Флуоресцентная микроскопия
Флуоресце́нтная микроскопи́я (англ. fluorescence microscopy) — метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях.
Описание[править | править код]
Молекулы способны поглощать кванты света и переходить в электронно-возбужденные состояния. Возвращение молекулы в «обычное» (основное) состояние, сопровождающееся излучением света, называют флуоресценцией. Поглощение и флуоресценция обуславливаются строением энергетических уровней электронов молекулы и поэтому является специфическим, для каждого типа молекулы, свойством (см. подробнее в статье электронно-колебательная спектроскопия).
Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.
Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с электронной или атомно-силовой микроскопией. Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причем не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.
Во флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой, а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флюоресцентного препарата может быть сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут.
Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX и XXI веков привело к развитию новых методов — двухфотонной и конфокальной микроскопии, а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного наноразрешения.
Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия — метод, позволяющий получать изображение заданного слоя образца, избавляясь от вклада выше- и нижележащих слоёв. Таким образом, этот метод обладает сравнимым разрешением по трём координатным осям. Другая разновидность флуоресцентной микроскопии — эпифлуоресцентная микроскопия — позволяет исследовать поверхность и узкую приповерхностную зону образца.
Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения[править | править код]
Метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) основан на явлении отражения электромагнитных волн от границы раздела двух прозрачных сред, которое возникает при условии, что волна падает из среды с более высоким показателем преломления под углом, превышающем критический (1/n). Интенсивность излучения, проникающего во вторую среду затухает по экспоненциальному закону, что позволяет детектировать флуоресцентные объекты, возбуждаемые этим излучением, в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм[1]. Таким образом, TIRFM может по праву считаться одним из методов флуоресцентной наноскопии. В биологии метод используется для визуализации плазматической мембраны и примембранных структур клеток.
Флуоресцентная наноскопия[править | править код]
В последние годы было разработано несколько новых подходов в области флуоресцентной микроскопии, которые позволили преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь очень высокого ~10 нм. Эти методы стали объединять общим термином флуоресцентная наноскопия.
См. также[править | править код]
Примечания[править | править код]
- ↑ Saffarian S., Kirchhausen T. Differential evanescence nanometry: live-cell fluorescence measurements with 10-nm axial resolution on the plasma membrane // Biophys J. 2008. V. 94. P. 2333—2342.
Литература[править | править код]
- Kässens M. et al. Basics of Light Microscopy & Imaging. — GIT Verlag GmbH & Co. KG, 2006. — 52 p.
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung // Arch. Mikrosc. Anat. Entwicklungsmech. 1873. Bd. 9. S. 413—468.
- Truskey, G. A., Burmeister, J. S., Grapa, E. el al. Journal of Cell Science Volume 103, Issue 2, 1992, P. 491—499.
- Axelrod, D. Journal of Biomedical Optics Volume 6, Issue 1, January 2001, Pages 6-13.
Ссылки[править | править код]
- Австралийские учёные разработали флуоресцентные наночастицы, которые позволяют на стандартных микроскопах без дополнительных затрат изучать наноразмерные объекты // ИА REGNUM, 18 августа 2019
- ibioseminars.org (англ.)
 | В другом языковом разделе есть более полная статья Fluorescence microscope (англ.). |