CRISPR: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
[отпатрулированная версия][отпатрулированная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
Нет описания правки
Нет описания правки
Строка 12: Строка 12:
Патогенные и синантропные бактерии содержат большое количество белка [[Cas9]] ({{lang-en|CRISPR-associated 9}}). Было показано, что система CRISPR/Cas может активно участвовать в регуляции эндогенных бактериальных генов, в частности, при взаимодействии бактерий с [[Эукариоты|эукариотическим организмом]], в котором они [[Паразитизм|паразитируют]]. Например, белок Cas9 из ''Francisella novicida'' использует уникальную, CRISPR/Cas-ассоциированную [[Некодирующие РНК|малую РНК]] (scaRNA) для подавления эндогенного [[Транскрипт (биология)|транскрипта]] [[мРНК]], кодирующего бактериальный [[Липопротеины|липопротеин]], что позволяет ей ослабить [[иммунный ответ]] хозяина и повысить её вирулентность<ref>Sampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS.(2013). [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23584588?dopt=Abstract A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence]. Nature; 497(7448), 254—257. {{doi|10.1038/nature12048}}.</ref>.
Патогенные и синантропные бактерии содержат большое количество белка [[Cas9]] ({{lang-en|CRISPR-associated 9}}). Было показано, что система CRISPR/Cas может активно участвовать в регуляции эндогенных бактериальных генов, в частности, при взаимодействии бактерий с [[Эукариоты|эукариотическим организмом]], в котором они [[Паразитизм|паразитируют]]. Например, белок Cas9 из ''Francisella novicida'' использует уникальную, CRISPR/Cas-ассоциированную [[Некодирующие РНК|малую РНК]] (scaRNA) для подавления эндогенного [[Транскрипт (биология)|транскрипта]] [[мРНК]], кодирующего бактериальный [[Липопротеины|липопротеин]], что позволяет ей ослабить [[иммунный ответ]] хозяина и повысить её вирулентность<ref>Sampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS.(2013). [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23584588?dopt=Abstract A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence]. Nature; 497(7448), 254—257. {{doi|10.1038/nature12048}}.</ref>.


== Методы генной инженерии, базирующиеся на системе CRISPR/Cas9 ==
== Применение в генной инженерии ==
До открытия функций и механизмов действия систем CRIPR-Cas в качестве методов для локус-специфичного редактирования генома наиболее интенсивно разрабатывались методы, основанные на использовании нуклеаз, содержащих цинковые пальцы ({{lang-en|Zinc-finger nucleases, ZFNs}}), а также эндонуклеазы TAL. Эти методы довольно трудоёмки, не очень эффективны и дорогостоящи: для каждого нового локуса-мишени требуется разработка, экспрессия и проверка совершенно новой пары полипептидов, что значительно ограничивает область применения этих методов. Системы CRISPR-Cas, напротив, используют белок Cas9, одинаковый для всех локусов-мишеней, а специфичность действия определяется не белком, а crРНК. Методы, основанные на ZFN и TALEN, используются и по сей день и даже являются предпочтительными для клинических исследований, однако простота, эффективность и экономичность методов, использующих систему CRISPR-Cas9, вывели их на первое место среди методов для направленного редактирования генома, а также связывания с ДНК<ref name="br1" />.
Разработаны способы высокоизбирательного активирования<ref>Pablo Perez-Pinera et al.(2013) RNA-Guided Human Gene Activation by CRISPR/Cas9-Based Engineered Transcription Factors. Nature Methods 10, 973—976 doi:10.1038/nmeth.2600</ref> и ингибирования генов<ref>Lei S. Qi, Matthew H. Larson, Luke A. Gilbert, Jennifer A. Doudna, Jonathan S. Weissman, Adam P. Arkin, Wendell A. Lim.(2013) Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell, 152 (5): 1173—1183 DOI:10.1016/j.cell.2013.02.022</ref>, базирующиеся на системе CRISPR/[[Cas9]] (CRISPR-системе II типа)<ref>Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M., and Kim, J.-S (2013) Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. doi:10.1038/nbt.2507</ref><ref>Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819—823</ref><ref>Hwang, W.Y., Fu, Y., Reyon, D., et al. and Joung, J.K. (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. ,doi:10.1038/nbt.2501</ref><ref>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. (2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. ,doi:10.1038/nbt.2508</ref><ref>Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., and Doudna, J. (2013) RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00471.001</ref><ref>Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., et al. and Church, G.M. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823—826.</ref><ref>Wang, H; Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R. (2013) One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 153 (4): 910-8. doi:10.1016/j.cell.2013.04.025.</ref><ref>Houa, Z; Zhangb,Y; Propsona, N; Howdena, S; Chua, L; Sontheimerb, E; and Thomson, J. (2013) Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. PNAS. doi:10.1073/pnas.1313587110</ref>. Основными компонентами CRISPR-системы II типа являются CRISPR-кассета, на основе которой синтезируются направляющие crРНК ({{lang-en|CRISPR RNA}}), [[нуклеаза]] Cas9 (Csn1) и tracrРНК ({{lang-en|trans-activating crRNA}}), необходимая для процессинга направляющей РНК<ref name="Makarova2011" /><ref name="Ran2013">{{Cite pmid|24157548}}</ref><ref>Karvelis, T., Gasiunas, G., Miksys, A., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2013). crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus. RNA biology, 10(5), 20-19</ref>. Для направленного редактирования генома эукариотических клеток используют Cas9 ''[[Streptococcus pyogenes]]'', ''[[Streptococcus thermophilus]]'', ''[[Neisseria meningitidis]]''<ref>Hou, Z., Zhang, Y., Propson, N. E.,et al. & Thomson, J. A. (2013). Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. PNAS, 110(39), 15644-15649 doi: 10.1073/pnas.1313587110</ref><ref>Ines Fonfara, Anaïs Le Rhun, Krzysztof Chylinski, Kira Makarova, Anne-Laure Lécrivain, Janek Bzdrenga, Eugene V. Koonin, Emmanuelle Charpentier (2013) Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research</ref>, а также Cas9 из ''[[Staphylococcus aureus]]'' (SaCas9), которая на 25 % меньше по размерам, что позволяет упаковывать ее в [[Аденоассоциированный вирус|аденоассоциированный вирус (AAV)]] для доставки [[Вектор (молекулярная биология)|вектора]] в клетки живого организма, в качестве терапевтического средства<ref>[http://www.genengnews.com/gen-news-highlights/crispr-clears-major-obstacle-impeding-its-therapeutic-use/81251106/ CRISPR Clears Major Obstacle Impeding Its Therapeutic Use]. GEN News Highlights</ref><ref>F. Ann Ran, Le Cong, Winston X. Yan, et al., & Feng Zhang (2015). [http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14299.html In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9]. Nature. {{doi|10.1038/nature14299}}</ref><ref>[http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/42580/title/Enzyme-Improves-CRISPR/ A smaller Cas9 protein enables in vivo genome engineering via viral vectors]</ref>. Происхождение фермента накладывает некоторые ограничения на выбор ДНК-мишеней: например при использовании Cas9 ''S. pyogenes'' в качестве мишеней можно выбирать только последовательности, за которыми следует 5'-NGG (где N — любой нуклеотид). Перед использованием в генетических конструкциях ген ''Cas9'' должен быть предварительно оптимизирован по используемым [[кодон]]ам в соответствии с организмом, геном которого предполагается модифицировать<ref name="Ran2013" />.


Сущность методов, основанных на CRISPR-Cas9, близка к естественным механизмам действия этих систем: для распознавания последовательности-мишени, которая располагается рядом с PAM, используется РНК, и направляемая ей нуклеаза Cas9 производит двуцепочечный разрыв в сайте-мишени. В эукариотических системах, впрочем, результатом работы CRISPR-Cas9 является не разрушение всей молекулы ДНК, а репарация произведённого Cas9 двуцепочечного разрыва, которая может производиться двумя путями: негомологичного соединения концов ({{lang-en|non-homologous end joining, NHEJ}}) и гомологичной рекомбинации. В результате репарации по пути негомологичного соединения концов часто возникают небольшие вставки или делеции, которые могут разрушить рамку считывания белок-кодирующих генов, что приводит к утрате функции геном-мишенью. Индуцируя множество двуцепочечных разрывов, можно добиться появления крупных делеций и даже инверсий. Репарация по пути гомологичной рекомбинации, напротив, подразумевает замену удалённой последовательности новой последовательностью, комплементарной матрице для репарации, которую создаёт сам исследователь. Таким образом, гомологичная рекомбинация может использоваться для удаления нежелательных мутаций, создания новых аллелей, вставки или слияния функциональных доменов. Кроме того, мутационная инактивация доменов RuvC или HNH Cas9 превращает этот белок в РНК-направляемую никазу, производящую не двуцепочечные, а одноцепочечные разрывы. Инактивация обоих доменов превращает Cas9 в направляемый РНК ДНК-связывающий белок, не разрезающий мишень. В этом случае к ДНК-связывающему домену можно присоединить домен с другими функциями, что, в свою очередь, может вызвать различные изменения в локусе-мишени: активацию или репрессию транскрипции, модификацию хроматина, усиление образования петель и многие другие. Кроме того, инактивированная форма Cas9 (dCas9, «мёртвая» Cas9) служит основой для новых исследовательских приёмов, например, визуализации посредством флуоресценции или создания меток для последующей физической изоляции<ref name="br1" />.
С целью упрощения манипуляций с [[Клонирование (биология)|клонированием]] [[лентивирусы|лентивирусных]] или [[ретровирусы|ретровирусных]] [[Вектор (биология)|векторов]] доставки, crРНК и tracrРНК объединяют в одну цельную РНК (sgРНК) — так называемый «all-in-one CRISPR-Cas9 cloning vector».<ref name="Malina">Malina, A., Mills, J. R., Cencic, R., et al. & Pelletier, J. (2013). Repurposing CRISPR/Cas9 for in situ functional assays. Genes & development, 27(23), 2602—2614. Genes & Dev. . 27:2602-2614 doi:10.1101/gad.227132.113</ref> Это позволяет облегчить конструирование и клонирование серии векторов доставки отличающихся только по пришитой к tracrRNA цепочке «гидРНК», узнающей [[Комплементарность (биология)#Комплементарность нуклеиновых кислот|комплементарную]] ей, последовательность ДНК, выбранную в геноме по заказу исследователя<ref>Heintze, J., Luft, C., & Ketteler, R. (2014).[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3791873/ A CRISPR CASe for high-throughput silencing]. Frontiers in genetics, 4. 193 doi: 10.3389/fgene.2013.00193</ref>.


Несмотря на эффективность использования систем CRISPR-Cas, происхождение Cas9 накладывает некоторые ограничения на выбор ДНК-мишеней: например при использовании Cas9 S. pyogenes в качестве мишеней можно выбирать только последовательности, за которыми следует PAM, а именно 5'-NGG (где N — любой нуклеотид). Впрочем, необходимость в PAM не накладывает серьёзных ограничений на применение систем CRISPR-Cas9: в человеческом геноме такие последовательности встречаются почти каждые 8—12 нуклеотидов. Перед использованием в генетических конструкциях ген Cas9 должен быть предварительно оптимизирован по используемым кодонам в соответствии с организмом, геном которого предполагается модифицировать<ref name="enj13">{{cite pmid|24157548}}</ref>.
Важным условием для широкого использования CRISPR-Cas9 технологии является сведение к минимуму внецелевых мутаций при использовании фермента Cas9. Было предложено множество способов избежать внецелевых мутаций, одним из которых явилась модификация самого фермента Cas9.<ref> Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., et al., & J. Keith Joung (2016). [http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature16526.html High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects]. Nature, {{doi|10.1038/nature16526}}</ref><ref name="zero" />
Разработана также технология самоклонирующейся CRISPR / Cas9, позволяющая вообще обойтись без клонирования, а использовать короткую двухцепочечную ДНК с последовательностью, кодирующей желаемый локус, и [[плазмида|плазмиду]], несущую саморасщепляющуюся палиндромную sgРНК. Это позволяет сократить время на подготовку эксперимента всего до двух часов, а его стоимость уменьшить в шесть раз<ref>Arbab, M., Srinivasan, S., Hashimoto, T., Geijsen, N., & Sherwood, R. I. (2015). [http://www.cell.com/stem-cell-reports/abstract/S2213-6711(15)00284-2 Cloning-free CRISPR]. Stem cell reports, 5(5), 908—917 DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.stemcr.2015.09.022</ref>


В настоящий момент для редактирования генома используют систему CRISPR-Cas II типа, причём чаще всего используется белок SpyCas9 (нуклеаза Cas9 бактерии ''Streptococcus pyogenes''), однако ведётся разработка альтернативных белков Cas9, которые позволят увеличить область применения CRISPR-Cas. Например, укороченные формы Cas9 могут распознавать различные последовательности PAM. Хотя редактирование генома можно эффективно осуществлять с помощью crРНК и tracrРНК, транскрибируемых отдельно, разработка технологии единой направляющей РНК (sgРНК) позволила упростить эту систему. В этом случае четырёхкомпонентная система РНКаза III:crРНК:tracrРНК:Cas9 заменяется двухкомпонентной системой sgРНК:Cas9. В настоящее время sgРНК используется значительно чаще, чем раздельные crРНК и tracrРНК. Наконец, ведутся разработки по улучшению специфичности Cas9 и уменьшению побочных эффектов<ref name="br1" />. В начале 2016 года были опубликованы результаты работы американских исследователей, которым удалось снизить количество ошибок практически до нуля<ref name="zero" />.
Модификация ДНК-связывающего [[Домен белка|домена]] Cas9 и его слияние c различными регуляторными доменами позволяет получить избирательно направляемые на нужные участки генома с помощью РНК-гидов искусственные [[факторы транскрипции]] (crisprTF) и эффекторы<ref>Kearns, N. A., Genga, R. M., Enuameh, M. S.,et al. & Maehr, R. (2014). Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells. Development, 141(1), 219—223.</ref>, искусственные [[эндонуклеазы рестрикции]]<ref>John P Guilinger, David B Thompson & David R Liu (2014). Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nature Biotechnology, {{doi|10.1038/nbt.2909}}</ref><ref>Shengdar Q Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, et al., & J Keith Joung (2014). Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnology,
{{doi|10.1038/nbt.2908}}</ref>, [[Сайленсер|репрессоры]], а также ферменты, модифицирующие [[Эпигенетика|эпигеном]], такие как ДНК-метилазы, деметилазы и гистонацетилтрансферазы, что позволило избирательно регулировать активность определенных генов<ref>Isaac B Hilton, Anthony M D’Ippolito, Christopher M Vockley, Pratiksha I. Thakore, Gregory E Crawford, Timothy E Reddy, Charles A Gersbach.(2015). [http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/full/nbt.3199.html Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers]. Nature Biotechnology, {{DOI|10.1038/nbt.3199}}</ref>. Кроме того найдены аналоги Cas9, которые способны расщеплять вместо ДНК молекулы РНК, что позволит редактировать или избирательно подавлять активность [[микроРНК]]<ref>Mitchell R. O’Connell, Benjamin L. Oakes, Samuel H. Sternberg, Alexandra East-Seletsky, Matias Kaplan, Jennifer A. Doudna. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature, 2014;{{doi|10.1038/nature13769}}</ref><ref>Hale, C. R., Zhao, P., Olson, S.,et al. & Terns, M. P. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell, 139(5), 945—956, doi: 10.1016/j.cell.2009.07.040</ref>.
Так, например, Cas9 из грамотрицательной бактерии ''Francisella novicida'' (FnCas9) может быть перепрограммирован так чтобы нацелить его на РНК геном [[вирус]]а [[Гепатит C|гепатита C]], что приводит к ингибированию синтеза вирусного белка в эукариотических клетках<ref>Aryn A. Price, Timothy R. Sampson, Hannah K. Ratner, Arash Grakoui, and David S. Weiss. Cas9-mediated targeting of viral RNA in eukaryotic cells. PNAS. {{doi|10.1073/pnas.1422340112}}</ref>. На основе этой системы можно создать сотни средств для обороны против различных вирусов.
Метод сайт-селективного редактирования генома с помощью фермента, узнающего необходимую последовательность цепи ДНК «по наводке» [[Комплементарность (биология)|комплементарного]] ей РНК «гида», обещает революционные перемены в исследованиях и лечении целого ряда заболеваний, от рака<ref>Sidi Chen et al., & Feng Zhang, Phillip A. Sharp (2015). [http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(15)00204-4?_returnURL=http%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867415002044%3Fshowall%3Dtrue Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis]. Cell, DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.02.038 </ref> и неизлечимых вирусных болезней до наследственных генетических расстройств вроде серповидноклеточной анемии и синдрома Дауна<ref>Yin, H., Xue, W., Chen, S., Bogorad, R. L., Benedetti, E., Grompe, M., … & Anderson, D. G. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. {{doi|10.1038/nbt.2884}}</ref>. Он позволил удешевить, упростить и ускорить разработку генномодифицированных микроорганизмов<ref>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L.A.(2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. 31, 233—239</ref>, растений<ref>Wenzhi Jiang, Huanbin Zhou, Honghao Bi, Michael Fromm, Bing Yang, and Donald P. Weeks (2013)Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucl. Acids Res. (2013) 41 (20): e188 doi:10.1093/nar/gkt780</ref><ref>Khaoula Belhaj, Angela Chaparro-Garcia, Sophien Kamoun and Vladimir Nekrasov (2013) [http://www.plantmethods.com/content/9/1/39?utm_campaign=25_11_13_plantmethods_Article_Mailing_BMCUp_genetics&utm_content=7390020636&utm_medium=BMCemail&utm_source=Emailvision Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system] Plant Methods , 9:39 doi:10.1186/1746-4811-9-39</ref> и домашнего скота, а также поможет разработке генной терапии наследственных заболеваний у человеческих эмбрионов<ref>Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) [http://www.cell.com/trends/microbiology//retrieve/pii/S0966842X13001789?_returnURL=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0966842X13001789?showall=true#Summary RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing?] Trends in Microbiology, 21(11), 562—567, doi: 10.1016/j.tim.2013.09.001</ref><ref>Uri Ben-David (2013) [http://www.molcelltherapies.com/content/1/1/3 Flowing through the CRISPR-CAScade: Will genome editing boost cell therapies?] Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi:10.1186/2052-8426-1-3</ref>. Так, например, технология, разработанная Editas, позволяет изъять клетку из тела живого организма, заменить определенные участки ДНК, а затем вернуть клетку на прежнее место. Предполагается, что таким образом можно запустить процесс лечения некоторых типов заболеваний<ref>[http://m.geektimes.ru/company/medgadgets/blog/260090/ Билл Гейтс вложил $120 млн в редактирование ДНК]</ref>.


Доставка sgРНК и Cas9 в клетки-мишени может осуществляться различными способами, например, для этого можно использовать плазмиды, кодирующие sgРНК и Cas9. В некоторых случаях оказывается более удобным использовать плазмиды, кодирующие Cas9, а РНК доставлять в виде наработанных с помощью ПЦР ампликонов<ref name="enj13" />.
== Методы исследования, базирующиеся на системе CRISPR/Cas9 ==

Прикрепив [[зелёный флуоресцентный белок]] EGFP к белку [[Cas9]], дефектному по эндонуклеазной активности, можно получить инструмент для визуализации [[геном]]ных последовательностей в живых клетках млекопитающих и визуального определения длины [[теломеры|теломер]] [[хромосома|хромосомы]], а также отслеживать динамику генных [[локус]]ов в течение [[клеточный цикл|клеточного цикла]].<ref>Baohui Chen, Luke A. Gilbert, Beth A. Cimini, et al. & Lei S. Qi, Bo Huang (December 2013) Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. 155(7), 1479—1491 {{doi|10.1016/j.cell.2013.12.001}}</ref>
=== Модификации методов ===
Для направленного редактирования генома эукариотических клеток используют не только Cas9 Streptococcus pyogenes, но и Cas9 ''Streptococcus thermophilus'', ''Neisseria meningitidis''<ref>{{cite pmid|23940360}}</ref><ref>{{cite pmid|24270795}}</ref>, а также Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9), которая на 25 % меньше по размерам, чем SpyCas9, что позволяет упаковывать ее в аденоассоциированный вирус (AAV) для доставки вектора в клетки живого организма в качестве терапевтического средства<ref>{{cite pmid|25830891}}</ref>.

Широкое применение нашла неспособная к разрезанию ДНК форма Cas9 (dCas9). Использование dCas9, сшитой с флуоресцентным белком, лежит в основе нового метода CASFISH (флуоресцентной гибридизации ''in situ'', опосредуемой CRISPR-Cas9), который позволяет флуоресцентно метить локусы-мишени<ref>{{cite pmid|26324940}}</ref>. С помощью такой dCas9 можно отслеживать длину теломер, а также наблюдать за динамикой определённых локусов в ходе клеточного цикла<ref>{{cite pmid|24360272}}</ref>.

dCas9 может использоваться для подавления транскрипции гена-мишени, связываясь с ним в области промотора, регуляторных областей или начала кодирующей области; кроме того, для подавления транскрипции к dCas9 может быть пришит репрессорный пептид. Напротив, dCas9, сшитая с белками-активаторами транскрипции (факторами транскрипции и эффекторами<ref>{{cite pmid|24346702}}</ref>), может активировать транскрипцию гена-мишени. Кроме того, к dCas9 можно пришивать искусственные эндонуклеазы рестрикции, а также ферменты, модифицирующие эпигеном (ДНК-метилазы, деметилазы, гистонацетилтрансферазы) и таким образом регулирующие активность генов-мишеней<ref>{{cite pmid|23849981}}</ref><ref>{{cite pmid|23892895}}</ref><ref>{{cite pmid|25849900}}</ref>.

dCas9 может быть сшита с мономером эндонуклеазы FokI. Димеры FokI могут вносить двуцепочечные разрывы в последовательностях-мишенях. Для направления dCas9, сшитой с мономером FokI, используются две sgРНК, что значительно увеличивает точность системы. Когда два мономера, каждый из которых направляем своей sgРНК, располагаются на расстоянии около 30 пар оснований друг от друга, то FokI димеризуется и вносит двуцепочечный разрыв<ref>{{cite pmid|24770325}}</ref>.

dCas9, несущая определённые эпитопы, может использоваться для очистки локусов, связанных с sgРНК. Таким образом, этот метод представляет собой особый вариант иммунопреципитации хроматина<ref>{{cite pmid|23942116}}</ref>.

Найдены аналоги Cas9, способные расщеплять вместо ДНК молекулы РНК. Применение этих белков позволит редактировать или избирательно подавлять активность микроРНК<ref>{{cite pmid|25274302}}</ref><ref>{{cite pmid|19945378}}</ref>. Cas9 грамотрицательной бактерии ''Francisella novicida'' (FnCas9) может быть перепрограммирована так, чтобы быть нацеленной на РНК-геном вируса гепатита C, что приводит к подавлению жизненного цикла вируса в клетках эукариот. На основе этой системы можно создать сотни средств против различных вирусов<ref>{{cite pmid|25918406}}</ref>.

В 2015 году был предложен новый метод самоклонирующихся CRISPR ({{lang-en|self-cloning CRISPR}}). В клетки вводится плазмида, содержащая самоклонирующуюся палиндромную sgРНК, а также короткая двуцепочечная ДНК, содержащая последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. Когда плазмида транскрибируется, образующаяся sgРНК в комплексе с Cas9 комплементарно связывается с последовательностью в плазмиде, кодирующей эту sgРНК. Cas9 вносит двуцепочечный разрыв, который репарируется путём гомологичной рекомбинации с использованием введённой двуцепочечной ДНК в качестве матрицы. Таким образом, плазмида вновь содержит последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. В отличие от стандартного метода CRISPR, для которого требуется длительная и трудоёмкая наработка специальных плазмид для каждого нового локуса-мишени, метод самоклонирующихся CRISPR позволяет сократить время эксперимента с шести дней до трёх часов и уменьшить его стоимость в шесть раз<ref>{{cite pmid|26527385}}</ref>.

=== Биотехнологическое и биомедицинское значение ===
В настоящее время методы CRISPR-Cas успешно применяются в генной инженерии самых разных организмов: многоклеточных и одноклеточных (дрожжи) эукариот, так и прокариот<ref name="peters15">{{cite pmid|26363124}}</ref><ref name="enj14">{{cite pmid|24592315}}</ref>. Применение CRISPR-Cas у микроорганизмов позволяет модифицировать их метаболические пути, что открывает возможности для развития новых биотехнологических стратегий<ref>{{cite pmid|26707540}}</ref>. CRISPR-Cas успешно применяется для генной инженерии растений, в том числе многих важных сельскохозяйственных культур: риса<ref>{{cite pmid|26617267}}</ref>, сои<ref>{{cite pmid|26603121}}</ref>, пшеницы, сорго, кукурузы, томата<ref>{{cite pmid|26408904}}</ref> и апельсина<ref>{{cite pmid|25437637}}</ref>. Исследуются возможности внедрения систем CRISPR-Cas в культурные растения для создания противовирусного иммунитета<ref>{{cite pmid|26556628}}</ref>. Кроме того, ведутся работы по редактированию геномов с помощью CRISPR-Cas у крупного рогатого скота<ref>{{cite pmid|25596824}}</ref>, свиней<ref>{{cite pmid|26820415}}</ref> и других животных, имеющих важное хозяйственное значение. Технология CRISPR-Cas использовалась для редактирования генома нитчатого грибка ''Aspergillus oryzae'', использующегося в промышленности для сбраживания сои<ref>{{cite pmid|26687199}}</ref>. Наконец, мутагенез с использованием CRISPR-Cas может использоваться в борьбе с инвазивными видами, например, инвазивной мухи ''Drosophila suzukii''<ref>{{cite pmid|26721433}}</ref>.

Методы, основанные на CRISPR-Cas, могут найти применение и в медицине для лечения самых разнообразных заболеваний: вирусных (в том числе ВИЧ-инфекции<ref>{{cite pmid|26787519}}</ref>), онкологических<ref>{{cite pmid|25748654}}</ref><ref>{{cite pmid|26806808}}</ref><ref>{{cite pmid|26787518}}</ref>, а также наследственных расстройств<ref>{{cite pmid|26686765}}</ref>, таких как синдром Дауна, серповидно-клеточная анемия<ref>{{cite pmid|24681508}}</ref>, пигментный ретинит<ref>{{cite pmid|26814166}}</ref>. Редактирование генома малярийного комара с помощью CRISPR-Cas может помочь в борьбе с малярией<ref>{{cite pmid|26809567}}</ref>.


== См. также ==
== См. также ==
Строка 38: Строка 52:


== Примечания ==
== Примечания ==
{{примечания}}
{{примечания|2}}


== Литература ==
== Литература ==

Версия от 17:02, 31 января 2016

Диаграмма, иллюстрирующая возможный механизм CRISPR.

Короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (англ. CRISPR — Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — это прямые повторы и разделяющие их уникальные последовательности в ДНК бактерий и архей, которые совместно с ассоциированными генами (Cas, англ. CRISPR-associated genes) обеспечивают защиту клетки от чужеродных генетических элементов (бактериофагов, плазмид). CRISPR-кассеты обнаружены в геномах многих бактерий и большинства архей[1]. Повторы имеют длину от 24 до 48 пар нуклеотидов; они имеют бивалентную симметрию (англ. dyad symmetry), но, как правило, не являются истинными палиндромами. Повторы разделены вариабельными участками ДНК, спейсерами, примерно одинаковой длины. Спейсеры соответствуют по нуклеотидной последовательности определённым фрагментам ДНК чужеродных генетических элементов (протоспейсерам). В связи с этим было предположено и затем показано, что последовательности, разделяющие повторы, происходят из последовательностей геномов бактериофагов, и, соответственно, обеспечивают защиту клеток от инфекций.

В результате исследований механизма действия CRISPR-системы было сделано предположение, что она является прокариотическим аналогом системы РНК-интерференции эукариот и обеспечивает бактериям и археям защиту от бактериофагов[2].

История

Первый локус CRISPR-cas был обнаружен у Echerichia coli ещё в 1987 году, и в течение последующих 15—20 лет было найдено много других примеров этих необычных последовательностей. Однако об их функциях было известно мало достоверного вплоть до 2005 года, когда три исследовательские группы сообщили, что многие спейсерные последовательности, которые раньше описывались как уникальные, на самом деле соответствовали фрагментам геномов бактериофагов и, реже, других мобильных элементов. В одной из этих работ сообщалось об обратной зависимости заражённости фагами и наличия спейсеров, похожих на фаговые последовательности, что говорит о защитных функциях этой генетической системы. Функция системы CRISPR-Cas как специфичного к последовательностям адаптивного иммунитета была окончательно установлена в 2007 году, а также была установлена необходимость генов cas для выполнения защитной функции. К концу 2008 года было показано, что для работы системы CRISPR необходима особым образом процессированная crРНК, и была показана способность системы CRISPR осуществлять ДНК-интерференцию. Три последних открытия 2007—2008 годов — генетическая интерференция, направляющие РНК и нацеленность против специфических последовательностей ДНК — легли в основу развития основанных на CRISPR методах генетической инженерии. Ряд последующих важных открытий, касающихся устройства систем CRISPR типа II, в частности, о необходимости для её работы белка Cas9 и дополнительной малой РНК помимо crРНК (tracrРНК) позволил в 2012 году опробовать первую искусственно разработанную систему CRISPR типа II. В начале 2013 года с интервалом около двух недель друг от друга несколько групп показали, что искусственные системы CRISPR-Cas могут работать не только в клетках бактерий и in vitro, но и в клетках эукариот, успешно редактируя геном. Последующие два с половиной года происходила тщательная разработка методов CRISPR и применение этого метода в различных группах организмов. В апреле 2015 года группа китайских учёных опубликовала результаты своего исследования, в котором с помощью CRISPR-Cas9 редактировались геномы человеческих эмбрионов. Однако точность редактирования в этом эксперименте, сложно воспринятом научным сообществом[3], была очень низка[4]. В начале 2016 года вышла статья американских учёных, которые сообщали, что смогли понизить количество ошибок при работе CRISPR-Cas9 почти до нуля[5]. К настоящему моменту CRISPR считают наиболее важным технологическим новшеством в науках о жизни со времён изобретения полимеразной цепной реакции (ПЦР), открытой тремя десятилетиями ранее[6].

Роль в генетической регуляции эндогенных бактериальных генов

Патогенные и синантропные бактерии содержат большое количество белка Cas9 (англ. CRISPR-associated 9). Было показано, что система CRISPR/Cas может активно участвовать в регуляции эндогенных бактериальных генов, в частности, при взаимодействии бактерий с эукариотическим организмом, в котором они паразитируют. Например, белок Cas9 из Francisella novicida использует уникальную, CRISPR/Cas-ассоциированную малую РНК (scaRNA) для подавления эндогенного транскрипта мРНК, кодирующего бактериальный липопротеин, что позволяет ей ослабить иммунный ответ хозяина и повысить её вирулентность[7].

Применение в генной инженерии

До открытия функций и механизмов действия систем CRIPR-Cas в качестве методов для локус-специфичного редактирования генома наиболее интенсивно разрабатывались методы, основанные на использовании нуклеаз, содержащих цинковые пальцы (англ. Zinc-finger nucleases, ZFNs), а также эндонуклеазы TAL. Эти методы довольно трудоёмки, не очень эффективны и дорогостоящи: для каждого нового локуса-мишени требуется разработка, экспрессия и проверка совершенно новой пары полипептидов, что значительно ограничивает область применения этих методов. Системы CRISPR-Cas, напротив, используют белок Cas9, одинаковый для всех локусов-мишеней, а специфичность действия определяется не белком, а crРНК. Методы, основанные на ZFN и TALEN, используются и по сей день и даже являются предпочтительными для клинических исследований, однако простота, эффективность и экономичность методов, использующих систему CRISPR-Cas9, вывели их на первое место среди методов для направленного редактирования генома, а также связывания с ДНК[6].

Сущность методов, основанных на CRISPR-Cas9, близка к естественным механизмам действия этих систем: для распознавания последовательности-мишени, которая располагается рядом с PAM, используется РНК, и направляемая ей нуклеаза Cas9 производит двуцепочечный разрыв в сайте-мишени. В эукариотических системах, впрочем, результатом работы CRISPR-Cas9 является не разрушение всей молекулы ДНК, а репарация произведённого Cas9 двуцепочечного разрыва, которая может производиться двумя путями: негомологичного соединения концов (англ. non-homologous end joining, NHEJ) и гомологичной рекомбинации. В результате репарации по пути негомологичного соединения концов часто возникают небольшие вставки или делеции, которые могут разрушить рамку считывания белок-кодирующих генов, что приводит к утрате функции геном-мишенью. Индуцируя множество двуцепочечных разрывов, можно добиться появления крупных делеций и даже инверсий. Репарация по пути гомологичной рекомбинации, напротив, подразумевает замену удалённой последовательности новой последовательностью, комплементарной матрице для репарации, которую создаёт сам исследователь. Таким образом, гомологичная рекомбинация может использоваться для удаления нежелательных мутаций, создания новых аллелей, вставки или слияния функциональных доменов. Кроме того, мутационная инактивация доменов RuvC или HNH Cas9 превращает этот белок в РНК-направляемую никазу, производящую не двуцепочечные, а одноцепочечные разрывы. Инактивация обоих доменов превращает Cas9 в направляемый РНК ДНК-связывающий белок, не разрезающий мишень. В этом случае к ДНК-связывающему домену можно присоединить домен с другими функциями, что, в свою очередь, может вызвать различные изменения в локусе-мишени: активацию или репрессию транскрипции, модификацию хроматина, усиление образования петель и многие другие. Кроме того, инактивированная форма Cas9 (dCas9, «мёртвая» Cas9) служит основой для новых исследовательских приёмов, например, визуализации посредством флуоресценции или создания меток для последующей физической изоляции[6].

Несмотря на эффективность использования систем CRISPR-Cas, происхождение Cas9 накладывает некоторые ограничения на выбор ДНК-мишеней: например при использовании Cas9 S. pyogenes в качестве мишеней можно выбирать только последовательности, за которыми следует PAM, а именно 5'-NGG (где N — любой нуклеотид). Впрочем, необходимость в PAM не накладывает серьёзных ограничений на применение систем CRISPR-Cas9: в человеческом геноме такие последовательности встречаются почти каждые 8—12 нуклеотидов. Перед использованием в генетических конструкциях ген Cas9 должен быть предварительно оптимизирован по используемым кодонам в соответствии с организмом, геном которого предполагается модифицировать[8].

В настоящий момент для редактирования генома используют систему CRISPR-Cas II типа, причём чаще всего используется белок SpyCas9 (нуклеаза Cas9 бактерии Streptococcus pyogenes), однако ведётся разработка альтернативных белков Cas9, которые позволят увеличить область применения CRISPR-Cas. Например, укороченные формы Cas9 могут распознавать различные последовательности PAM. Хотя редактирование генома можно эффективно осуществлять с помощью crРНК и tracrРНК, транскрибируемых отдельно, разработка технологии единой направляющей РНК (sgРНК) позволила упростить эту систему. В этом случае четырёхкомпонентная система РНКаза III:crРНК:tracrРНК:Cas9 заменяется двухкомпонентной системой sgРНК:Cas9. В настоящее время sgРНК используется значительно чаще, чем раздельные crРНК и tracrРНК. Наконец, ведутся разработки по улучшению специфичности Cas9 и уменьшению побочных эффектов[6]. В начале 2016 года были опубликованы результаты работы американских исследователей, которым удалось снизить количество ошибок практически до нуля[5].

Доставка sgРНК и Cas9 в клетки-мишени может осуществляться различными способами, например, для этого можно использовать плазмиды, кодирующие sgРНК и Cas9. В некоторых случаях оказывается более удобным использовать плазмиды, кодирующие Cas9, а РНК доставлять в виде наработанных с помощью ПЦР ампликонов[8].

Модификации методов

Для направленного редактирования генома эукариотических клеток используют не только Cas9 Streptococcus pyogenes, но и Cas9 Streptococcus thermophilus, Neisseria meningitidis[9][10], а также Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9), которая на 25 % меньше по размерам, чем SpyCas9, что позволяет упаковывать ее в аденоассоциированный вирус (AAV) для доставки вектора в клетки живого организма в качестве терапевтического средства[11].

Широкое применение нашла неспособная к разрезанию ДНК форма Cas9 (dCas9). Использование dCas9, сшитой с флуоресцентным белком, лежит в основе нового метода CASFISH (флуоресцентной гибридизации in situ, опосредуемой CRISPR-Cas9), который позволяет флуоресцентно метить локусы-мишени[12]. С помощью такой dCas9 можно отслеживать длину теломер, а также наблюдать за динамикой определённых локусов в ходе клеточного цикла[13].

dCas9 может использоваться для подавления транскрипции гена-мишени, связываясь с ним в области промотора, регуляторных областей или начала кодирующей области; кроме того, для подавления транскрипции к dCas9 может быть пришит репрессорный пептид. Напротив, dCas9, сшитая с белками-активаторами транскрипции (факторами транскрипции и эффекторами[14]), может активировать транскрипцию гена-мишени. Кроме того, к dCas9 можно пришивать искусственные эндонуклеазы рестрикции, а также ферменты, модифицирующие эпигеном (ДНК-метилазы, деметилазы, гистонацетилтрансферазы) и таким образом регулирующие активность генов-мишеней[15][16][17].

dCas9 может быть сшита с мономером эндонуклеазы FokI. Димеры FokI могут вносить двуцепочечные разрывы в последовательностях-мишенях. Для направления dCas9, сшитой с мономером FokI, используются две sgРНК, что значительно увеличивает точность системы. Когда два мономера, каждый из которых направляем своей sgРНК, располагаются на расстоянии около 30 пар оснований друг от друга, то FokI димеризуется и вносит двуцепочечный разрыв[18].

dCas9, несущая определённые эпитопы, может использоваться для очистки локусов, связанных с sgРНК. Таким образом, этот метод представляет собой особый вариант иммунопреципитации хроматина[19].

Найдены аналоги Cas9, способные расщеплять вместо ДНК молекулы РНК. Применение этих белков позволит редактировать или избирательно подавлять активность микроРНК[20][21]. Cas9 грамотрицательной бактерии Francisella novicida (FnCas9) может быть перепрограммирована так, чтобы быть нацеленной на РНК-геном вируса гепатита C, что приводит к подавлению жизненного цикла вируса в клетках эукариот. На основе этой системы можно создать сотни средств против различных вирусов[22].

В 2015 году был предложен новый метод самоклонирующихся CRISPR (англ. self-cloning CRISPR). В клетки вводится плазмида, содержащая самоклонирующуюся палиндромную sgРНК, а также короткая двуцепочечная ДНК, содержащая последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. Когда плазмида транскрибируется, образующаяся sgРНК в комплексе с Cas9 комплементарно связывается с последовательностью в плазмиде, кодирующей эту sgРНК. Cas9 вносит двуцепочечный разрыв, который репарируется путём гомологичной рекомбинации с использованием введённой двуцепочечной ДНК в качестве матрицы. Таким образом, плазмида вновь содержит последовательность, кодирующую требуемую sgРНК. В отличие от стандартного метода CRISPR, для которого требуется длительная и трудоёмкая наработка специальных плазмид для каждого нового локуса-мишени, метод самоклонирующихся CRISPR позволяет сократить время эксперимента с шести дней до трёх часов и уменьшить его стоимость в шесть раз[23].

Биотехнологическое и биомедицинское значение

В настоящее время методы CRISPR-Cas успешно применяются в генной инженерии самых разных организмов: многоклеточных и одноклеточных (дрожжи) эукариот, так и прокариот[24][25]. Применение CRISPR-Cas у микроорганизмов позволяет модифицировать их метаболические пути, что открывает возможности для развития новых биотехнологических стратегий[26]. CRISPR-Cas успешно применяется для генной инженерии растений, в том числе многих важных сельскохозяйственных культур: риса[27], сои[28], пшеницы, сорго, кукурузы, томата[29] и апельсина[30]. Исследуются возможности внедрения систем CRISPR-Cas в культурные растения для создания противовирусного иммунитета[31]. Кроме того, ведутся работы по редактированию геномов с помощью CRISPR-Cas у крупного рогатого скота[32], свиней[33] и других животных, имеющих важное хозяйственное значение. Технология CRISPR-Cas использовалась для редактирования генома нитчатого грибка Aspergillus oryzae, использующегося в промышленности для сбраживания сои[34]. Наконец, мутагенез с использованием CRISPR-Cas может использоваться в борьбе с инвазивными видами, например, инвазивной мухи Drosophila suzukii[35].

Методы, основанные на CRISPR-Cas, могут найти применение и в медицине для лечения самых разнообразных заболеваний: вирусных (в том числе ВИЧ-инфекции[36]), онкологических[37][38][39], а также наследственных расстройств[40], таких как синдром Дауна, серповидно-клеточная анемия[41], пигментный ретинит[42]. Редактирование генома малярийного комара с помощью CRISPR-Cas может помочь в борьбе с малярией[43].

См. также

Примечания

  1. ↑ Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J., Wolf Y. I., Yakunin A. F., van der Oost J., Koonin E. V. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems // Nature reviews. Microbiology. — 2011. — Vol. 9, no. 6. — P. 467—477. — doi:10.1038/nrmicro2577. — PMID 21552286. [исправить]
  2. ↑ Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf and Eugene V. Koonin (2013) Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucl. Acids Res. 41(8): 4360-4377. doi: 10.1093/nar/gkt157
  3. ↑ Nature Reviews: Gene-editing summit supports some research in human embryos.
  4. ↑ Liang Puping, Xu Yanwen, Zhang Xiya, Ding Chenhui, Huang Rui, Zhang Zhen, Lv Jie, Xie Xiaowei, Chen Yuxi, Li Yujing, Sun Ying, Bai Yaofu, Songyang Zhou, Ma Wenbin, Zhou Canquan, Huang Junjiu.  CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes // Protein & Cell. — 2015. — Vol. 6, no. 5. — P. 363—372. — doi:10.1007/s13238-015-0153-5. — PMID 25894090. [исправить]
  5. ↑ 1 2 Slaymaker I. M., Gao Linyi, Zetsche B., Scott D. A., Yan W. X., Zhang Feng.  Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity // Science. — 2016. — Vol. 351, no. 6268. — P. 84—88. — doi:10.1126/science.aad5227. — PMID 26628643. [исправить]
  6. ↑ 1 2 3 4 Sontheimer E. J., Barrangou R.  The Bacterial Origins of the CRISPR Genome-Editing Revolution // Human Gene Therapy. — 2015. — Vol. 26, no. 7. — P. 413—424. — doi:10.1089/hum.2015.091. — PMID 26078042. [исправить]
  7. ↑ Sampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS.(2013). A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature; 497(7448), 254—257. doi:10.1038/nature12048.
  8. ↑ 1 2 Ran F. A., Hsu P. D., Wright J., Agarwala V., Scott D. A., Zhang F.  Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nature Protocols. — 2013. — Vol. 8, no. 11. — P. 2281—2308. — doi:10.1038/nprot.2013.143. — PMID 24157548. [исправить]
  9. ↑ Hou Zhonggang, Zhang Yan, Propson N. E., Howden S. E., Chu Li-Fang, Sontheimer E. J., Thomson J. A.  Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 2013. — Vol. 110, no. 39. — P. 15644—15649. — doi:10.1073/pnas.1313587110. — PMID 23940360. [исправить]
  10. ↑ Fonfara I., Le Rhun A., Chylinski K., Makarova K. S., Lécrivain A. L., Bzdrenga J., Koonin E. V., Charpentier E.  Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems // Nucleic Acids Research. — 2014. — Vol. 42, no. 4. — P. 2577—2590. — doi:10.1093/nar/gkt1074. — PMID 24270795. [исправить]
  11. ↑ Ran F. A., Cong Le, Yan W. X., Scott D. A., Gootenberg J. S., Kriz A. J., Zetsche B., Shalem O., Wu Xuebing, Makarova K. S., Koonin E. V., Sharp P. A., Zhang Feng.  In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9 // Nature. — 2015. — Vol. 520, no. 7546. — P. 186—191. — doi:10.1038/nature14299. — PMID 25830891. [исправить]
  12. ↑ Deng Wulan, Shi Xinghua, Tjian R., Lionnet T., Singer R. H.  CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 2015. — Vol. 112, no. 38. — P. 11870—11875. — doi:10.1073/pnas.1515692112. — PMID 26324940. [исправить]
  13. ↑ Chen Baohui, Gilbert L. A., Cimini B. A., Schnitzbauer J., Zhang Wei, Li Gene-Wei., Park J., Blackburn E. H., Weissman J. S., Qi L. S., Huang Bo.  Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system // Cell. — 2013. — Vol. 155, no. 7. — P. 1479—1491. — doi:10.1016/j.cell.2013.12.001. — PMID 24360272. [исправить]
  14. ↑ Kearns N. A., Genga R. M. J., Enuameh M. S., Garber M., Wolfe S. A., Maehr R.  Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells // Development (Cambridge, England). — 2014. — Vol. 141, no. 1. — P. 219—223. — doi:10.1242/dev.103341. — PMID 24346702. [исправить]
  15. ↑ Gilbert L. A., Larson M. H., Morsut L., Liu Zairan, Brar G. A., Torres S. E., Stern-Ginossar N., Brandman O., Whitehead E. H., Doudna J. A., Lim W. A., Weissman J. S., Qi L. S.  CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes // Cell. — 2013. — Vol. 154, no. 2. — P. 442—451. — doi:10.1016/j.cell.2013.06.044. — PMID 23849981. [исправить]
  16. ↑ Perez-Pinera P., Kocak D. D., Vockley C. M., Adler A. F., Kabadi A. M., Polstein L. R., Thakore P. I., Glass K. A., Ousterout D. G., Leong K. W., Guilak F., Crawford G. E., Reddy T. E., Gersbach C. A.  RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors // Nature Methods. — 2013. — Vol. 10, no. 10. — P. 973—976. — doi:10.1038/nmeth.2600. — PMID 23892895. [исправить]
  17. ↑ Hilton I. B., D'Ippolito A. M., Vockley C. M., Thakore P. I., Crawford G. E., Reddy T. E., Gersbach C. A.  Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers // Nature Biotechnology. — 2015. — Vol. 33, no. 5. — P. 510—517. — doi:10.1038/nbt.3199. — PMID 25849900. [исправить]
  18. ↑ Tsai S. Q., Wyvekens N., Khayter C., Foden J. A., Thapar V., Reyon D., Goodwin M. J., Aryee M. J., Joung J. K.  Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing // Nature Biotechnology. — 2014. — Vol. 32, no. 6. — P. 569—576. — doi:10.1038/nbt.2908. — PMID 24770325. [исправить]
  19. ↑ Fujita T., Fujii H.  Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2013. — Vol. 439, no. 1. — P. 132—136. — doi:10.1016/j.bbrc.2013.08.013. — PMID 23942116. [исправить]
  20. ↑ O'Connell M. R., Oakes B. L., Sternberg S. H., East-Seletsky A., Kaplan M., Doudna J. A.  Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9 // Nature. — 2014. — Vol. 516, no. 7530. — P. 263—266. — doi:10.1038/nature13769. — PMID 25274302. [исправить]
  21. ↑ Hale C. R., Zhao Peng, Olson S., Duff M. O., Graveley B. R., Wells L., Terns R. M., Terns M. P.  RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex // Cell. — 2009. — Vol. 139, no. 5. — P. 945—956. — doi:10.1016/j.cell.2009.07.040. — PMID 19945378. [исправить]
  22. ↑ Price A. A., Sampson T. R., Ratner H. K., Grakoui A., Weiss D. S.  Cas9-mediated targeting of viral RNA in eukaryotic cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 2015. — Vol. 112, no. 19. — P. 6164—6169. — doi:10.1073/pnas.1422340112. — PMID 25918406. [исправить]
  23. ↑ Arbab M., Srinivasan S., Hashimoto T., Geijsen N., Sherwood R. I.  Cloning-free CRISPR // Stem Cell Reports. — 2015. — Vol. 5, no. 5. — P. 908—917. — doi:10.1016/j.stemcr.2015.09.022. — PMID 26527385. [исправить]
  24. ↑ Peters J. M., Silvis M. R., Zhao Dehua, Hawkins J. S., Gross C. A., Qi L. S.  Bacterial CRISPR: accomplishments and prospects // Current Opinion in Microbiology. — 2015. — Vol. 27. — P. 121—126. — doi:10.1016/j.mib.2015.08.007. — PMID 26363124. [исправить]
  25. ↑ Wilkinson R., Wiedenheft B.  A CRISPR method for genome engineering // F1000 Prime Reports. — 2014. — Vol. 6. — P. 3. — doi:10.12703/P6-3. — PMID 24592315. [исправить]
  26. ↑ Jakočiūnas T., Jensen M. K., Keasling J. D.  CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories // Metabolic Engineering. — 2016. — Vol. 34. — P. 44—59. — doi:10.1016/j.ymben.2015.12.003. — PMID 26707540. [исправить]
  27. ↑ Ikeda T., Tanaka W., Mikami M., Endo M., Hirano H.-Y.  Generation of artificial drooping leaf mutants by CRISPR-Cas9 technology in rice // Genes & Genetic Systems. — 2016. — Vol. 90, no. 4. — P. 231—235. — doi:10.1266/ggs.15-00030. — PMID 26617267. [исправить]
  28. ↑ Du Hongyang, Zeng Xuanrui, Zhao Meng, Cui Xiaopei, Wang Qing, Yang Hui, Cheng Hao, Yu Deyue.  Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9 // Journal of Biotechnology. — 2016. — Vol. 217. — P. 90—97. — doi:10.1016/j.jbiotec.2015.11.005. — PMID 26603121. [исправить]
  29. ↑ Ito Y., Nishizawa-Yokoi A., Endo M., Mikami M., Toki S.  CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the RIN locus that regulates tomato fruit ripening // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2015. — Vol. 467, no. 1. — P. 76—82. — doi:10.1016/j.bbrc.2015.09.117. — PMID 26408904. [исправить]
  30. ↑ Belhaj K., Chaparro-Garcia A., Kamoun S., Patron N. J., Nekrasov V.  Editing plant genomes with CRISPR/Cas9 // Current Opinion in Biotechnology. — 2015. — Vol. 32. — P. 76—84. — doi:10.1016/j.copbio.2014.11.007. — PMID 25437637. [исправить]
  31. ↑ Ali Z., Abulfaraj A., Idris A., Ali S., Tashkandi M., Mahfouz M. M.  CRISPR/Cas9-mediated viral interference in plants // Genome Biology. — 2015. — Vol. 16. — P. 238. — doi:10.1186/s13059-015-0799-6. — PMID 26556628. [исправить]
  32. ↑ Wang Zhongde.  Genome engineering in cattle: recent technological advancements // Chromosome Research: an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. — 2015. — Vol. 23, no. 1. — P. 17—29. — doi:10.1007/s10577-014-9452-6. — PMID 25596824. [исправить]
  33. ↑ Niemann H., Petersen B.  The production of multi-transgenic pigs: update and perspectives for xenotransplantation // Transgenic Research. — 2016. — P. 1—14. — doi:10.1007/s11248-016-9934-8. — PMID 26820415. [исправить]
  34. ↑ Katayama T., Tanaka Y., Okabe T., Nakamura H., Fujii W., Kitamoto K., Maruyama J. I.  Development of a genome editing technique using the CRISPR/Cas9 system in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae // Biotechnology Letters. — 2015. — Vol. 38, no. 4. — P. 637—642. — doi:10.1007/s10529-015-2015-x. — PMID 26687199. [исправить]
  35. ↑ Li Fang, Scott M. J.  CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the white and Sex lethal loci in the invasive pest, Drosophila suzukii // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2016. — Vol. 469, no. 4. — P. 911—916. — doi:10.1016/j.bbrc.2015.12.081. — PMID 26721433. [исправить]
  36. ↑ Han Yinglun, Li Qingwei.  Application progress of CRISPR/Cas9 genome editing technology in the treatment of HIV-1 infection // Yi Chuan. — 2016. — Vol. 38, no. 1. — P. 9—16. — doi:10.16288/j.yczz.15-284. — PMID 26787519. [исправить]
  37. ↑ Chen Sidi, Sanjana N. E., Zheng Kaijie, Shalem O., Lee Kyungheon, Shi Xi, Scott D. A., Song Jun, Pan J. Q., Weissleder R., Lee Hakho, Zhang Feng, Sharp P. A.  Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis // Cell. — 2015. — Vol. 160, no. 6. — P. 1246—1260. — doi:10.1016/j.cell.2015.02.038. — PMID 25748654. [исправить]
  38. ↑ Liu Tang, Shen J. K., Li Zhihong, Choy E., Hornicek F. J., Duan Zhenfeng.  Development and potential applications of CRISPR-Cas9 genome editing technology in sarcoma // Cancer Letters. — 2016. — Vol. 373, no. 1. — P. 109—118. — doi:10.1016/j.canlet.2016.01.030. — PMID 26806808. [исправить]
  39. ↑ Wang Dayong, Ma Ning, Hui Yang, Gao Xu.  The application of CRISPR/Cas9 genome editing technology in cancer research // Yi Chuan. — 2016. — Vol. 38, no. 1. — P. 1—8. — doi:10.16288/j.yczz.15-252. — PMID 26787518. [исправить]
  40. ↑ Wojtal D., Kemaladewi D. U., Malam Z., Abdullah S., Wong T. W. Y., Hyatt E., Baghestani Z., Pereira S., Stavropoulos J., Mouly V., Mamchaoui K., Muntoni F., Voit T., Gonorazky H. D., Dowling J. J., Wilson M. D., Mendoza-Londono R., Ivakine E. A., Cohn R. D. Spell Checking Nature: Versatility of CRISPR/Cas9 for Developing Treatments for Inherited Disorders // American Journal of Human Genetics. — 2016. — Vol. 98, no. 1. — P. 90—101. — doi:10.1016/j.ajhg.2015.11.012. — PMID 26686765. [исправить]
  41. ↑ Yin Hao, Xue Wen, Chen Sidi, Bogorad R. L., Benedetti E., Grompe M., Koteliansky V., Sharp P. A., Jacks T., Anderson D. G.  Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype // Nature Biotechnology. — 2014. — Vol. 32, no. 6. — P. 551—553. — doi:10.1038/nbt.2884. — PMID 24681508. [исправить]
  42. ↑ Bassuk A. G., Zheng A., Li Yao, Tsang S. H., Mahajan V. B.  Precision Medicine: Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in Patient-Derived Stem Cells // Scientific Reports. — 2016. — Vol. 6. — P. 19969. — doi:10.1038/srep19969. — PMID 26814166. [исправить]
  43. ↑ McLean K. J., Jacobs-Lorena M.  Genetic Control of Malaria Mosquitoes // Trends in Parasitology. — 2016. — Vol. 32, no. 3. — P. 174—176. — doi:10.1016/j.pt.2016.01.002. — PMID 26809567. [исправить]

Литература

  1. CRISPR-Cas: A Laboratory Manual Edited by Jennifer Doudna, University of California, Berkeley; Prashant Mali, University of California, San Diego
  2. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., & Lundgren, M. (2015). The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and applications. Biochimie. doi:10.1016/j.biochi.2015.03.025
  3. Sampson, T. R. and Weiss, D. S. (2014), Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology. Bioessays, 36: 34-38. doi:10.1002/bies.201300135
  4. Chu, V. T., Weber, T., Wefers, B., Wurst, W., Sander, S., Rajewsky, K., & Kühn, R. (2015). Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nature biotechnology. doi:10.1038/nbt.3198
  5. Ian M. Slaymaker, Linyi Gao, Bernd Zetsche, David A. Scott, Winston X. Yan, and Feng Zhang (2015). "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity". Science: Published online. doi:10.1126/science.aad5227. {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка)
  6. Cong, L., & Zhang, F. (2015). Genome Engineering Using CRISPR-Cas9 System. In Chromosomal Mutagenesis. Methods in Molecular Biology Vol. 1239, 2015, pp 197-217. Springer New York.
  7. Kennedy E.M., Cullen B.R. (2015). Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: A revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology, 479–480, 213–220 doi:10.1016/j.virol.2015.02.024
  8. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., & Nekrasov, V. (2015). Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current opinion in biotechnology, 32, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.11.007
  9. Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century? There’s a bitter fight over the patents for CRISPR, a breakthrough new form of DNA editing.
  10. Sander, J. D.; Joung, J. K. (2014). CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. doi:10.1038/nbt.2842. PMID 24584096.
  11. Kevin Mayer (2014). CRISPR—Fast, Easy … and Increasingly Accurate Genetic Engineering & Biotechnology News.
  12. Terns, R. M.; Terns, M. P. (2014). CRISPR-based technologies: Prokaryotic defense weapons repurposed. Trends in Genetics, 30 (3): 111. doi:10.1016/j.tig.2014.01.003. PMID 24555991.
  13. Edze R. Westra, Angus Buckling & Peter C. Fineran (2014). CRISPR-Cas systems: beyond adaptive immunity. Nature Reviews Microbiology. doi:10.1038/nrmicro3241
  14. Rodolphe Barrangou (2014). "Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution". SCIENCE. 344 (6185): 707–708. doi:10.1126/science.1252964.
  15. Джагаров Д.Э. (2014). "Умные ножницы для ДНК". «Химия и жизнь -XXI век» (7). {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)
  16. Джагаров Д.Э. (2014). "Новый метод генной инженерии - CRISPR/Cas9". Academia.edu. {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)
  17. Джагаров Д.Э. (2015). "Новые методы генной инженерии основанные на использовании системы CRISPR/Cas9". scribd.com. {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)
  18. Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: структура и гипотетические функции. Природа 6 (2014), 16-21;
  19. Гоглева А. А., Артамонова И. И. (2014). CRISPR-системы: механизм действия и применения. Природа 7 (2014), 3-9.
  20. Артамонова И.(2014). CRISPR-системы: иммунизация прокариот «биомолекула.ру»
  21. ELIZABETH PENNISI (2013). "The CRISPR Craze". SCIENCE. 341: 834–836. {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)
  22. Jeffry D Sander & J Keith Joung (2014). "CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.". Nature Biotechnology. doi:10.1038/nbt.2842. {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)
  23. VIDEO: GENESIS™ Precision Genome Editing with CRISPR and rAAV
  24. Timothy R. Sampson and David S. Weiss (2014). "CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology". Front Cell Infect Microbiol. 4: 37. doi:10.3389/fcimb.2014.00037. {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) (ссылка)
  25. Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G (2005). "CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies". Microbiology. 151: 653. doi:10.1099/mic.0.27437-0. PMID 15758212.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка)
  26. Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005). "A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes". PLoS Comput Biol. 1 (6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060. PMID 16292354.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) (ссылка)
  27. Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV (2006). "A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action". Biol Direct. 1: 7. doi:10.1186/1745-6150-1-7. PMID 16545108.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) (ссылка)
  28. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. (2007). "CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes". Science. 315 (5819): 1709. doi:10.1126/science.1138140. PMID 17379808.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка)
  29. Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P (2007). "CRISPR - a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea". Nat Rev Microbiol. 6: 181. doi:10.1038/nrmicro1793. PMID 18157154.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка)
  30. Andersson AF, Banfield JF (2008). "Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities". Science. 320: 1047. doi:10.1126/science.1157358. PMID 18497291.
  31. Brouns SJJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJH, Snijders APL, Dickman MJ, Makarova KS, Koonin EV, Van der Oost J (2008). "Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes". Science. 321: 960. doi:10.1126/science.1159689. PMID 18703739.{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка)
  32. Heidi Ledford (2015). "CRISPR, the disruptor. A powerful gene-editing technology is the biggest game changer to hit biology since PCR. But with its huge potential come pressing concerns". NATURE. 522: 20—24. doi:10.1038/522020a. {{cite journal}}: Внешняя ссылка в |title= (справка)
  33. Tom Lawrenson, Oluwaseyi Shorinola, Nicola Stacey, et al., & Wendy Harwood. (2015). Induction of targeted, heritable mutations in barley and Brassica oleracea using RNA-guided Cas9 nuclease. Genome Biology, 16 (1) doi:10.1186/s13059-015-0826-7

Ссылки

Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=CRISPR&oldid=76137387