Полимеразная цепная реакция в реальном времени: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
[непроверенная версия][непроверенная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
→‎Полуколичественная ПЦР: Использование этой формы метода критикуется в профессиональной среде.
Изменена структура документа, добавлены новые применения метода, новый раздел по анализу результатов в процессе работы
Строка 3: Строка 3:
Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода — [[Флюоресценция|флюоресцентные]] красители, [[Интеркаляция (химия)|интеркалирующие]] в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные [[олигонуклеотиды]] ([[ДНК-зонд]]ы), которые флюоресцируют после [[Гибридизация ДНК|гибридизации]] с комплементарными участками ДНК.
Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода — [[Флюоресценция|флюоресцентные]] красители, [[Интеркаляция (химия)|интеркалирующие]] в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные [[олигонуклеотиды]] ([[ДНК-зонд]]ы), которые флюоресцируют после [[Гибридизация ДНК|гибридизации]] с комплементарными участками ДНК.


Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с [[ОТ-ПЦР]] ([[обратная транскрипция]]) для измерения малых количеств [[мРНК]], что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне [[Экспрессия генов|экспрессии]] данного гена в отдельной клетке или ткани<ref name="Nolan">{{статья |заглавие=Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. |издание={{Нп3|Nature Protocols|Nat. Protoc.||Nature Protocols}} |том=1 |страницы=1559—1582 |pmid=17406449 |doi=10.1038/nprot.2006.236 |язык=en |автор=Nolan T., Hands R. E., Bustin S. A. |год=2006 |тип=journal}}</ref>.
Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с [[ОТ-ПЦР]] ([[обратная транскрипция]]) для измерения малых количеств [[мРНК]], что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне [[Экспрессия генов|экспрессии]] данного гена в отдельной клетке или ткани<ref name="Nolan">{{статья |заглавие=Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. |издание={{Нп3|Nature Protocols|Nat. Protoc.||Nature Protocols}} |том=1 |страницы=1559—1582 |pmid=17406449 |doi=10.1038/nprot.2006.236 |язык=en |автор=Nolan T., Hands R. E., Bustin S. A. |год=2006 |тип=journal}}</ref>. Для количественной ПЦР в реальном времени рекомендуется использовать сокращение qPCR, а RT-qPCR - для обратной транскрипции <ref>{{Книга|ссылка=https://www.worldcat.org/oclc/227931709|заглавие=Real-time PCR : current technology and applications|год=2009|место=Norfolk, UK|издательство=Caister Academic Press|страниц=vii, 284 pages, 4 unnumbered pages of plates|isbn=978-1-904455-39-4, 1-904455-39-5}}</ref>.


== Описание метода ==
== Описание метода ==
Строка 20: Строка 20:
Где [N<sub>0</sub> ]<sub>A</sub> и [N<sub>0</sub> ]<sub>B</sub> — начальные количества двух образцов, CT<sub>B</sub> и CT<sub>А</sub> — соответствующие CT-величины, а E — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1 или 0.9<ref name=":1" />.
Где [N<sub>0</sub> ]<sub>A</sub> и [N<sub>0</sub> ]<sub>B</sub> — начальные количества двух образцов, CT<sub>B</sub> и CT<sub>А</sub> — соответствующие CT-величины, а E — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1 или 0.9<ref name=":1" />.


== Классификация используемых флюорофоров ==
=== Разнообразие зондов ===


=== Неспецифическая детекция: количественная ПЦР с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров ===
==== Мечение двуцепочечной ДНК ====
В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green.
В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green. Однако красители дцДНК, такие как SYBR Green, будут связываться со всеми дцДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как димер праймера). Это может потенциально помешать точности мониторинга целевой последовательности.


=== Специфическая детекция: флуоресцентный репортерный зонд ===
⚫
==== Метка, работающая в фазу элонгации ====
Флуоресцентные репортерные зонды обнаруживают только ДНК, содержащую последовательность, комплементарную зонду; следовательно, использование репортерного зонда значительно повышает специфичность и позволяет повысить точность измерения в присутствии других дцДНК. Однако флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают ингибирующий эффект димеров праймера, которые могут подавлять накопление целевых продуктов реакции. Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).
⚫
Существует другой способ использования зондов, к которым с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии два химических реагента будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится<ref name=":0" />.


Метод основан на ДНК-зонде с флуоресцентным репортером на одном конце и гасителем флуоресценции на противоположном конце зонда. Непосредственная близость репортера к гасителю не даёт флуоресценции. Нарушение близость репортера и гасителя способствует испусканию флуоресценции, которое можно обнаружить после возбуждения лазером. Следовательно, увеличение количества продукта, на которое нацеливается репортерный зонд в каждом цикле ПЦР, вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции из-за поломки зонда и высвобождения репортера.
⚫
==== Метки, работающие в фазу отжига ====


⚫
* Метки, работающие в фазу элонгации:
===== Флуорогенная шпилька =====
⚫
Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать [пространственную структуру| вторичная структура ДНК] — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуроофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации<ref name=":0" />.


⚫
На зонд с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии они будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью (часто используется Taq-полимераза), по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится<ref name=":0" />.
===== Метка, основанная на методе FRET =====

⚫
Другой вариант мечения вновь-образующегося ПЦР-продукта основывается на методе [[FRET]]. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать<ref name=":0" />.
⚫
* Метки, работающие в фазу отжига:

Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).
⚫
# Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать особую пространственную структуру ДНК — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуроофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации<ref name=":0" />.
⚫
# Метка, основанная на методе FRET. [[FRET]]. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать<ref name=":0" />.


== ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции ==
== ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипцией ==
Метод был изобретён для детекции количества ДНК в пробе, однако, последнее время все чаще используется немного видоизменённый количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР , RT-qPCR). Этот метод широко используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях<ref name=":2">{{cite pmid|12200227}}</ref>.
Метод был изобретён для детекции количества ДНК в пробе, однако, последнее время все чаще используется немного видоизменённый количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР , RT-qPCR). Этот метод широко используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях<ref name=":2">{{cite pmid|12200227}}</ref>.


Строка 48: Строка 49:
РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.
РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.


⚫
Немного модифицированный метод количественного ПЦР с реакцией обратной транскрипции называется [[полуколичественная ПЦР]] ([[semi-quantitative PCR]]). Он часто используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции. ПЦР реакция останавливается, когда предполагается, что накопление продукта находится в экспоненциальной фазе роста и ПЦР-продукт можно детектировать. Далее, после электрофореза или [[саузерн-блот]]а, можно измерить разницу в экспрессии нескольких образцов<ref name=":2" />. Использование данного метода критикуется в профессиональной среде, т.к. данный метод подразумевает оценку "на глазок".
=== Полуколичественная ПЦР ===

⚫
[[Полуколичественная ПЦР]] ([[semi-quantitative PCR]]) — немного модифицированный метод количественного ПЦР с реакцией обратной транскрипции. Он часто используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции. ПЦР реакция останавливается, когда предполагается, что накопление продукта находится в экспоненциальной фазе роста и ПЦР-продукт можно детектировать. Далее, после электрофореза или [[саузерн-блот]]а, можно измерить разницу в экспрессии нескольких образцов<ref name=":2" />. Использование данного метода критикуется в профессиональной среде, т.к. данный метод подразумевает оценку "на глазок".
== Анализ результатов кПЦР ==

=== Анализ кривой плавления ===
ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать конкретные амплифицированные фрагменты ДНК, используя анализ их температуры плавления (также называемый величиной Tm). В методе используются интеркалирующие красители, обычно это SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путем сравнения кривых диссоциации анализируемых образцов ДНК.

В отличие от обычной ПЦР, этот метод позволяет избежать использования методов электрофореза для демонстрации результатов всех образцов. Это связано с тем, что, несмотря на то, что количественный метод ПЦР является кинетическим методом, его обычно оценивают в определенной конечной точке. Поэтому метод обычно обеспечивает более быстрые результаты и или использует меньше реагентов, чем электрофорез.


== Применение ==
== Применение ==
ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания.
ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания.


=== Диагностические исследования ===
=== Научные исследования ===
⚫
В ходе проведения исследований, кПЦР в основном используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определённого гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды . Он также используется для определения зиготности трансгенных животных, используемых в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально модифицируется.

==== Количественная оценка экспрессии генов ====
Количественная оценка экспрессии генов с помощью традиционных методов обнаружения ДНК ненадежна. Обнаружение мРНК с помощью [[Нозерн-блот|нозерн-блоттинга]], или [[Электрофорез ДНК|продуктов ПЦР на геле]], или [[Саузерн-блот|саузерн-блоттинге]] не позволяет провести точное количественное определение. Например, в течение 20–40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато, которое напрямую не связано с количеством ДНК-мишени в начальной ПЦР. <ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12901609|автор=L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon|заглавие=The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression|год=2003-03|издание=Journal of biomolecular techniques: JBT|том=14|выпуск=1|страницы=33–43|issn=1524-0215}}</ref>

ПЦР в реальном времени может быть использована для количественной оценки нуклеиновых кислот двумя распространенными методами: относительной количественной оценки и абсолютной количественной оценки. <ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20109462|автор=S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group|заглавие=Comparison of different standards for real-time PCR-based absolute quantification|год=2010-03-31|издание=Journal of Immunological Methods|том=354|выпуск=1-2|страницы=34–39|issn=1872-7905|doi=10.1016/j.jim.2010.01.004}}</ref> '''Абсолютное количественное определение''' дает точное количество целевых молекул ДНК с использованием калибровочной кривой. Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность амплификации. '''Относительная количественная оценка''' основана на внутренних эталонных генах ([[Гены домашнего хозяйства|генов "домашнего хозяйства"]]) для определения кратных различий в экспрессии целевого гена. Количественная оценка выражается как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как комплементарная ДНК (кДНК, генерируемая обратной транскрипцией мРНК). Относительную количественную оценку легче выполнить, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество изучаемого гена сравнивается с количеством контрольного гена.

⚫
==== кПЦР для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК) ====
⚫
мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру<ref>{{cite pmid|20109550}}</ref>.

==== Геномные исследования с применением ChIP-qPCR ====
Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в сочетании с qRT-PCR считается базовым методом в геномных исследованиях, его коммерческая доступность и высокая точность позволяет быстро и легко анализировать взаимодействия белок-ДНК. ChIP-qPCR применяют для исследований конкретных генов и потенциальных регуляторных областей, таких как промоторы. Этот метод в настоящее время используется в разных исследованиях, включая клеточную дифференцировку, молчание генов-супрессоров и влияние модификаций гистонов на экспрессию генов.

Анализ ChiP охватывает только часть возможных мишеней, присутствующих по всему геному из-за вариабельности эффективности сшивания и / или стерического ограничения доступности антител. <ref>{{Статья|ссылка=http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-7380-4_3|автор=Patrik Asp|заглавие=How to Combine ChIP with qPCR|год=2018|ответственный=Neus Visa, Antonio Jordán-Pla|язык=en|место=New York, NY|издание=Chromatin Immunoprecipitation|издательство=Springer New York|том=1689|страницы=29–42|isbn=978-1-4939-7379-8, 978-1-4939-7380-4|doi=10.1007/978-1-4939-7380-4_3}}</ref>

Для проведения Chip-qPCR необходимо добавить master mix (смесь ферментов и нуклеотидов), праймеры и матричную ДНК. При этом нужно точно подобрать концентрацию праймеров для эффективной амплификации целевой ДНК. В качестве матрицы выступает либо Chip ДНК, либо в случае отрицательного контроля пустые бусины без ДНК. Затем необходимо подобрать время и температуру циклов отжига, и запустить ПЦР-амплификатор. Результаты анализируют аналогично результатами qPCR, сравнивая пороговое число циклов (CT) для матрицы ввода и матрицы ДНК ChIP. <ref>{{Статья|ссылка=http://www.cshprotocols.org/lookup/doi/10.1101/pdb.prot082628|автор=Tae Hoon Kim, Job Dekker|заглавие=ChIP–Quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR)|год=2018-05|язык=en|издание=Cold Spring Harbor Protocols|том=2018|выпуск=5|страницы=pdb.prot082628|issn=1940-3402, 1559-6095|doi=10.1101/pdb.prot082628}}</ref>

=== Медицинская диагностика ===
Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний<ref>Sails AD (2009). «Applications in Clinical Microbiology». ''Real-Time PCR: Current Technology and Applications''. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4</ref>. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа<ref>''FDA Authorizes Emergency Use of Influenza Medicines, Diagnostic Test in Response to Swine Flu Outbreak in Humans.'' FDA News, April 27, 2009.</ref>.
Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний<ref>Sails AD (2009). «Applications in Clinical Microbiology». ''Real-Time PCR: Current Technology and Applications''. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4</ref>. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа<ref>''FDA Authorizes Emergency Use of Influenza Medicines, Diagnostic Test in Response to Swine Flu Outbreak in Humans.'' FDA News, April 27, 2009.</ref>.


Строка 61: Строка 86:
Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из со́лидных опухолей<ref>{{cite pmid|22683404}}</ref><ref>{{cite pmid|23207444}}</ref> и даже при некоторых формах лейкемии<ref>{{cite pmid|22289491}}</ref><ref>{{cite pmid|22314322}}</ref>.
Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из со́лидных опухолей<ref>{{cite pmid|22683404}}</ref><ref>{{cite pmid|23207444}}</ref> и даже при некоторых формах лейкемии<ref>{{cite pmid|22289491}}</ref><ref>{{cite pmid|22314322}}</ref>.


⚫
кПЦР помогает выявлению циркулирующих опухолевых клеток. Так, например, рак молочной железы все ещё является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причём, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ — является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальной происхождение и, следовательно экспрессируют определённый набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии<ref>{{cite pmid|24202442}}</ref>.
==== Выявление циркулирующих опухолевых клеток ====
⚫
Рак молочной железы все ещё является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причём, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ — является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальной происхождение и, следовательно экспрессируют определённый набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии<ref>{{cite pmid|24202442}}</ref>.


=== В микробиологии ===
=== В микробиологии ===
ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения<ref>Filion, M (editor) (2012). ''Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology''.Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0.</ref>. Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры<ref>{{cite doi|10.5772/50048}}</ref>.
ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения<ref>Filion, M (editor) (2012). ''Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology''.Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0.</ref>. Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры<ref>{{cite doi|10.5772/50048}}</ref>

=== Научные исследования ===
⚫
В ходе проведения исследований, кПЦР в основном используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определённого гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды . Он также используется для определения зиготности трансгенных животных, используемых в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально модифицируется

⚫
==== кПЦР для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК) ====
⚫
мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру<ref>{{cite pmid|20109550}}</ref>.

==== ПЦР в реальном времени для измерения количества белка ====
Для измерения количества белка в клетке используют следующий подход:
# Создают два вида антител к целевому белку с пришитыми последовательностями ДНК таким образом, что при взаимодействии с белком, 3’ конец одной последовательности оказывается недалеко от 5’-конца второй ДНК последовательности.
# Получается, что каждой молекуле белка соответствует известная нам последовательность ДНК, количество которой потом можно анализировать с помощью классического кПЦР-анализа<ref>{{cite pmid|20215017}}</ref>.


=== Обнаружение фитопатогенов ===
=== Обнаружение фитопатогенов ===

Версия от 18:20, 9 мая 2020

В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR) — лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце[1].

Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода — флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани[2]. Для количественной ПЦР в реальном времени рекомендуется использовать сокращение qPCR, а RT-qPCR - для обратной транскрипции [3].

Описание метода

Процедура очень похожа на процедуру классической ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции — плавление или денатурация двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Принцип ПЦР в реальном времени заключается в детекции ПЦР-продукта по мере его накопления. Сегодня это возможно сделать благодаря высокоспецифичным флуоресцентным зондам. Существует два основных подхода генерации света у таких зондов — во время элонгации и отжига, но, в обоих случаях флуоресценция усиливается с каждым новым циклом. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы[4].

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта ещё не очень много, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растёт сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать фермент, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума[5].

Количество циклов, необходимое для того, чтобы флуоресценция достигла порогового уровня (над шумом) называется СТ-величиной. Пороговый уровень — не строго определённая величина, может подбираться для каждого случая отдельно.

Однако СТ-величина может зависеть от многих случайных факторов, например чувствительности детектора, качество фильтра и так далее. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — таких генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (Пример — ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции у бактерий). Соотношение определяют по следующей формуле: [N0 ]A/[N0 ]B = (1+E)(CTB-CTA)

Где [N0 ]A и [N0 ]B — начальные количества двух образцов, CTB и CTА — соответствующие CT-величины, а E — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1 или 0.9[5].

Классификация используемых флюорофоров

Неспецифическая детекция: количественная ПЦР с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров

В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green. Однако красители дцДНК, такие как SYBR Green, будут связываться со всеми дцДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как димер праймера). Это может потенциально помешать точности мониторинга целевой последовательности.

Специфическая детекция: флуоресцентный репортерный зонд

Флуоресцентные репортерные зонды обнаруживают только ДНК, содержащую последовательность, комплементарную зонду; следовательно, использование репортерного зонда значительно повышает специфичность и позволяет повысить точность измерения в присутствии других дцДНК. Однако флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают ингибирующий эффект димеров праймера, которые могут подавлять накопление целевых продуктов реакции. Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).

Метод основан на ДНК-зонде с флуоресцентным репортером на одном конце и гасителем флуоресценции на противоположном конце зонда. Непосредственная близость репортера к гасителю не даёт флуоресценции. Нарушение близость репортера и гасителя способствует испусканию флуоресценции, которое можно обнаружить после возбуждения лазером. Следовательно, увеличение количества продукта, на которое нацеливается репортерный зонд в каждом цикле ПЦР, вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции из-за поломки зонда и высвобождения репортера.

  • Метки, работающие в фазу элонгации:

На зонд с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии они будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью (часто используется Taq-полимераза), по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится[4].

  • Метки, работающие в фазу отжига:
  1. Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать особую пространственную структуру ДНК — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуроофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации[4].
  2. Метка, основанная на методе FRET. FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать[4].

ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипцией

Метод был изобретён для детекции количества ДНК в пробе, однако, последнее время все чаще используется немного видоизменённый количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР , RT-qPCR). Этот метод широко используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях[6].

Прежде, чем проводить стандартный ПЦР в реальном времени, нужно провести реакцию обратной транскрипции, для синтеза кДНК. Реакция обратной транскрипции проводится с помощью фермента — обратной-транскриптазы (РНК-зависимой ДНК полимеразы, ревертазы). Реакцию можно проводить без добавления праймера, однако наибольшая эффективность достигается, когда праймер добавлен. Существует три основных типа праймеров:

  1. Олиго dT праймеры — гибридизуются с polyA последовательностью, которая есть на 3’ -конце многих эукариотических мРНК.
  2. Случайная последовательность. Обычно используют либо гексамеры, либо нонамеры. Такие последовательности могут транскрибировать все мРНК
  3. Ген-специфичные праймеры используются, когда исследуется мРНК, экспрессируемая с определённого гена[5].

Реакция обратной транскрипции — ключевой этап в данном подходе, так как количество кДНК должно соответствовать количеству изучаемой мРНК. РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.

Немного модифицированный метод количественного ПЦР с реакцией обратной транскрипции называется полуколичественная ПЦР (semi-quantitative PCR). Он часто используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции. ПЦР реакция останавливается, когда предполагается, что накопление продукта находится в экспоненциальной фазе роста и ПЦР-продукт можно детектировать. Далее, после электрофореза или саузерн-блота, можно измерить разницу в экспрессии нескольких образцов[6]. Использование данного метода критикуется в профессиональной среде, т.к. данный метод подразумевает оценку "на глазок".

Анализ результатов кПЦР

Анализ кривой плавления

ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать конкретные амплифицированные фрагменты ДНК, используя анализ их температуры плавления (также называемый величиной Tm). В методе используются интеркалирующие красители, обычно это SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путем сравнения кривых диссоциации анализируемых образцов ДНК.

В отличие от обычной ПЦР, этот метод позволяет избежать использования методов электрофореза для демонстрации результатов всех образцов. Это связано с тем, что, несмотря на то, что количественный метод ПЦР является кинетическим методом, его обычно оценивают в определенной конечной точке. Поэтому метод обычно обеспечивает более быстрые результаты и или использует меньше реагентов, чем электрофорез.

Применение

ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания.

Научные исследования

В ходе проведения исследований, кПЦР в основном используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определённого гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды . Он также используется для определения зиготности трансгенных животных, используемых в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально модифицируется.

Количественная оценка экспрессии генов

Количественная оценка экспрессии генов с помощью традиционных методов обнаружения ДНК ненадежна. Обнаружение мРНК с помощью нозерн-блоттинга, или продуктов ПЦР на геле, или саузерн-блоттинге не позволяет провести точное количественное определение. Например, в течение 20–40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато, которое напрямую не связано с количеством ДНК-мишени в начальной ПЦР. [7]

ПЦР в реальном времени может быть использована для количественной оценки нуклеиновых кислот двумя распространенными методами: относительной количественной оценки и абсолютной количественной оценки. [8] Абсолютное количественное определение дает точное количество целевых молекул ДНК с использованием калибровочной кривой. Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность амплификации. Относительная количественная оценка основана на внутренних эталонных генах (генов "домашнего хозяйства") для определения кратных различий в экспрессии целевого гена. Количественная оценка выражается как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как комплементарная ДНК (кДНК, генерируемая обратной транскрипцией мРНК). Относительную количественную оценку легче выполнить, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество изучаемого гена сравнивается с количеством контрольного гена.

кПЦР для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК)

мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру[9].

Геномные исследования с применением ChIP-qPCR

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в сочетании с qRT-PCR считается базовым методом в геномных исследованиях, его коммерческая доступность и высокая точность позволяет быстро и легко анализировать взаимодействия белок-ДНК. ChIP-qPCR применяют для исследований конкретных генов и потенциальных регуляторных областей, таких как промоторы. Этот метод в настоящее время используется в разных исследованиях, включая клеточную дифференцировку, молчание генов-супрессоров и влияние модификаций гистонов на экспрессию генов.

Анализ ChiP охватывает только часть возможных мишеней, присутствующих по всему геному из-за вариабельности эффективности сшивания и / или стерического ограничения доступности антител. [10]

Для проведения Chip-qPCR необходимо добавить master mix (смесь ферментов и нуклеотидов), праймеры и матричную ДНК. При этом нужно точно подобрать концентрацию праймеров для эффективной амплификации целевой ДНК. В качестве матрицы выступает либо Chip ДНК, либо в случае отрицательного контроля пустые бусины без ДНК. Затем необходимо подобрать время и температуру циклов отжига, и запустить ПЦР-амплификатор. Результаты анализируют аналогично результатами qPCR, сравнивая пороговое число циклов (CT) для матрицы ввода и матрицы ДНК ChIP. [11]

Медицинская диагностика

Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний[12]. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа[13].

Использование кПЦР также позволяет проводить количественные измерения и генотипирование (характеристика штаммов) вирусов, например, вируса гепатита B[14]. Степень инфекции, которая оценивается, как число копий вирусного генома на единицу ткани пациента, имеет большое значение во многих случаях. Например, вероятность реактивации вируса простого герпеса типа 1 зависит от количества инфицированных ганглиев[15]. В зависимости от того, интегрировал ли вирус в геном пациента (как, например, в случае вируса папилломы человека) или нет, количественный анализ осуществляется с применением обратной транскрипции или без неё.

Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из со́лидных опухолей[16][17] и даже при некоторых формах лейкемии[18][19].

кПЦР помогает выявлению циркулирующих опухолевых клеток. Так, например, рак молочной железы все ещё является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причём, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ — является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальной происхождение и, следовательно экспрессируют определённый набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии[20].

В микробиологии

ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения[21]. Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры[22]

Обнаружение фитопатогенов

Агропромышленность стремится производить семена и рассаду, не содержащую патогенных микроорганизмов, с целью предотвращения экономических потерь и увеличения срока хранения. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК фитофторы (Phytophthora ramorum), оомицетов и некоторых других патогенов, которые приводят к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК возбудителя и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS (internal transcribed spacer), внутренних транскрибируемых участков, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, которые характерны для каждого таксона[23].

Детекция генетически модифицированных организмов

кПЦР (с использованием обратной транскрипции) может быть использована для детекции ГМО (генетически модифицированных организмов), так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. При этом специфические праймеры используются для амплификации промотора, терминатора или даже промежуточных последовательностей, используемых в процессе создания вектора. Так как процесс создания трансгенного растения обычно приводит к вставке более, чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается с помощью кПЦР. При этом в качестве контроля используют растение, содержащее данный ген в единственном экземпляре[24][25].

Примечания

  1. ↑ VanGuilder H. D., Vrana K. E., Freeman W. M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis (англ.) // Biotechniques  (англ.) (рус. : journal. — 2008. — Vol. 44. — P. 619—626. — doi:10.2144/000112776. — PMID 18474036.
  2. ↑ Nolan T., Hands R. E., Bustin S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. (англ.) // Nat. Protoc.  (англ.) (рус. : journal. — 2006. — Vol. 1. — P. 1559—1582. — doi:10.1038/nprot.2006.236. — PMID 17406449.
  3. ↑ Real-time PCR : current technology and applications. — Norfolk, UK: Caister Academic Press, 2009. — vii, 284 pages, 4 unnumbered pages of plates с. — ISBN 978-1-904455-39-4, 1-904455-39-5.
  4. ↑ 1 2 3 4 Provenzano M., Mocellin S. Complementary techniques: validation of gene expression data by quantitative real time PCR. (англ.) // Advances In Experimental Medicine And Biology. — 2007. — Vol. 593. — P. 66—73. — doi:10.1007/978-0-387-39978-2_7. — PMID 17265717. [исправить]
  5. ↑ 1 2 3 Kubista M., Andrade J. M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., Sindelka R., Sjöback R., Sjögreen B., Strömbom L., Ståhlberg A., Zoric N. The real-time polymerase chain reaction. (англ.) // Molecular Aspects Of Medicine. — 2006. — April (vol. 27, no. 2-3). — P. 95—125. — doi:10.1016/j.mam.2005.12.007. — PMID 16460794. [исправить]
  6. ↑ 1 2 Bustin S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. (англ.) // Journal Of Molecular Endocrinology. — 2002. — August (vol. 29, no. 1). — P. 23—39. — PMID 12200227. [исправить]
  7. ↑ L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon. The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression // Journal of biomolecular techniques: JBT. — 2003-03. — Т. 14, вып. 1. — С. 33–43. — ISSN 1524-0215.
  8. ↑ S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group. Comparison of different standards for real-time PCR-based absolute quantification // Journal of Immunological Methods. — 2010-03-31. — Т. 354, вып. 1-2. — С. 34–39. — ISSN 1872-7905. — doi:10.1016/j.jim.2010.01.004.
  9. ↑ Benes V., Castoldi M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. (англ.) // Methods (San Diego, Calif.). — 2010. — April (vol. 50, no. 4). — P. 244—249. — doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.026. — PMID 20109550. [исправить]
  10. ↑ Patrik Asp. How to Combine ChIP with qPCR (англ.) // Chromatin Immunoprecipitation / Neus Visa, Antonio Jordán-Pla. — New York, NY: Springer New York, 2018. — Vol. 1689. — P. 29–42. — ISBN 978-1-4939-7379-8, 978-1-4939-7380-4. — doi:10.1007/978-1-4939-7380-4_3.
  11. ↑ Tae Hoon Kim, Job Dekker. ChIP–Quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) (англ.) // Cold Spring Harbor Protocols. — 2018-05. — Vol. 2018, iss. 5. — P. pdb.prot082628. — ISSN 1559-6095 1940-3402, 1559-6095. — doi:10.1101/pdb.prot082628.
  12. ↑ Sails AD (2009). «Applications in Clinical Microbiology». Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  13. ↑ FDA Authorizes Emergency Use of Influenza Medicines, Diagnostic Test in Response to Swine Flu Outbreak in Humans. FDA News, April 27, 2009.
  14. ↑ Yeh S. H., Tsai C. Y., Kao J. H., Liu C. J., Kuo T. J., Lin M. W., Huang W. L., Lu S. F., Jih J., Chen D. S., Chen P. J. Quantification and genotyping of hepatitis B virus in a single reaction by real-time PCR and melting curve analysis. (англ.) // Journal Of Hepatology. — 2004. — October (vol. 41, no. 4). — P. 659—666. — doi:10.1016/j.jhep.2004.06.031. — PMID 15464248. [исправить]
  15. ↑ Sawtell N. M. The probability of in vivo reactivation of herpes simplex virus type 1 increases with the number of latently infected neurons in the ganglia. (англ.) // Journal Of Virology. — 1998. — August (vol. 72, no. 8). — P. 6888—6892. — PMID 9658140. [исправить]
  16. ↑ Cen P., Ni X., Yang J., Graham D. Y., Li M. Circulating tumor cells in the diagnosis and management of pancreatic cancer. (англ.) // Biochimica Et Biophysica Acta. — 2012. — December (vol. 1826, no. 2). — P. 350—356. — doi:10.1016/j.bbcan.2012.05.007. — PMID 22683404. [исправить]
  17. ↑ Young R., Pailler E., Billiot F., Drusch F., Barthelemy A., Oulhen M., Besse B., Soria J. C., Farace F., Vielh P. Circulating tumor cells in lung cancer. (англ.) // Acta Cytologica. — 2012. — Vol. 56, no. 6. — P. 655—660. — doi:10.1159/000345182. — PMID 23207444. [исправить]
  18. ↑ Brüggemann M., Gökbuget N., Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: monitoring minimal residual disease as a therapeutic principle. (англ.) // Seminars In Oncology. — 2012. — February (vol. 39, no. 1). — P. 47—57. — doi:10.1053/j.seminoncol.2011.11.009. — PMID 22289491. [исправить]
  19. ↑ DiNardo C. D., Luger S. M. Beyond morphology: minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia. (англ.) // Current Opinion In Hematology. — 2012. — March (vol. 19, no. 2). — P. 82—88. — doi:10.1097/MOH.0b013e3283501325. — PMID 22314322. [исправить]
  20. ↑ Andergassen U., Kölbl A. C., Hutter S., Friese K., Jeschke U. Detection of Circulating Tumour Cells from Blood of Breast Cancer Patients via RT-qPCR. (англ.) // Cancers. — 2013. — 25 September (vol. 5, no. 4). — P. 1212—1220. — doi:10.3390/cancers5041212. — PMID 24202442. [исправить]
  21. ↑ Filion, M (editor) (2012). Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology.Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0.
  22. ↑ Nobre Giselle, S. Miglioranz Lucia Helena. Probiotics: The Effects on Human Health and Current Prospects (англ.) // Probiotics. — 2012. — 3 October. — ISBN 9789535107767. — doi:10.5772/50048. [исправить]
  23. ↑ Baldwin B. G. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the compositae. (англ.) // Molecular Phylogenetics And Evolution. — 1992. — March (vol. 1, no. 1). — P. 3—16. — PMID 1342921. [исправить]
  24. ↑ Holst-Jensen A., Rønning S. B., Løvseth A., Berdal K. G. PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). (англ.) // Analytical And Bioanalytical Chemistry. — 2003. — April (vol. 375, no. 8). — P. 985—993. — doi:10.1007/s00216-003-1767-7. — PMID 12733008. [исправить]
  25. ↑ Brodmann P. D., Ilg E. C., Berthoud H., Herrmann A. Real-time quantitative polymerase chain reaction methods for four genetically modified maize varieties and maize DNA content in food. (англ.) // Journal Of AOAC International. — 2002. — May (vol. 85, no. 3). — P. 646—653. — PMID 12083257. [исправить]

Литература

  • Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.

См. также

Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Полимеразная_цепная_реакция_в_реальном_времени&oldid=106926417