Секвенирование РНК: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
[непроверенная версия][непроверенная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
исправление
источники
Строка 11: Строка 11:


=== Основные принципы секвенирования РНК ===
=== Основные принципы секвенирования РНК ===
Большинство экспериментов по секвенированию РНК проводятся на оборудовании, которое заточено на секвенирование молекул ДНК. В связи с этим необходимым шагом для секвенирования РНК является создание библиотеки [[CDNA|кДНК]], полученной из исследуемой тотальной РНК. Каждая кДНК из такой библиотеки представляет собой кусочек кДНК разного размера, фланкированный по обоим краям специальными адаптерами. Наличие адаптеров необходимо для последующей амплификации образцов и секвенирования на определенной платформе. Методы создания библиотек кДНК варьируются в зависимости от конечной цели исследования, типа изучаемой РНК, которая может различаться в размере, последовательности, структурных особенностях а также в концентрации. Основные соображения касательно создания подходящей для конкретного эксперимента библиотеки кДНК включают в себя: 1) получение интересующих молекул РНК; 2) преобразование РНК в кДНК установленного размера; 3) способ присоединения адаптерных последовательностей к краям кДНК для амплификации и секвенирования.
Большинство экспериментов по секвенированию РНК проводятся на оборудовании, которое заточено на секвенирование молекул ДНК. В связи с этим необходимым шагом для секвенирования РНК является создание библиотеки [[CDNA|кДНК]], полученной из исследуемой тотальной РНК. Каждая кДНК из такой библиотеки представляет собой кусочек кДНК разного размера, фланкированный по обоим краям специальными адаптерами. Наличие адаптеров необходимо для последующей амплификации образцов и секвенирования на определенной платформе. Методы создания библиотек кДНК варьируются в зависимости от конечной цели исследования, типа изучаемой РНК, которая может различаться в размере, последовательности, структурных особенностях а также в концентрации. Основные соображения касательно создания подходящей для конкретного эксперимента библиотеки кДНК включают в себя: 1) получение интересующих молекул РНК; 2) преобразование РНК в кДНК установленного размера; 3) способ присоединения адаптерных последовательностей к краям кДНК для амплификации и секвенирования <ref>{{Статья|автор=R. Hrdlickova, M. Toloue, B. Tan|заглавие=RNA-Seq methods for transcriptome analysis|ссылка=|язык=|издание=Wiley Periodicals|тип=|год=2016|месяц=|число=|том=|номер=|страницы=|issn=|doi=10.1002/wrna.1364}}</ref>.


==== Создание библиотеки "поли-А" транскриптов ====
==== Создание библиотеки "поли-А" транскриптов ====
Секвенирование полиаденилированной РНК находит широкое применение в секвенировании РНК. В [[Эукариоты|эукариотах]] большая часть белок-кодирующих РНК (мРНК) и [[Длинные некодирующие РНК|длинных некодирующих РНК]] (>200 п.о.) содержат поли-А хвосты. Наличие поли-А хвоста представляет теххническиие удобства для обогащения поли-А содержащими РНК (1-5% от всей суммарной клеточной РНК) в препарате суммарной клеточной РНК. Отбор поли-А содержащих РНК можно производить с помощью магнитных или целлюлозных бусин, покрытых молекулами олиго-dT праймерами. Вебсайт «The Protocol Online»<ref name="protocolonline">[http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/RNA_Extraction/mRNA_Isolation/index.html RNA Extraction/mRNA Isolation Protocols<!-- Заголовок добавлен ботом -->]</ref> предоставляет список нескольких протоколов, относящихся к выделению мРНК.
Секвенирование полиаденилированной РНК находит широкое применение в секвенировании РНК. В [[Эукариоты|эукариотах]] большая часть белок-кодирующих РНК (мРНК) и [[Длинные некодирующие РНК|длинных некодирующих РНК]] (>200 п.о.) содержат поли-А хвосты. Наличие поли-А хвоста представляет теххническиие удобства для обогащения поли-А содержащими РНК (1-5% от всей суммарной клеточной РНК) в препарате суммарной клеточной РНК. Отбор поли-А содержащих РНК можно производить с помощью магнитных или целлюлозных бусин, покрытых молекулами олиго-dT праймерами. Вебсайт «The Protocol Online» <ref name="protocolonline">[http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/RNA_Extraction/mRNA_Isolation/index.html RNA Extraction/mRNA Isolation Protocols<!-- Заголовок добавлен ботом -->]</ref> предоставляет список нескольких протоколов, относящихся к выделению мРНК.


==== Удаление рибосомальной РНК ====
==== Удаление рибосомальной РНК ====
Не полиаденилированные РНК, такие как: мРНК [[Прокариоты|прокариот]], фрагменты мРНК, полученные из препаратов зафиксированных в формалин, и транскрипты без поли-А хвостов у эукариот, - зачастую являются объектами исследований. Самая большая трудность в секвенировании таких РНК заключается в необходимости очистить суммарную РНК от [[Рибосомальная РНК|рибосомальной РНК]] (рРНК), которая привалирует в образце. Существует несколько способов элиминации рРНК:
Не полиаденилированные РНК, такие как: мРНК [[Прокариоты|прокариот]], фрагменты мРНК, полученные из препаратов зафиксированных в формалин, и транскрипты без поли-А хвостов у эукариот, - зачастую являются объектами исследований. Самая большая трудность в секвенировании таких РНК заключается в необходимости очистить суммарную РНК от [[Рибосомальная РНК|рибосомальной РНК]] (рРНК), которая привалирует в образце. Существует несколько способов элиминации рРНК:


# Первый подход основан на сиквенс-специфичных пробах, которые могут быть гибридизованы с рРНК. Нежелательные рРНК или их кДНК гибридизуют с биотинилированной ДНК или же с пробами, содержащими "закрытые" нуклеиновые кислоты (locked nucleic acid, LNA),и затем проводят очистку на стрептовидиновых бусах. В другом методе, известном как метод направленной деградации (probe-directed degradation, PDD), рРНК помечаются антисмысловыми олиго-ДНК праймерами и обрабатываются '''[[РНКаза H|РНКазой Н]]'''. В третьем методе из всех кДНК, полученных и с рРНК и с других РНК, делают кольцевые молекулы а затем гибридизуют с пробами, содержащими рРНК. Гибридизованые последовательности расщепляются при последующей обработке '''дуплекс-специфической нуклеазой''' (DSN), которая обладает специфичностью к (дц)ДНК. Последний метод имеет ограничения ввиду необходомости большого кличества РНК.
# Первый подход основан на сиквенс-специфичных пробах, которые могут быть гибридизованы с рРНК. Нежелательные рРНК или их кДНК гибридизуют с биотинилированной ДНК или же с пробами, содержащими "закрытые" нуклеиновые кислоты (locked nucleic acid, LNA),и затем проводят очистку на стрептовидиновых бусах. В другом методе, известном как метод направленной деградации (probe-directed degradation, PDD) <ref>{{Статья|автор=Archer SK, Shirokikh NE, Preiss T.|заглавие=Probe-directed degradation (PDD) for flexible removal of unwanted cDNA sequences from RNA-Seq libraries.|ссылка=|язык=|издание=Curr Protoc Hum Genet.|тип=|год=2015|месяц=|число=|том=|номер=|страницы=|issn=|doi=10.1002/0471142905.hg1115s85}}</ref>, рРНК помечаются антисмысловыми олиго-ДНК праймерами и обрабатываются '''[[РНКаза H|РНКазой Н]]'''. В третьем методе из всех кДНК, полученных и с рРНК и с других РНК, делают кольцевые молекулы а затем гибридизуют с пробами, содержащими рРНК. Гибридизованые последовательности расщепляются при последующей обработке '''дуплекс-специфической нуклеазой''' (DSN), которая обладает специфичностью к (дц)ДНК. Последний метод имеет ограничения ввиду необходомости большого кличества РНК <ref>{{Статья|автор=Archer SK, Shirokikh NE, Preiss T.|заглавие=Selective and flexible depletion of problematic sequences from RNA-seq libraries at the cDNA stage.|ссылка=|язык=|издание=BMC Genomics|тип=|год=2014|месяц=|число=|том=|номер=|страницы=|issn=|doi=10.1186/1471-2164-15-401}}</ref>.
# Другой подход избавления от рРНК основан на использовании специфических праймеров NSR (not-so-random (NSR) primers), которые связываются только с интересующими молекулами РНК во время обратной транскрипции (для получения кДНК). Данный метод, запущенный на рынок под названием Ovation RNA-seq компанией NuGEN, использует гексамерные или гептамерные праймеры, последовательности которых отсутствуют в рРНК. Одним из самых ярких преимуществ данного метода является хорошая работа прймеров NSR в отношении частично деградированной РНК, а также с количественно малыми образцами. Очень часто данный подход используют при изучении транскриптомов прокариот, так как создание библиотеки поли-А в этом случае попросту невозможно.
# Другой подход избавления от рРНК основан на использовании специфических праймеров NSR (not-so-random (NSR) primers), которые связываются только с интересующими молекулами РНК во время обратной транскрипции (для получения кДНК). Данный метод, запущенный на рынок под названием Ovation RNA-seq компанией NuGEN, использует гексамерные или гептамерные праймеры, последовательности которых отсутствуют в рРНК. Одним из самых ярких преимуществ данного метода является хорошая работа прймеров NSR в отношении частично деградированной РНК, а также с количественно малыми образцами. Очень часто данный подход используют при изучении транскриптомов прокариот, так как создание библиотеки поли-А в этом случае попросту невозможно.
# К третьей группе можно отнести методы, которые эксплуатируют некоторые особенности рРНК для их последующего удаления. Так первый метод, СоТ-гибридизация, основан на тепловой денатурации, отжиге и селективной деградации с помощью дуплекс-специфической нуклеазы. Двуцепочечные кДНК, полученные с РНК привалирующей в образце, будут избирательно подвергаться деградации засчет более быстрой кинетики отжига по сравнению с другой РНК, которой в образце намного меньше. Второй метод основан на использовании фермента '''[https://www.lucigen.com/Terminator-5-Phosphate-Dependent-Exonuclease/ TEX]''' (terminator 5'-phosphate exonuclease), которая узнает молекулы РНК, имеющие на 5'-конце монофосфат, как у рРНК и тРНК.
# К третьей группе можно отнести методы, которые эксплуатируют некоторые особенности рРНК для их последующего удаления. Так первый метод, СоТ-гибридизация, основан на тепловой денатурации, отжиге и селективной деградации с помощью дуплекс-специфической нуклеазы. Двуцепочечные кДНК, полученные с РНК привалирующей в образце, будут избирательно подвергаться деградации засчет более быстрой кинетики отжига по сравнению с другой РНК, которой в образце намного меньше. Второй метод основан на использовании фермента '''[https://www.lucigen.com/Terminator-5-Phosphate-Dependent-Exonuclease/ TEX]''' (terminator 5'-phosphate exonuclease), которая узнает молекулы РНК, имеющие на 5'-конце монофосфат, как у рРНК и тРНК.

Версия от 08:44, 4 мая 2019

Секвенирование РНК — определение первичной структуры молекулы РНК. Под этим может подразумеваться как секвенирование мРНК, так и определение последовательности некодирующих РНК. Современное полногеномное секвенирование РНК (RNA-seq) основано на прямом секвенировании фрагментов кДНК[1].

История

Технологическая платформа для быстрого широкомасштабного секвенирования была создана в 2005 году фирмами 454 Life Sciences[2] и Illumina (ранее Solexa)[3] и сначала использовалась для секвенирования геномов. Первые работы по секвенированию транскриптомов появились в 2008 году. В числе первых, были секвенированы транскриптом дрожжей[4], арабидопсиса[5] и мыши[6].

В настоящее время РНК-секвенирование осуществляется в основном с использованием трех инструментальных платформ широкомасштабного секвенирования: Illumina, 454 Life Sciences и SOLiD[7].

В отличие от другого широкомасштабного метода анализа транскриптома — экспрессионных микрочипов, РНК-секвенирование позволяет получать данные о сплайс-вариантах транскриптов, редактировании, однонуклеотидных полиморфизмах, а также химерных генах. Кроме того, РНК-секвенирование позволяет получить абсолютную количественную информацию о представленности различных транскриптов в пробе, в отличие от относительных количественных данных микрочипов[8][9].

Методы

Основные принципы секвенирования РНК

Большинство экспериментов по секвенированию РНК проводятся на оборудовании, которое заточено на секвенирование молекул ДНК. В связи с этим необходимым шагом для секвенирования РНК является создание библиотеки кДНК, полученной из исследуемой тотальной РНК. Каждая кДНК из такой библиотеки представляет собой кусочек кДНК разного размера, фланкированный по обоим краям специальными адаптерами. Наличие адаптеров необходимо для последующей амплификации образцов и секвенирования на определенной платформе. Методы создания библиотек кДНК варьируются в зависимости от конечной цели исследования, типа изучаемой РНК, которая может различаться в размере, последовательности, структурных особенностях а также в концентрации. Основные соображения касательно создания подходящей для конкретного эксперимента библиотеки кДНК включают в себя: 1) получение интересующих молекул РНК; 2) преобразование РНК в кДНК установленного размера; 3) способ присоединения адаптерных последовательностей к краям кДНК для амплификации и секвенирования [10].

Создание библиотеки "поли-А" транскриптов

Секвенирование полиаденилированной РНК находит широкое применение в секвенировании РНК. В эукариотах большая часть белок-кодирующих РНК (мРНК) и длинных некодирующих РНК (>200 п.о.) содержат поли-А хвосты. Наличие поли-А хвоста представляет теххническиие удобства для обогащения поли-А содержащими РНК (1-5% от всей суммарной клеточной РНК) в препарате суммарной клеточной РНК. Отбор поли-А содержащих РНК можно производить с помощью магнитных или целлюлозных бусин, покрытых молекулами олиго-dT праймерами. Вебсайт «The Protocol Online» [11] предоставляет список нескольких протоколов, относящихся к выделению мРНК.

Удаление рибосомальной РНК

Не полиаденилированные РНК, такие как: мРНК прокариот, фрагменты мРНК, полученные из препаратов зафиксированных в формалин, и транскрипты без поли-А хвостов у эукариот, - зачастую являются объектами исследований. Самая большая трудность в секвенировании таких РНК заключается в необходимости очистить суммарную РНК от рибосомальной РНК (рРНК), которая привалирует в образце. Существует несколько способов элиминации рРНК:

  1. Первый подход основан на сиквенс-специфичных пробах, которые могут быть гибридизованы с рРНК. Нежелательные рРНК или их кДНК гибридизуют с биотинилированной ДНК или же с пробами, содержащими "закрытые" нуклеиновые кислоты (locked nucleic acid, LNA),и затем проводят очистку на стрептовидиновых бусах. В другом методе, известном как метод направленной деградации (probe-directed degradation, PDD) [12], рРНК помечаются антисмысловыми олиго-ДНК праймерами и обрабатываются РНКазой Н. В третьем методе из всех кДНК, полученных и с рРНК и с других РНК, делают кольцевые молекулы а затем гибридизуют с пробами, содержащими рРНК. Гибридизованые последовательности расщепляются при последующей обработке дуплекс-специфической нуклеазой (DSN), которая обладает специфичностью к (дц)ДНК. Последний метод имеет ограничения ввиду необходомости большого кличества РНК [13].
  2. Другой подход избавления от рРНК основан на использовании специфических праймеров NSR (not-so-random (NSR) primers), которые связываются только с интересующими молекулами РНК во время обратной транскрипции (для получения кДНК). Данный метод, запущенный на рынок под названием Ovation RNA-seq компанией NuGEN, использует гексамерные или гептамерные праймеры, последовательности которых отсутствуют в рРНК. Одним из самых ярких преимуществ данного метода является хорошая работа прймеров NSR в отношении частично деградированной РНК, а также с количественно малыми образцами. Очень часто данный подход используют при изучении транскриптомов прокариот, так как создание библиотеки поли-А в этом случае попросту невозможно.
  3. К третьей группе можно отнести методы, которые эксплуатируют некоторые особенности рРНК для их последующего удаления. Так первый метод, СоТ-гибридизация, основан на тепловой денатурации, отжиге и селективной деградации с помощью дуплекс-специфической нуклеазы. Двуцепочечные кДНК, полученные с РНК привалирующей в образце, будут избирательно подвергаться деградации засчет более быстрой кинетики отжига по сравнению с другой РНК, которой в образце намного меньше. Второй метод основан на использовании фермента TEX (terminator 5'-phosphate exonuclease), которая узнает молекулы РНК, имеющие на 5'-конце монофосфат, как у рРНК и тРНК.

Фрагментация

После процедуры создания библиотеки "поли-А" транскриптов либо процедуры удаления рРНК, образцы РНК подвергаются фрагментации - обычно перед проведением обратной транскрипции все образцы РНК делаются одинакового размера. Отчасти данное ограничение возникает из-за возможностей секвенирующих платформ. Так например, Illumina позволяет секвенировать образцы размером до 1,500 п.н. В качестве альтернативы можно не фрагментировать РНК, а сначала сделать из нее кДНК, а затем уже полученную кДНК подвергнуть фрагментации.

Адаптеры и направление цепей

В стандартных протоколах по созданию библиотек для секвенирования РНК перед амплификацией и секвенированием к кДНК желаемого размера лигируются ДНК адаптеры. Не смотря на простоту, в данном подходе теряется информация о том, какая из цепей ДНК соответствует смысловой цепи РНК. Особенно это критично в исследованиях для поиска и идентификации антисмысловых и новых видов РНК. В связи с этим разработаны несколько методов, которые позволяют выявить направление цепи молекул РНК в соответствующей библиотеке кДНК.

  1. Первый подход подразумевает присоединение разных адаптеров непосредственно к 5'-коцу и к 3'-концу РНК . Изначально этот метод был создан для секвенирования микроРНК. Сначала у фрагментированной РНК убирается фосфатная группа с 3'-конца, а на 5'-конец наоборот - навешивается. Данная процедура сопровождается последовательным лигированием 5'-аденилированного 3' адаптера с помощью T4 РНК лигазы II и присоединением 5' адаптера с помощью T4 РНК лигазы I. Различие в адаптерах на разных концах РНК сохраняет информацию о ее направлении.
  2. Второй подход основан на включении дУТФ во вторую цепь кДНК . Помеченная цепь может быть деградирована непосредственно перед амплификацией с помощью урацил-ДНК-гликозилазы (uracil DNA glycosylase, UDG) - фермента, который выщепляет урацил из ДНК содержащей дУТФ. Считается, что этот метод наиболее эффективный из всех (ссылка).
  3. Третий подход включает в себя несколько методов. В одном из них производят замену матрицы после отжига на нее случайного гексамерного праймера, содержащего тэг (ссылка). В другом методе (BrAD-seq) в момент временного разделения цепей ДНК вводят последовательность с тэгом (ссылка).

Амплификация и молекулярная маркировка

Перед секвенированием кДНК ее необходимо амплифицировать с помощью ПЦР. Непосредственно перед проведением ПЦР можно ввести молекулярные маркеры - эта процедура особенно актуальна если РНК в образце изначально немного, как например в случае секвенирования транскриптома, полученного из одной клетки (single-cell RNA-seq).

Секвенирование РНК для особых целей

Измерение профиля экспрессии генов с помощью методов, основанных на использовании тэгов

Секвенирование DGE (digital gene expression) - также известный как Tag-seq, метод глубокого секвенирования, преобразованный из SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Как и в SAGE, метод включает в себя: присоединение мРНК за поли-А хвост к бусинам, покрытым поли-Т праймерами, синтез первой и второй цепи кДНК на бусинах, расщепление двуцепочечной кДНК часто щепящим ферментом рестрикции. Оставшийся 3'-конец, который присоединен к бусинам, лигируется со своим адаптером, находящимся на 5'-конце. В адаптере есть сайт узнавания для специфического фермента рестрикции TE (tagging enzyme). TE расщепляет кДНК, в ходе чего образуется короткий тэг длинной 21 п.о., который затем лигируется со следующим адаптером, находящимся на 3'-конце. После кДНК амплифицируется с помощью ПЦР и секвенируется. Так как секвенируется только короткий тэг из целого транскрипта, секвенирование DGE является более экономичным вариантом в сравнении со стандартным секвенированием РНК. Секвенирование DGE сохраняет информацию о направлении цепей. Также этот метод находит широкое применение в случае, если полноразмерный геном или транскриптом организма недоступен для полноразмерного выравнивания с ридами, полученными в ходе секвенирования.

Секвенирование 3'-концов включает в себя целый ряд методов, большинство из которых было специально разработано для поиска альтернативного сплайсинга и сайтов полиаденилирования у эукариот.

Прямое секвенирование РНК

Так как обратная транскрипция РНК с помощью обратной транскриптазы дает большое число ошибок и артефактов, которые могут препятствовать корректному качественному и количественному анализу транскриптов,[14] компанией Helicos была начата разработка технологии мономолекулярного прямого секвенирования РНК (Direct RNA Sequencing, DRSTM). Этот метод предполагает секвенирование РНК массово-параллельным образом, без получения кДНК, лигирования, амплификации и других процедур, которые могут изменить образец.

Проблемы

Основная проблема технологии RNA-seq заключается в том, что априори неизвестно, какому транскрипту соответствует прочитанный фрагмент. Особенно сложно решить данную проблему в случае исследования транскриптома высших эукариот с частым альтернативным сплайсингом и присутствием в геноме большого числа паралогов. Существует два подхода для восстановления транскриптов по прочитанным фрагментам: картирование на геном отдельных прочитанных фрагментов[15] или восстановление структуры транскрипта de novo с последующим картированием полноразмерного транскрипта на геном[16]

Применение

Определение профиля экспрессии генов

Метод секвенирования РНК становится основным методом определения того, какие гены и на каком уровне экспрессируются в клетке. С помощью РНК секвенирования можно определять различия в экспрессии генов на различных стадиях развития организма[17] или в разных тканях[18]. Например, разработан метод локализации in situ последовательностей РНК-транскриптов, с помощью флуоресцентного секвенирования (FISSEQ), который позволяет изучать фенотип клеток и регуляцию активности генов непосредственно в биологическом образце (на срезах тканей)[19][20][21]. Также можно определить транскрипция каких генов изменяется при развитии болезней и рака[22]. В связи с удешевлением методов секвенирования нового поколения появилась возможность определять экспрессию генов у любого человека для диагностики заболеваний. Наряду с секвенированием РНК для измерения профиля экспрессии генов также широко используется кэп-анализ экспрессии генов.

Выявление однонуклеотидных полиморфизмов

РНК-секвенирование позволяет различить транскрипты с отличием в одном нуклеотиде, поэтому может быть использовано как для выявления экспрессируемых однонуклеотидных полиморфизмов в генах, так и для изучения процесса редактирования РНК[23][24]

Определение мест альтернативного сплайсинга

Секвенирование РНК — наиболее удобный способ определения мест альтернативного сплайсинга, а также количественного соотношения различных альтернативных форм транскрипта[25][26]. Другие методы не позволяют картировать места альтернативного сплайсинга на всем протяжении генома.

Также как и определение экспрессии генов, определение соотношения альтернативных форм транскриптов можно проводить на различных стадиях развития организма или в разных тканях.

Поиск некодирующих РНК и малых РНК

РНК секвенирование применяется также и для обнаружения некодирующих РНК.

Изучение редактирования РНК

Редактирование РНК — процесс пост- или ко- транскрипционной модификации рибонуклеотидов в молекуле РНК. В большинстве случаев редактирование РНК приводит к замене аденозина инозином (по результатам анализа редактома РНК китайского мужчины доля подобных событий составила ~93 %[27]); катализаторами указанных изменений являются белки семейства ADAR. В дальнейшем инозин распознаётся клеточной машинерией (например, рибосомой) как гуанозин, что приводит к возникновению различий между закодированной в геноме информацией и её интерпретацией.

Основным методом выявления внесённых изменений является сравнение последовательности нуклеотидов геномной ДНК и соответствующих участков РНК.

По причине слабого развития методов прямого секвенирования РНК необходимой стадией проведения анализа является постановка реакции обратной транскрипции, продуктом которой является кДНК. При выравнивании геномной ДНК и соответствующей кДНК выявляют возникшие замены. Заметим, что при сопоставлении базы данных EST и геномных последовательностей совокупная доля отличий в нуклеотидной последовательности ДНК и кДНК составляет 1-2 процента[28], причём наибольший вклад в изменения вносят ошибки секвенирования[29].

Важным прогностическим признаком обнаружения сайтов редактирования РНК является наличие эволюционно консервативных нуклеотидных последовательностей в окружении места редактирования[30].

Вследствие значительного прогресса в развитии методов массового параллельного секвенирования стало технически возможным проводить расшифровку полного транскриптома исследуемого организма с целью выявления связанных с редактированием РНК событий. Однако в силу генетического разнообразия наличие различий в определенной позиции между последовательностью РНК и референсным геномом не означает присутствия сайта редактирования в этой позиции — идентификация сайтов редактирования РНК подразумевает секвенирование как геномной ДНК, так и кДНК, выделенных из одного и того же организма. Также необходимо принимать во внимание то, что уровни редактирования РНК различаются в разных тканях организма[29].

Для упрощения процедуры идентификации сайтов редактирования РНК предпринимаются попытки разработать программные пакеты, использующие только транскриптомные данные и не требующие секвенирования геномной ДНК. Возможным решением может послужить программное обеспечение GIREMI (Genome-independent Identification of RNA Editing by Mutual Information), которое способно (согласно литературным данным) детектировать сайты редактирования РНК используя исключительно последовательности транскриптов[31].

РНК-секвенирование раковых транскриптомов

РНК-секвенирование широко используется в настоящее время для исследование особенностей транскриптома раковых клеток, в том числе появление химерных транскриптов[32] и раково-специфичных продуктов альтернативного сплайсинга[33].

Детекция гибридных генов

Гибридизация генов происходит из-за различных структурных модификаций в геноме и может быть связана с раком.[34] Возможность анализировать весь транскриптом образца с помощью секвенирования РНК, делает этот метод привлекательным для поиска подобных частых преобразований при раковой трансформации клеток.[35]

ENCODE и modENCODE

Основная статья: ENCODE

Секвенирование РНК является одним из основных методов исследований, проводимых в рамках проектов ENCODE и modENCODE, направленных на создание базы данных элементов генома человека[36] и основных модельных объектов молекулярной биологии[37][38].

См. также

Примечания

  1. ↑ Haas BJ, Zody MC. Advancing RNA-Seq analysis. Nat Biotechnol. 2010 May;28(5):421-3. doi: 10.1038/nbt0510-421.
  2. ↑ Margulies M et al Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. 2005 Sep 15;437(7057):376-80. Epub 2005 Jul 31.
  3. ↑ Simon T Bennett, Colin Barnes, Anthony Cox, Lisa Davies, and Clive Brown Toward the $1000 human genome. Pharmacogenomics, Jun 2005, Vol. 6, No. 4 , Pages 373—382
  4. ↑ Nagalakshmi U, Wang Z, Waern K, Shou C, Raha D, Gerstein M, Snyder M. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 2008 Jun 6;320(5881):1344-9. doi: 10.1126/science.1158441. Epub 2008 May 1.
  5. ↑ Lister R, O’Malley RC, Tonti-Filippini J, Gregory BD, Berry CC, Millar AH, Ecker JR. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 2008 May 2;133(3):523-36. doi: 10.1016/j.cell.2008.03.029.
  6. ↑ Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B. (2008). «Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq». Nature Methods 5 (7): 621—628. doi:10.1038/nmeth.1226. PMID 18516045
  7. ↑ Metzker ML. Sequencing technologies — the next generation. Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46. doi: 10.1038/nrg2626. Epub 2009 Dec 8]
  8. ↑ Marioni JC, Mason CE, Mane SM, Stephens M, Gilad Y. (2008). «RNA-seq: An assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays». Genome Research 18 (9): 1509—1517. doi:10.1101/gr.079558.108. PMC 2527709. PMID 18550803.
  9. ↑ Nookaew I, Papini M, Pornputtapong N, Scalcinati G, Fagerberg L, Uhlén M, Nielsen J. «A comprehensive comparison of RNA-Seq-based transcriptome analysis from reads to differential gene expression and cross-comparison with microarrays: a case study in Saccharomyces cerevisiae». Nucleic Acids Res. 2012 Nov 1;40(20):10084-97. doi: 10.1093/nar/gks804. Epub 2012 Sep 10.
  10. ↑ R. Hrdlickova, M. Toloue, B. Tan. RNA-Seq methods for transcriptome analysis // Wiley Periodicals. — 2016. — doi:10.1002/wrna.1364.
  11. ↑ RNA Extraction/mRNA Isolation Protocols
  12. ↑ Archer SK, Shirokikh NE, Preiss T. Probe-directed degradation (PDD) for flexible removal of unwanted cDNA sequences from RNA-Seq libraries. // Curr Protoc Hum Genet.. — 2015. — doi:10.1002/0471142905.hg1115s85.
  13. ↑ Archer SK, Shirokikh NE, Preiss T. Selective and flexible depletion of problematic sequences from RNA-seq libraries at the cDNA stage. // BMC Genomics. — 2014. — doi:10.1186/1471-2164-15-401.
  14. ↑ Liu D, Graber JH (2006). "Quantitative comparison of EST libraries requires compensation for systematic biases in cDNA generation". BMC Bioinformatics. 7: 77. doi:10.1186/1471-2105-7-77. PMC 1431573. PMID 16503995.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) (ссылка)
  15. ↑ Cole Trapnell, Brian A Williams, Geo Pertea, Ali Mortazavi, Gordon Kwan, Marijke J van Baren, Steven L Salzberg, Barbara J Wold and Lior Pachter (2010). «Transcript assembly and abundance estimation from RNA-Seq reveals thousands of new transcripts and switching among isoforms». Nature Biotechnology 28 (5): 511—515. doi:10.1038/nbt.1621. PMC 3146043. PMID 20436464
  16. ↑ Birol I, Jackman SD, Nielsen CB, Qian JQ, Varhol R, Stazyk G, Morin RD, Zhao Y, Hirst M, Schein JE, Horsman DE, Connors JM, Gascoyne RD, Marra MA, Jones SJ.De novo transcriptome assembly with ABySS.Bioinformatics. 2009 Nov 1;25(21):2872-7.[1]
  17. ↑ Graveley BR, Brooks AN, Carlson JW et al The developmental transcriptome of Drosophila melanogaster. Nature. 2011 Mar 24;471(7339):473-9. doi: 10.1038/nature09715. Epub 2010 Dec 22. PMID 21179090
  18. ↑ Xie L, Weichel B, Ohm JE, Zhang K. An integrative analysis of DNA methylation and RNA-Seq data for human heart, kidney and liver.BMC Syst Biol. 2011 Dec 23;5 Suppl 3:S4. doi: 10.1186/1752-0509-5-S3-S4. Epub 2011 Dec 23. PMID 22784623
  19. ↑ Je Hyuk Lee, Evan R. Daugharthy, Jonathan Scheiman et al. & George M. Church. (February 2014). Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ. Science doi: 10.1126/science.1250212
  20. ↑ Биологи изобрели субклеточное секвенирование РНК
  21. ↑ ТЫСЯЧИ МОЛЕКУЛ РНК ПОЛУЧИЛИ ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ ПРОПИСКУ
  22. ↑ Jakhesara SJ, Koringa PG, Bhatt VD, Shah TM, Vangipuram S, Shah S, Joshi CG. RNA-Seq reveals differentially expressed isoforms and novel splice variants in buccal mucosal cancer.Gene. 2013 Mar 1;516(1):24-32. doi: 10.1016/j.gene.2012.11.079. Epub 2012 Dec 20. PMID 23266631
  23. ↑ Park E, Williams B, Wold BJ, Mortazavi A. «RNA editing in the human ENCODE RNA-seq data».Genome Res. 2012 Sep;22(9):1626-33. doi: 10.1101/gr.134957.111. PMID 22955975
  24. ↑ Peng Z, Cheng Y, Tan BC, Kang L, Tian Z, Zhu Y, Zhang W, Liang Y, Hu X, Tan X, Guo J, Dong Z, Liang Y, Bao L, Wang J. Comprehensive analysis of RNA-Seq data reveals extensive RNA editing in a human transcriptome. Nat Biotechnol. 2012 Feb 12;30(3):253-60. doi: 10.1038/nbt.2122.
  25. ↑ Wang W, Qin Z, Feng Z, Wang X, Zhang X. «Identifying differentially spliced genes from two groups of RNA-seq samples».Gene. 2013 Apr 10;518(1):164-70. doi: 10.1016/j.gene.2012.11.045. Epub 2012 Dec 8. PMID 23228854
  26. ↑ Liu Q, Chen C, Shen E, Zhao F, Sun Z, Wu J. Detection, annotation and visualization of alternative splicing from RNA-Seq data with SplicingViewer. Genomics. 2012 Mar;99(3):178-82. doi: 10.1016/j.ygeno.2011.12.003. Epub 2011 Dec 28. PMID 22226708
  27. ↑ Zhiyu Peng, Yanbing Cheng, Bertrand Chin-Ming Tan, Lin Kang, Zhijian Tian, Yuankun Zhu, Wenwei Zhang, Yu Liang, Xueda Hu, Xuemei Tan, Jing Guo, Zirui Dong, Yan Liang, Li Bao & Jun Wang. Comprehensive analysis of RNA-Seq data reveals extensive RNA editing in a human transcriptome // Nature Biotechnology. — 2012. — № 30. — С. 253–260.
  28. ↑ LaDeana Hillier, Greg Lennon, Michael Becker, M. Fatima Bonaldo, s Brandi Chiapelli, Stephanie Chissoe, Nicole Dietrich, Treasa DuBuque, Anthony Favello, Warren Gish, Maria Hawkins, Monica Hultman, Tamara Kucaba, Michelle Lacy, Maithao Le, Nha Le, Elaine Mardis, Bradley Moore, Matthew Morris, Jeremy Parsons, Christa Prange, Lisa Rifkin, Theresa Rohlfing, Kurt Schellenberg, M. Bento Soares, Fang Tan, Jean Thierry-Meg, Evanne Trevaskis, Karen Underwood, Patricia Wohldman, Robert Waterston, Richard Wilson, and Marco Marra. Generation and Analysis of 280,000 Human Expressed Sequence Tags // GENOME RESEARCH. — 1996. — № 6. — С. 807-828.
  29. ↑ 1 2 Eli Eisenberg, Jin Billy Li, and Erez Y. Levanon. Sequence based identification of RNA editing sites // RNA Biology. — 2010. — № 7:2. — С. 1-5.
  30. ↑ Clutterbuck DR, Leroy A, O'Connell MA, Semple CA. A bioinformatic screen for novel A-I RNA editing sites reveals recoding editing in BC10 // Bioinformatics. — 2005. — № 21(11). — С. 2590-5.
  31. ↑ Zhang Q, Xiao X. Genome sequence-independent identification of RNA editing sites // Nat Methods. — 2015. — № 12(4). — С. 347-50.
  32. ↑ Maher CA, Kumar-Sinha C, Cao X, Kalyana-Sundaram S, Han B, Jing X, Sam L, Barrette T, Palanisamy N, Chinnaiyan AM (January 2009). «Transcriptome Sequencing to Detect Gene Fusions in Cancer». Nature 458 (7234): 97—101. doi:10.1038/nature07638. PMC 2725402. PMID 19136943.
  33. ↑ Feng H, Qin Z, Zhang X. Opportunities and methods for studying alternative splicing in cancer with RNA-Seq. Cancer Lett. 2012 Nov 27. doi: pii: S0304-3835(12)00657-X. 10.1016/j.canlet.2012.11.010. [Epub ahead of print] PMID 23196057
  34. ↑ Teixeira MR (2006). "Recurrent fusion oncogenes in carcinomas". Ciritical Reviews in Oncogenesis. 12 (3—4): 257—271. PMID 17425505.
  35. ↑ Maher CA, Kumar-Sinha C, Cao X, Kalyana-Sundaram S, Han B, Jing X, Sam L, Barrette T, Palanisamy N, Chinnaiyan AM (January 2009). "Transcriptome Sequencing to Detect Gene Fusions in Cancer". Nature. 458 (7234): 97—101. doi:10.1038/nature07638. PMC 2725402. PMID 19136943.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка)
  36. ↑ ENCODE Project Consortium «An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome». Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74. doi: 10.1038/nature11247. PMID 22955616
  37. ↑ Gerstein MB, Lu ZJ, Van Nostrand EL et al «Integrative analysis of the Caenorhabditis elegans genome by the modENCODE project». Science. 2010 Dec 24;330(6012):1775-87. doi: 10.1126/science.1196914. Epub 2010 Dec 22. Erratum in: Science. 2011 Jan 7;331(6013):30. PMID 2117797
  38. ↑ modENCODE Consortium, «Identification of functional elements and regulatory circuits by Drosophila modENCODE». Science. 2010 Dec 24;330(6012):1787-97. doi: 10.1126/science.1198374. Epub 2010 Dec 22.PMID 21177974

Литература

  • Wang Z, Gerstein M, Snyder M. (January 2009). «RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics». Nature Reviews Genetics 10 (1): 57—63. doi:10.1038/nrg2484. PMC 2949280. PMID 19015660.
  • Wilhelm BT, Marguerat S, Watt S, Schubert F, Wood V, Goodhead I, Penkett CJ, Rogers J, Bähler J. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 2008 Jun 26;453(7199):1239-43. doi: 10.1038/nature07002. Epub 2008 May 18.
  • Nookaew I, Papini M, Pornputtapong N, Scalcinati G, Fagerberg L, Uhlén M, Nielsen J. A comprehensive comparison of RNA-Seq-based transcriptome analysis from reads to differential gene expression and cross-comparison with microarrays: a case study in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 2012 Nov 1;40(20):10084-97. doi: 10.1093/nar/gks804. Epub 2012 Sep 10.
  • Trapnell C, Roberts A, Goff L, Pertea G, Kim D, Kelley DR, Pimentel H, Salzberg SL, Rinn JL, Pachter L. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 2012 Mar 1;7(3):562-78. doi: 10.1038/nprot.2012.016.
  • Trapnell C, Williams BA, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G, van Baren MJ, Salzberg SL, Wold BJ, Pachter L. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 2010 May;28(5):511-5. doi: 10.1038/nbt.1621. Epub 2010 May 2.
  • Drewe, P., Stegle, O., Hartmann, L., Kahles, A., Bohnert, R., Wachter, A., … & Rätsch, G. (2013). Accurate detection of differential RNA processing. Nucleic acids research, 41(10), 5189-5198. doi: 10.1093/nar/gkt211
  • Bhargava, V., Ko, P., Willems, E., Mercola, M., & Subramaniam, S. (2013) Quantitative Transcriptomics using Designed Primer-based Amplification. Scientific reports, 3, Article number: 1740 doi:10.1038/srep01740
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Секвенирование_РНК&oldid=99582723