ДНК-микрочип

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Геном мыши(справа) и человека(слева) на ДНК-микрочипах.

ДНК-микрочип или ДНК-чип (англ. DNA microarray) — технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. Современный ДНК-микрочип представляет собой твердую подложку, поделенную на множество участков(вплоть до нескольких десятков тысяч). При этом на каждом участке находится уникальная, точно известная последовательность одноцепочной ДНК в небольшом количестве, порядка нескольких пикомолей вещества на один участок(однако это несколько триллионов молекул). Обычно длина ДНК, находящейся на чипе не велика - от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов. Это могут быть фрагменты генов или же другие участки ДНК, которые могут использоваться для гибридизации сь флуоресцинтно-мечеными опытными образцами. Используются микрочипы преимущественно в одновременном анализе большого числа генов, а также в генотипировании.

Принцип метода[править | править вики-текст]

Комплементарные ДНК образуют дуплекс, которые получается значительно слабее при неполной комплементарности и может быть смыт с чипа. "Хороший" дуплекс будет давать сигнал, в данном случае в виде света.

В основе работы всех микрочипов лежит явление гибридизации между комплементарными ДНК. На чип наносится интересующий образец ДНК, или кДНК, на который заранее наносятся различные метки(например флуоресцентные). В результате комплементарные одноцепочные ДНК образца и чипа образуют прочный дуплекс(при неполной комплементарности дуплекс так же может образовываться, но гораздо менее прочный). Позже, вся некомплементарная ДНК смывается с микрочипа, и при помощи меток можно увидеть с каких участков чипа есть сигнал, а значит произошла гибридизация. Узнав секцию на ДНК-микрочипе где зарегистрирован сигнал можно точно установить последовательность ДНК, которая была в образце и таким образом отыскать соответсвующий необходимый ген, или любой другой интересующий участкок ДНК.

История[править | править вики-текст]

Технология ДНК-микрочипов берёт начало от Саузерн блоттинга — методики, в которой фрагментированную ДНК переносят на подходящий носитель и затем с помощью зонда с известной нуклеотидной последовательностью определяют содержание целевой последовательности в образце. Впервые набор различных ДНК, объединённых в чип, был использован в 1987 году для определения особенностей регуляции экспрессии генов интерферонами[1]. Ранние ДНК-микрочипы были сделаны путём «раскапывания» микроколичеств кДНК на фильтровальную бумагу. Использование миниатюрных чипов для определения особенностей экспрессии генов было осуществлено в 1995 году[2] и полный эукариотический геном (Saccharomyces cerevisiae) был размещён на микрочипе в 1997 году[3].

 Сборка ДНК-микрочипа[править | править вики-текст]

Сборка ДНК-микрочипа
"Печать" ДНК-чипа, выполняемая роботом.

На стеклянные или кремниевые пластинки ковалентно наносятся фрагменты ДНК небольшой длины(от нескольких десятков до тысяч нуклеотидов). Сами же фрагменты ДНК нарабатываются при помощи ПЦР, после чего продукты реакции проходят стадию очистки, после чего могут быть нанесены на пластинку. Размещением различных фрагментов ДНК в точно определенных местах чипа занимается робот, что позволяет наносить на каждое отдельное "пятно", состоящее из одного вида последовательности, всего несколько пикомолей вещества. Это позволяет размещать на небольшого размера пластинках(всего несколько сантиметров по каждой из сторон) тысячи различных ДНК, таким образом, что на один единственный микрочип можно поместить целый геном.

Фотолитография[править | править вики-текст]

Кроме того существует возможность собрать чип без применения амплификации последовательностей и их последующей очистки - фотолитография[4], когда на подложку по очереди наносятся химически модифицированные нереакционноспособные нуклеотиды. При воздействии света, защита снимается и нуклеотид способен присоединить к себе другой нуклеотид, после чего полученная пара вновь должна стать инертной. Для воздействия света на необходимые области используют маски - по сути трафареты, имеющие форму чипа, и микроскопические отверстия в нужных местах. Таким образом используя множество масок, постепенно засвечия и защищая разные области можно постепенно создать чип. Но такая технология применима для создания чипов с относительно небольшими фрагментами ДНК на нем.

Схема эксперимента на ДНК-микрочипах[править | править вики-текст]

Типы микрочипов[править | править вики-текст]

In-situ synthesized[править | править вики-текст]

"Такие микрочипы сделаны с использованием фотолитографии. Процесс выглядит следующим образом: на подложке находятся ковалентные молекулы-линкеры с защитной группой на свободном конце, которая может быть удалена с помощью света. УФ-свет направляется через фотолитографическую маску, снимает защиту и активирует выбранные сайты с гидроксильными группами, которые инициируют сцепление с защищенными нуклеотидами, которые крепятся к активированным сайтам. Маска разработана таким образом, что можно выбрать сайты экспозиции, и, таким образом, определить координаты в массиве, в которых нуклеотид будет прикреплена. Процесс повторяется, применяется новая маска, активизируя различные наборы сайтов и различные основания, позволяющих необходимым ДНК-пробам быть синтезированным на каждом сайте. Каждая проба на чипе требует четыре маски за раунд синтеза: одну маску для синтеза и три другие маски, чтобы предотвратить снятие защиты в том же месте в то время, как добавляются три других три нуклеотида. В среднем, каждая проба длиной в 25 нуклеотидов требует около 100 масок на чип. Такие микрочипы, как правило, используют несколько проб для каждого гена для повышения специфичности и поиска снипов."[5][6]

High-density bead arrays[править | править вики-текст]

«Технология Illumina BeadArray основана на цветокодированных 3-мкм кварцевых бусинах, которые случайным образом распределяются на слайде из кварцевого стекла или субстрате из волоконно-оптических пучков, который собираются в массив. Бусины расположены друг от друга на расстоянии 5.7 мкм и, таким образом, достигается с плотностью упаковки в 40000 элементов массива на квадратный миллиметр. Каждая бусина покрыта сотнями тысяч копий специфической олигонуклеотидной последовательности, с которой гибридизуется анализируемая последовательности. Каждый шарик имеет адрес из 23 олигонуклеотидов и пробу длиной в 50 олигонуклеотидов.

В процессе производства массива бусины случайным образом распределяются по субстрату таким образом, что в каждый массив попадает 50000 бусин. Каждый ген представлен двумя последовательностями проб. Серия декодирующей гибридизации используются, чтобы определить, какие олигонуклеотиды присутствуют в каких координатах для каждого массива.»[5][6]

См. также[править | править вики-текст]

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Kulesh DA, Clive DR, Zarlenga DS, Greene JJ (1987). «Identification of interferon-modulated proliferation-related cDNA sequences». Proc Natl Acad Sci USA 84: 8453–8457. DOI:10.1073/pnas.84.23.8453. PMID 2446323.
  2. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO (1995). «Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray». Science 270: 467–470. DOI:10.1126/science.270.5235.467. PMID 7569999.
  3. Lashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath AF, Gentile C, Hwang SY, Brown PO, Davis RW (1997). «Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis». Proc Natl Acad Sci USA 94: 13057–13062. DOI:10.1073/pnas.94.24.13057. PMID 9371799.
  4. Jory Lietard, Nicole Kretschy, Matej Sack, Alexander S. Wahba, Mark M. Somoza Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography †Electronic supplementary information (ESI) available: Experimental procedures for microarray fabrication, deprotection and cleavage as well as LC-MS conditions and spectra of all array eluates. See DOI: 10.1039/c4cc05771f Click here for additional data file. // Chemical Communications (Cambridge, England). — 2014-11-04. — Т. 50, вып. 85. — С. 12903–12906. — ISSN 1359-7345. — DOI:10.1039/c4cc05771f.
  5. 1 2 Miller, M. B., & Tang, Y.-W. (2009). «Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology.». Clinical Microbiology Reviews 22(4): 611–633. DOI:10.1128/CMR.00019-09.
  6. 1 2 How DNA Microarrays are Built

Литература[править | править вики-текст]

  • Peterson, L.E. (2013) Classification Analysis of DNA Microarrays. John Wiley and Sons. ISBN 978-0-470-17081-6