{cite pmid|24681508}}</ref>, [[пигментный ретинит]]<ref>{{cite pmid|26814166}}</ref> и {{нп5|β-талассемия||en|Beta thalassemia}}<ref>{{cite pmid|26676643}}</ref>. В 2013 году появилась публикация<ref>{{cite pmid|24315439}}</ref> с сообщением о том, что исследователи сумели отредактировать аномальный ген в [[стволовые клетки|стволовых клетках]] пациента, больного [[муковисцидоз]]ом. Возможно, система CRISPR-Cas может помочь в лечении [[Миодистрофия Дюшенна|мышечной дистрофии Дюшенна]] (DMD): показано, что с помощью CRISPR-Cas можно восстановить ген [[дистрофин]]а в [[Культура клеток|культуре клеток]] DMD<ref>{{cite pmid|27845387}}</ref>. Предполагается, что такие клетки с «отремонтированным» геномом можно трансплантировать в организм больного, где они смогут заменить больные клетки и выполнять необходимые функции<ref name="Vlasov" />. В октябре 2016 года в Китае было произведено редактирование генома взрослого человека с помощью CRISPR/Cas: пациенту с [[Рак лёгкого|раком лёгких]] ввели модифицированные с помощью CRISPR-Cas [[Т-лимфоциты]]<ref>{{cite doi|10.1038/nature.2016.20988}}</ref>. Исследователи полагают, что редактирование генома [[Малярийный комар|малярийного комара]] с помощью CRISPR-Cas способно помочь в борьбе с [[Малярия|малярией]]<ref>{{cite pmid|26809567}}</ref><ref>{{cite pmid|27795546}}</ref>. Показана возможность редактирования с помощью CRISPR-Cas генома другого важного патогенного простейшего — ''[[Toxoplasma gondii]]''<ref>{{cite pmid|27709570}}</ref>. Система CRISPR-Cas может быть использована для получения из человеческих [[Плюрипотентность|плюрипотентных]] клеток [[Ткань (биология)|тканей]], устойчивых к [[Воспаление|воспалению]]<ref>{{cite pmid|27813286}}</ref>. Методы CRISPR-Cas показали себя эффективными при манипуляциях с [[локус]]ом ''PRPN'', кодирующим [[Прионы|прионный белок]], ответственный за ряд [[Нейродегенеративное заболевание|нейродегенеративных заболеваний]] [[человек]]а и других [[Млекопитающие|млекопитающих]]<ref>{{cite pmid|27128441}}</ref>. Линии клеток, модифицированных при помощи CRISPR-Cas, могут использоваться в качестве моделей различных заболеваний человека. Например, при помощи CRISPR-Cas из линии [[Плюрипотентность|плюрипотентных]] клеток человека были получены клетки с мутациями, соответствующими двум заболеваниям [[Почка (анатомия)|почек]] ([[Поликистоз почек|поликистозу почек]] и {{нп5|Фокальный сегментарный гломерулосклероз|фокальному сегментарному гломерулосклерозу|en|Focal segmental glomerulosclerosis}}). Позже из этих клеток были выращены мини-органы, соответствующие почкам человека с данными болезнями<ref>{{cite pmid|26493500}}</ref>. Этот же метод был использован для моделирования {{нп5|Синдром длинного QT|синдрома длинного QT|en|Long QT syndrome}} на [[кардиомиоцит]]ах. Подобные модели могут помочь в изучении заболеваний и разработке новых лекарственных препаратов<ref>{{cite pmid|24213244}}</ref>. === Редактирование ДНК для противостояния заражению ВИЧ === В ноябре 2018 года стало известно, что команде китайских учёных под руководством [[Хэ Цзянькуй|Хэ Цзянькуя]] удалось создать первых в мире людей с искусственно изменёнными генами (отключён [[CCR5]]) — [[Лулу и Нана|двух девочек-близнецов]], которые, как предполагается, невосприимчивы к [[Вирус иммунодефицита человека|вирусу иммунодефицита человека]]<ref>{{Cite web|url=https://www.technologyreview.com/s/612458/exclusive-chinese-scientists-are-creating-crispr-babies/|title=EXCLUSIVE: Chinese scientists are creating CRISPR babies|author=Antonio Regalado|publisher=MIT Technology Review|lang=en|accessdate=2019-02-01}}</ref><ref name=":0">{{Cite web|url=https://www.interfax.ru/world/647031|title=Китайские власти подтвердили рождение генетически отредактированных детей и еще одну беременность|author=|website=|date=2019-01-21|publisher=Interfax.ru|lang=ru|accessdate=2019-01-31}}</ref>. Данный эксперимент был раскритикован из-за нарушения многочисленных научных и этических правил<ref>{{Cite news|title=Why Are Scientists So Upset About the First Crispr Babies?|first=Gina|last=Kolata|url=https://www.nytimes.com/2018/12/05/health/crispr-gene-editing-embryos.html|work=The New York Times|id=0362-4331|date=2018-12-05|accessdate=2019-02-01|language=en-US}}</ref>. == Общественная реакция == В 2015 году о своих планах по модификации геномов человеческих эмбрионов при помощи CRISPR-Cas заявили по меньшей мере четыре лаборатории в США, лаборатории в Китае и [[Великобритания|Великобритании]], а также американская биотехнологическая компания Ovascience<ref>''Antonio Regalado.'' {{cite web |url=https://www.technologyreview.com/s/535661/engineering-the-perfect-baby/ |title=Engineering the Perfect Baby|work=MIT Technology Review|date=5 March 2015|accessdate = 23 February 2016}}</ref>. В свете этих событий многие учёные выступили за введение международного моратория на применение технологии CRISPR-Cas к эмбрионам и клеткам зародышевой линии человека, в том числе и в медицинских целях<ref name="SCI-20150319">{{cite pmid|25791083}}</ref><ref name="NAT-20150312">{{cite pmid|25810189}}</ref>. Эти учёные поддержали дальнейшие фундаментальные исследования CRISPR, однако, по их мнению, технология CRISPR-Cas ещё недостаточно развита, чтобы при её применении в клинической практике гарантировать отсутствие побочных мутаций и наследственных дефектов у пациентов<ref name="NYT-20150319">{{cite news | author = Nicholas Wade | title = Scientists Seek Ban on Method of Editing the Human Genome | url = https://www.nytimes.com/2015/03/20/science/biologists-call-for-halt-to-gene-editing-technique-in-humans.html | date =19 March 2015 | work = [[The New York Times]] | accessdate = 20 March 2015 | quote = The biologists writing in Science support continuing laboratory research with the technique, and few if any scientists believe it is ready for clinical use.}}</ref>. В апреле 2015 года группа китайских учёных опубликовала в журнале ''{{нп5|Protein & Cell||en|Protein & Cell}}'' статью, в которых сообщили о результатах своей попытки изменить ДНК нежизнеспособных человеческих эмбрионов при помощи CRISPR-Cas. Они пытались исправить мутацию, приводящую к {{нп5|Бета-талассемия|бета-талассемии|en|Beta thalassemia}}<ref name="human" />. По словам ведущего исследователя, ''[[Nature]]'' и ''[[Science]]'' отвергли статью из-за [[Этика|этических]] соображений<ref name=NatureNews>{{cite web |url=http://www.nature.com/news/chinese-scientists-genetically-modify-human-embryos-1.17378 |title=Chinese scientists genetically modify human embryos |work=Nature |date=22 April 2015}}</ref>. Результаты эксперимента оказались не слишком оптимистичными из-за многочисленных мутаций, произошедших вне гена-мишени. Авторы исследования заявили, что в настоящее время технология CRISPR-Cas ещё не готова для применения в {{нп5|Репродуктивная медицина|репродуктивной медицине|en|Reproductive medicine}}<ref name="human" />. В декабре 2015 года в [[Вашингтон]]е под председательством [[Балтимор, Дейвид|Дейвида Балтимора]] прошёл Международный [[саммит]] по редактированию генов человека ({{lang-en|International Summit on Human Gene Editing}}). В ходе этого саммита представители национальных академий наук США, Великобритании и Китая обсуждали этические вопросы модификации генов клеток зародышевой линии человека. В ходе встречи было решено продолжать дальнейшие фундаментальные и клинические исследования на соответствующих законодательных и этических основаниях. Особое внимание было обращено на различие между клиническим применением [[Соматические клетки|соматических клеток]], при котором распространение производимых мутаций ограничено одной особью, и [[Гоноцит|клеток зародышевой линии]], чьи геномные нарушения могут быть унаследованы следующим поколением. Последнее может иметь непредвиденные и далеко идущие последствия на [[Антропогенез|эволюцию человека]] — как генетическую, так и культурную<ref name="National Academy of Science">{{cite web | url = http://www8.nationalacademies.org/onpinews/newsitem.aspx?RecordID=12032015a | date =3 December 2015 | title = International Summit on Gene Editing | publisher =National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine | accessdate = 3 December 2015 }}</ref>. В феврале 2016 года группе британских учёных было дано разрешение на генетическую модификацию человеческих эмбрионов с помощью CRISPR-Cas и родственных методов<ref name="BBC-20160201">{{cite news |author= James Gallagher |title=Scientists get 'gene editing' go-ahead |url=http://www.bbc.co.uk/news/health-35459054 |work=[[BBC News]] |publisher=BBC|date=1 February 2016 |accessdate=1 February 2016}}</ref><ref name="AP-20160201">{{cite news |author=Maria Cheng |title=Britain approves controversial gene-editing technique |url=http://bigstory.ap.org/article/fdda5bf9f0314b748c7438c9659da83a/britain-approves-controversial-gene-editing-technique |date=1 February 2016 |work=[[AP News]] |accessdate=1 February 2016 }}</ref>. В 2012 и 2013 годах, в начале прорыва, связанного с применением CRISPR в генной инженерии, метод CRISPR-Cas был номинирован на премию «[[Прорыв года (Science)|Прорыв года]]» телевизионного шоу ''{{нп5|Science Magazine||en|Science Magazine}}''. В 2015 году он выиграл эту награду<ref name="Science_Breakthrough">{{cite web | title = And Science’s Breakthrough of the Year is …|url = http://news.sciencemag.org/scientific-community/2015/12/and-science-s-breakthrough-year|website = news.sciencemag.org|accessdate = 2015-12-21|date = December 17, 2015|last = Science News Staff.}}</ref>. == См. также == * [[Эндонуклеазы рестрикции#Искусственные рестриктазы|Искусственные рестриктазы]] * [[Факторы транскрипции#Искусственные факторы транскрипции|Искусственные факторы транскрипции]] * [[Индуцированные стволовые клетки#Трансдифференцировка с помощью CRISPR-опосредованного активатора|Трансдифференцировка с помощью CRISPR-опосредованного активатора]] * [[Cas9]] == Примечания == {{примечания|2}} == Литература == * {{книга | автор = | заглавие = CRISPR-Cas Systems: RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea | ссылка = https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-3-642-34657-6 | ответственный = Rodolphe Barrangou, John van der Oost | место = | издательство = Springer Berlin Heidelberg | год = 2013 | том = | страниц = | страницы = | isbn = 978-3-642-34656-9 | doi = 10.1007/978-3-642-34657-6 | ref = }}. * {{статья |автор= |заглавие=CRISPR-Cas9: Engineering a revolution in gene editing |ссылка=http://science.imirus.com/Mpowered/book/vscim14/i4/p1 |год=2014 |издание=Science |volume = 345 |номер=6204 |pages=1638 |doi=10.1126/science.345.6204.1638-d}} * {{статья |автор= Makarova, K. S., Wolf, Y. I., & Koonin, E. V.|заглавие=Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?. |ссылка=https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2018.0033 |год=2018 |издание=The CRISPR Journal |volume = 1 |номер=5 |pages=325—336 |doi=10.1089/crispr.2018.0033}} == Ссылки == * {{cite web |url=http://crispr.u-psud.fr/index.php?page=about |title= CRISPRs web server (онлайновая база данных по CRISPR)}} * {{cite web| url=http://online.liebertpub.com/loi/crispr The CRISPR Journal |title=Научный журнал, посвящённый CRISPR}} * {{cite web|url=https://biomolecula.ru/articles/crispr-sistemy-immunizatsiia-prokariot|title=CRISPR-системы: иммунизация прокариот|author=Артамонова, Ирена; Гоглева, Анна|publisher=// Сайт ''Biomolecula.ru''|date=14.11.2014|accessdate=2018-05-30}} * {{cite web|url=https://biomolecula.ru/articles/anti-crispr-otvet-virusov|title=Анти-CRISPR: ответ вирусов|author=Минина, Елизавета|publisher=// Сайт ''Biomolecula.ru''|date=6.12.2017|accessdate=2018-05-30}} * {{cite web|url=https://biomolecula.ru/articles/bitva-veka-crispr-vs-vich|title=Битва века: CRISPR vs ВИЧ|author=Борзов, Никита|publisher=// Сайт ''Biomolecula.ru''|date=11.10.2016|accessdate=2018-05-30}} * {{cite web|url=https://biomolecula.ru/articles/crispr-cas9-kak-pomoshchnik-v-borbe-s-vich|title=CRISPR/​Cas9 как помощник в борьбе с ВИЧ|author=Шмакова, Анна|publisher=// Сайт ''Biomolecula.ru''|date=19.10.2016|accessdate=2018-05-30}} * {{cite web|url=https://biomolecula.ru/articles/prosto-o-slozhnom-crispr-cas|title=Просто о сложном: CRISPR/​Cas|author=Коротаев, Александр; Волкова, Ольга|publisher=// Сайт ''Biomolecula.ru''|date=24.11.2016|accessdate=2018-05-30}} * {{cite web|url=https://biomolecula.ru/articles/ot-slov-k-delu-tekhnologiiu-crispr-cas-vpervye-primenili-dlia-lecheniia-onkozabolevanii|title=От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний|author=Кротов, Антон|publisher=// Сайт ''Biomolecula.ru''|date=25.11.2016|accessdate=2018-05-30}} * {{cite web|url=https://biomolecula.ru/articles/naideny-sistemy-crispr-ispolzuiushchie-obratnuiu-transkriptsiiu|title=Найдены системы CRISPR, использующие обратную транскрипцию|author=Кондратенко, Юлия|publisher=// Сайт ''Biomolecula.ru''|date=9.03.2016|accessdate=2018-05-30}} {{Избранная статья|Биология}} [[Категория:Молекулярно-генетические процессы]] [[Категория:Генетическая инженерия]] [[Категория:Методы молекулярной биологии]] {{Биоинженерия}}'