Темнопольная микроскопия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Схема темнопольной микроскопии в падающем свете.
Подсветка образца осуществляется сбоку (зеленая линия). Изображение создается светом, рассеивающимся на неоднородностях образца.

Темнопо́льная микроскопи́я — вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата[1]. Основы метода разработаны Р. Зигмонди в 1906 году.

Принцип действия[править | править исходный текст]

При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой (EPI-illuminator, EPI—microscope, EPI-objective lens).

Для прозрачных объектов возможно и контровое освещение, но при этом необходимы дополнительные действия, чтобы убрать «прямое поле»: необходимо провести фурье-преобразование полученного изображения и удалить из полученной суммы компоненту, соответствующую «опорной» волне. Это можно сделать, например, с помощью линзы и шаблона, закрывающего небольшой участок в плоскости, где линзой фокусируется «опорная» световая волна. Затем, с помощью второй линзы проводят обратное преобразование Фурье и наблюдают полученную картину визуально. При этом контраст исходного изображения существенно возрастает.

В микроскопах использование метода тёмного поля может быть предусмотрено конструкцией[2] или реализуется установкой дополнительных узлов, таких, как конденсор темного поля ОИ-13.

Преимущества и недостатки[править | править исходный текст]

Изображение мизиды, полученное способом темнопольной микроскопии

Темнопольная микроскопия хорошо подходит для получения изображений живых и неокрашенных биологических образцов, таких, как отдельные водные одноклеточные организмы.

Основным ограничивающим фактором метода является то, что только малая часть падающего света в итоге формирует изображение, поэтому необходимо применять достаточно мощные источники света, что иногда приводит к повреждениям образца (сейчас иногда используют лазеры). Значительное ограничение метод накладывает на разрешающую способность системы — апертура объективов, работающих по методу темного поля существенно ниже светлопольных, так как она не должна перекрывать затемненную часть апертуры конденсора. Современные конденсоры темного поля позволяют работать с объективами апертура которых не превышает 1,2 для систем с масляной иммерсией и 0,8 на сухих системах, апертура лучших эпиобъективов не превышает значения 1,15, в то время как апертура светлопольных объективов может достигать значений 1,45.

Интерпретация темнопольных изображений требует большой осторожности, поскольку некоторые детали, не видные методом светлопольной микроскопии, видны методом темнопольной микроскопии, и наоборот. На первый взгляд кажется, что изображение, получаемое темнопольным методом является просто негативом по отношению к получаемым светопольным методом, однако, на самом деле, каждый из этих методов делает видимым разные особенности образца. В светлопольной микроскопии особенности видимы, если они или производят тени, или имеют отличный от окружения коэффициент преломления и при этом достаточно резкие, в то время как, например, плавные неоднородности не могут быть наблюдаемы этим методом, однако, хорошо заметны на картинках, получаемых методом темнопольной микроскопии.

Применение[править | править исходный текст]

Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов — простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток[1].

Темнопольная микроскопия в последнее время используется в производстве компьютерных мышей[3] с тем чтобы обеспечить работу оптических мышей в том числе и на прозрачных стёклах, имеющих микроскопические дефекты или пыль на поверхности.

Одна и та же полированная алмазная пластинка: слева — при наблюдении методом светлого поля, справа — методом тёмного поля.

См. также[править | править исходный текст]

Примечания[править | править исходный текст]

  1. 1 2 Микроскопическая техника Роскин Г. И. М.: Изд. «Советская наука», 1946
  2. Микроскоп биологический исследовательский универсальный МБИ-15 — техническое описание и инструкция по эксплуатации, ЛОМО 1979
  3. Марина Камаева. Обзор Logitech Anywhere MX Wireless Mouse (рус.). Компьютерная газета. Проверено 26 марта 2010. Архивировано из первоисточника 20 апреля 2012.