Иммунопреципитация

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск

Иммунопреципитация — метод выделения белка из сложных смесей, таких как клеточные лизаты, сыворотки и тканевые гомогенаты, при помощи специфичных к белку антител. Иммунопреципитация позволяет детектировать изменения экспрессии белка, характеризовать белки, с которыми исследуемый белок образует комплекс, выявлять сайты связывания белка с нуклеиновыми кислотами.[1]

Методология[править | править вики-текст]

При проведении иммунопреципитации антитела связывают на микрогранулах. Чаще всего используются микрогранулы из агарозы. Также могут быть использованы микрогранулы, обладающие магнитными свойствами. При помощи магнита магнитные микрогранулы, несущие комплексы антиген-антитело, могут быть удержаны в пробирке во время удаления из нее не связавшихся с антителом компонентов образца.[1]

В зависимости от способа связывания антител на микрогранулах, различают три технологии иммунопреципитации. В классической технологии применяются микрогранулы, покрытые белком A или белком G. Белок A, как и белок G, может связываться с Fс областью широкого спектра антител. Антитело, специфичное к выделяемому белку, инкубируют со смесью, из которой планируют выделить данный белок. После образования комплекса выделяемого белка (антигена) с антителом в смесь вводят микрогранулы, покрытые белком A или белком G. Комплексы антиген-антитело связываются на микрогранулах. При помощи центрифугирования и промывки, микрогранулы со связанными комплексами антиген-антитело отделяют от смеси. Антиген и антитело элюируют с микрогранул. Иногда в смесь вводят микрогранулы, с которыми были предварительно связаны антитела. Основной недостаток классической технологии заключается в том, что при элюции выделяемого белка с микрочастицы антитело также будет снято с микрочастицы. В результате, выделяемый белок будет загрязнен, и антитела нельзя будет использовать повторно.[1]

Загрязнения выделяемого белка и потери антител можно избежать путем иммобилизации антител на микрочастице. Существует две технологии: иммобилизация за счет ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G, расположенного на поверхности микрочастицы, и иммобилизация за счет образования ковалентной связи между антителом и материалом микрочастицы. Эти технологии также имеют свои недостатки. Недостаток ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G заключается в том, что сшивающий реагент может образовывать ковалентные связи в произвольных участках антитела, повреждая активный центр, и, как следствие, антитело теряет способность связывать антиген. Недостаток ковалентной сшивки антитела и материала микрочастицы состоит в том, что, в отличие от технологий с использованием белка A или белка G, произвольный участок антитела свяжется с микрочастицей, что может привести к потере способности антитела связывать антиген.[1]

В ситуации, когда антитела к выделяемому белку недоступны, к нему, с использованием генно-инженерных методов, может быть пришит тэг (например, FLAG), к которому антитела доступны.[2]

Разновидности иммунопреципитации[править | править вики-текст]

Принцип ChIP-seq

Ко-иммунопреципитация[править | править вики-текст]

Ко-иммунопреципитация (Co-IP) — это иммунопреципитация целого белкового комплекса, которая основана на использовании антитела, специфичного к одному из белков, входящих в состав комплекса. Связывая этот белок, антитело связывает весь комплекс. В результате появляется возможность идентифицировать все белки, входящие в состав комплекса.[1]

Иммунопреципитация хроматина[править | править вики-текст]

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) — метод нахождения сайтов связывания исследуемого ДНК-связывающего белка в геноме. Для этого ДНК выделяют из клетки и режут на небольшие фрагменты, а затем проводят иммунопреципитацию, используя антитела к исследуемому ДНК-связывающему белку. В результате с антителами связываются комплексы, состоящие из исследуемого ДНК-связывающего белка и фрагмента ДНК. Такие фрагменты ДНК и есть сайты связывания исследуемого ДНК-связывающего белка в геноме. Для чтения нуклеотидной последовательности данных фрагментов ДНК используют ДНК-микрочипы (ChIP-on-chip) или современные методы секвенирования (ChIP-seq).[3][4]

Иммунопреципитация РНК[править | править вики-текст]

Иммунопреципитация РНК (RIP) — метод, позволяющий идентифицировать молекулы РНК, взаимодействующие с исследуемым РНК-связывающим белком, и определять сайты связывания исследуемого белка с молекулами РНК. Процедура иммунопреципитации РНК аналогична иммунопреципитации хроматина. Для чтения нуклеотидной последовательности выделенных фрагментов РНК используют ДНК-микрочипы, предварительно получив комплементарные выделенным фрагментам молекулы ДНК (RIP-chip), или современные методы секвенирования (RIP-seq).[5]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. 1 2 3 4 5 Kaboord B, Perr M. (2008). «Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.». Methods Mol Biol. 424: 349-64. DOI:10.1007/978-1-60327-064-9_27. PMID 18369874.
  2. Brizzard BL, Chubet RG, Vizard DL. (1994). «Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution.». Biotechniques. 16 (4): 730-5. PMID 8024796.
  3. Hoffman BG, Jones SJ. (2009). «Genome-wide identification of DNA-protein interactions using chromatin immunoprecipitation coupled with flow cell sequencing.». J Endocrinol 201 (1): 1-13. DOI:10.1677/JOE-08-0526. PMID 19136617.
  4. Lee TI, Johnstone SE, Young RA. (2006). «Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.». Nat Protoc. 1 (2): 729-48. PMID 17406303.
  5. Keene JD, Komisarow JM, Friedersdorf MB. (2006). «RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.». Nat Protoc. 1 (1): :302-7. PMID 17406249.