Протеиназа K
| протеиназа К | |
|---|---|
| Обозначения | |
| UniProt | P06873 |
| Другие данные | |
| Шифр КФ | 3.4.21.64 |
 Информация в Викиданных ? | |
Протеиназа K (протеаза K, эндопептидаза K; КФ 3.4.21.64)[1] — сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album (Tritirachium album)[2].
Протеиназа К способна расщеплять кератин, основной белок волос, откуда и получила своё название. Основные участки в пептиде, распознаваемые и гидролизуемые протеиназой, — пептидные связи, соседствующие с карбоксильной группой алифатических и ароматических аминокислот с закрытой альфа-амино-группой. Широко используется благодаря её широкой специфичности.
Структура[править | править код]
Протеиназа К состоит из 384 аминокислот и содержит два сайта связывания ионов Ca2+, которые расположены вблизи активного центра. Для ферментативной активности требует присутствие ионов Ca2+ (1 — 5 mM), однако они не принимают непосредственного участия в каталитической реакции.
Фермент расщепляет белки преимущественно по гидрофобным аминокислотам (алифатические, ароматические и другие гидрофобные аминокислоты). Длительная инкубация белков с протеиназой K, также как и при высокой концентрации фермента, приводит к их полному гидролизу. Удаление ионов Ca2+ снижает стабильность фермента и его каталитическую активность на 80 %, но остаточная активность сохраняется[3], поэтому протеиназу К можно использовать для очистки нуклеиновых кислот от белков в присутствии ЭДТА.
Активность протеиназы К[править | править код]
В молекулярной биологии протеиназа К широко применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК или РНК.
Повышение температуры реакции с 37 °C до 60 °C увеличивает активность протеиназы K в несколько раз, как и при добавление 0,5 — 1 % SDS или гуанидина хлорида (3 M) или гуанидина тиоционата (1 M) или мочевины (4 M)[4]. Так как повышается доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, даже ускоряют их гидролиз.
Протеиназа К работает в широком диапазоне pH (4-12), её оптимум — pH 8.
Температура выше 65 °C или присутствие трихлоруксусной кислоты или сериновых протеаз-ингибиторов AEBSF, PMSF или DFP ингибируют активность.
Протеиназа К не ингибируется в присутствии гуанидина хлорида (до 3 M), гуанидина тиоционата (до 1 M), мочевины (до 4 M), Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, EDTA, цитрат, йодуксусной кислоты, а также в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, как Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) и Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK).
Активность протеиназы К в стандартных буферах
| Буфер (pH 8.0, 50°C, 1.25 мкг/мл протеиназы К, 15 мин инкубации) | Активность протеиназы К (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris·Cl | 100 |
| 30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5 % Tween 20; 0,5 % Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5 % Tween 20; 0,36 % Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,5 % SDS | 128 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1 % Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0,45 % Tween 20; 0,5 % Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0,5 % SDS | 120 |
| 30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1 % SDS | 203 |
Примечания[править | править код]
- ↑ Betzel C., Singh T.P., Visanji M., et al. Structure of the complex of proteinase K with a substrate analogue hexapeptide inhibitor at 2.2-A resolution (англ.) // Journal of Biological Chemistry : journal. — 1993. — July (vol. 268, no. 21). — P. 15854—15858. — PMID 8340410. Архивировано 17 февраля 2016 года.
- ↑ Ebeling W., Hennrich N., Klockow M., Metz H., Orth H.D., Lang H. Proteinase K from Tritirachium album Limber (англ.) // FEBS Journal : journal. — 1974. — Vol. 47, no. 1. — P. 91—97. — doi:10.1111/j.1432-1033.1974.tb03671.x. — PMID 4373242.
- ↑ Müller A., Hinrichs W., Wolf W.M., Saenger W. Crystal structure of calcium-free proteinase K at 1.5-Å resolution (англ.) // Journal of Biological Chemistry : journal. — 1994. — Vol. 269. — P. 23108—23111. — PMID 8083213. Архивировано 18 февраля 2016 года.
- ↑ Hilz H., Wiegers U., Adamietz P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins (англ.) // FEBS Journal : journal. — 1975. — Vol. 56, no. 1. — P. 103—108. — doi:10.1111/j.1432-1033.1975.tb02211.x. — PMID 1236799.