Криоэлектронная томография

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схема  электронной томографии. Образец наклоняется под разными углами к электронному лучу, в результате "наклона" получаются серии 2D-изображений. Серии изображений с наклоном преобразовываются на компьютере в 3D "томограммы".

Электронная крио-томография (ЭКТ, также  крио-электронная томография, крио-ET или CET) —  способ получения трехмерного изображения с высоким разрешением (~4 нм). Используется для получения изображений  биологических макромолекул и клеток[1].

ЭКТ используется с применением просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), в которой образцы  наклоняются под разными углами к электронному лучу, в результате получаются серии двумерных изображений. Серии двумерных изображений с наклоном обрабатываются на компьютере, в результате получается трёхмерная томограмма.

В отличие от методик, использующих электронную томографию, в данной методике исследуемые образцы замораживают по специальной технологии, так чтобы объект исследования не повредился кристаллами льда, давлением, химическими веществами и прочими факторами. Такая процедура называется криофиксацией. Обычно органический образец охлаждают так, чтобы образовавшийся лёд был аморфным (некристаллическим, т.о. проводят витрификацию)[2], а просвечивание ведётся в криогенных условиях при температурах ниже °С, что препятствует разрушению биологических структур[3].

Описание техники[править | править код]

Пример электронной крио-томографии. На рисунке показана центральная часть томографической реконструкции клетки Bdellovibrio bacteriovorus. Шкала 200 нм.

В электронной микроскопии (ЭМ) образцы находятся в  глубоком вакууме. Такой вакуум неприменим для биологических образцов, так как в клетках закипает вода и они взрываются.  При комнатной температуре в ЭМ образцы  обезвоживают. Другим подходом к стабилизации биологических образцов, является их заморозка (крио-электронная микроскопия). В  крио-электронной микроскопии, образцы (обычно мелкие клетки (например, бактерии или Археи) или вирусы) подготавливают для исследования в обычных водных средах. Образцы  погружают в криоген (обычно жидкий этан), при этом молекулы воды не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. В результате такого охлаждения вода переходит в состояние аморфного льда.[2] При этом  сохраняются  клеточные структуры, такие как липидные мембраны, которые обычно разрушаются при обычном замораживании. Замороженные образцы хранятся при температуре жидкого азота и вода не прогревается настолько, чтобы кристаллизоваться.

Образцы просматриваются в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ). Они наклоняются под разными углами относительно электронного пучка (обычно каждые 1 или 2 градуса примерно от -60° до +60°), получаются изображения под каждым углом. Серия изображений обрабатывается на компьютере и получается трехмерное изображение интересующего объекта[4]. Полученное изображение называется томограммой или томографической реконструкцией.

Особенности[править | править код]

В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) электроны взаимодействуют с материалом образца, поэтому разрешение ограничено его толщиной.  Пробы должны иметь  толщину не менее ~500 нм для достижения “макромолекулярного” разрешение (~4 нм). По этой причине большинство ЭСТ исследований были сосредоточены на изучении очищенных макромолекулярных комплексов, вирусов и мелких клеток, таких как многие виды бактерий и Архей.

Сильное взаимодействие электронов с веществом приводит к эффектам анизотропии.  При наклоне образца электронный луч взаимодействует с относительно большой площадью поперечного сечения. Это приводит к тому, что на практике, углы наклона большие, чем  60—70° не дают много информации и поэтому не используется.

В ЭКТ также применяются  крио-флуоресцентная микроскопия[5],  световая микроскопия (например, крио-Палм[6]) и др. методики. В этих методиках образец, содержащий флуоресцентно-меченый белок  замораживается и просматривается  в световом микроскопе. При этом  образец должен храниться при температурах (ниже -150°С). Флуоресцентный сигнал идентифицируется и образец передается для изучения в крио-ET.

См. также[править | править код]

Примечания[править | править код]

  1. Gan, Lu (2012-02-01). «Electron tomography of cells». Quarterly Reviews of Biophysics 45 (1): 27–56. DOI:10.1017/S0033583511000102. ISSN 1469-8994. PMID 22082691.
  2. 1 2 http://www.nsu.ru/xmlui/bitstream/handle/nsu/589/EM-in-cytology.pdf
  3. Dubochet, J. (1988-05-01). «Cryo-electron microscopy of vitrified specimens». Quarterly Reviews of Biophysics 21 (2): 129–228. DOI:10.1017/s0033583500004297. ISSN 0033-5835. PMID 3043536.
  4. Lučič, Vladan (2013-08-05). «Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ». The Journal of Cell Biology 202 (3): 407–419. DOI:10.1083/jcb.201304193. ISSN 1540-8140. PMID 23918936.
  5. Zhang, Peijun (2013-10-01). «Correlative cryo-electron tomography and optical microscopy of cells». Current Opinion in Structural Biology 23 (5): 763–770. DOI:10.1016/j.sbi.2013.07.017. ISSN 1879-033X. PMID 23962486.
  6. Chang, Yi-Wei (2014-07-01). «Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography». Nature Methods 11 (7): 737–739. DOI:10.1038/nmeth.2961. ISSN 1548-7105. PMID 24813625.

Внешние ссылки[править | править код]