Кумасси

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Coomassie Brilliant Blue
Кумасси
Общие
Традиционные названия C.I. 42660, C.I. Acid Blue 83
Brilliant indocyanine 6B, Brillantindocyanin 6B
Brilliant Cyanine 6B, Serva Blue R
Хим. формула C45H44N3NaO7S2 (натриевая соль)
Физические свойства
Молярная масса 825,97 г/моль
Химические свойства
Растворимость в воде нерастворимо в холодной воде, плохо растворимо в горячей воде, растворимо в этаноле
Классификация
Рег. номер CAS 6104-59-2
PubChem 61365
SMILES
Безопасность
H-фразы H201, H202, H235+H410
P-фразы P201
Пиктограммы СГС Пиктограмма "Газовый баллон" согласованной на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ (СГС)Пиктограмма "Взрывающаяся бомба" согласованной на глобальном уровне системы классификации и маркировки химических веществ (СГС)
NFPA 704
NFPA 704.svg
Приводятся данные для стандартных условий (25 °C, 100 кПа), если не указано иначе.

Coomassie Brilliant Blue (кумасси бриллиантовый синий) — название двух близких трифенилметановых красителей, разработанных для текстильной индустрии, но в настоящее время широко используемых в аналитической биохимии для окраски белков. Coomassie Brilliant Blue G-250 отличается от R-250 наличием двух метильных групп. Название «Coomassie» — зарегистрированный товарный знак Imperial Chemical Industries.

Название и история открытия[править | править исходный текст]

Название Кумасси было зарегистрировано в конце 19 века в качестве торговой марки компанией Blackley, для красителей шерсти.[1] В 1896 году в ходе Четвертой Англо-ашантийской войны, войска Великобритании заняли город Coomassie (в настоящее время Кумаси в Гане). В 1918 году компания Levinstein Ltd, владелец торговой марки Кумасси, стала частью компании British Dyestuffs, которая в 1926 году была поглощена компанией Imperial Chemical Industries.[2] В настоящее время компания Imperial Chemical Industries не производит красителей, но остается владельцем торговой марки Coomassie .

Синие красители на основе сернистных производных трифенилметана были впервые получены в 1913 году Максом Вейлером, который работал в городе Вупперталь(Германия).[3][4][5][6]

Статьи в биохимических журналах часто не расшифровывают, какой именно краситель «Coomassie» был использован. Перечень цветов en:Colour Index International содержит более 40 красителей, содержащих термин «Coomassie» в названии. Синий краситель кумасси из перечня Merck Index (10th edition) — Coomassie Blue RL (Acid Blue 92, C.I. 13390) имеет совершенно иную структуру.

Цвет красителя[править | править исходный текст]

Суффикс «R» в названии красителя Coomassie Brilliant Blue R-250 является аббревиатурой от слова Red (красный), так как синий цвет красителя имеет слабый красноватый оттенок. Вариант красителя с суффиксом «G» имеет слабый зеленоватый оттенок. Цифры «250» обозначали чистоту красителя.

Цвет красителей зависит от кислотности среды. Краситель «G» подробно изучен.[7] При pH ниже 0 краситель имеет красную окраску и максимум поглощения на длине 470 нм. При pH около 1 краситель зеленый и максимум поглощения составляет 620 нм. При рН выше 2 краситель ярко-синий, максимум поглощения на 595. При pH 7 краситель имеет коэффициент молярной экстинкции 43,000 M−1см−1.[7]

Изменение окраски раствора соответствует изменению заряда молекулы красителя. В красной форме три атома азота заряжены положительно. Два остатка серной кислоты имеют очень низкий pKa и потому обычно заряжены отрицательно, поэтому при pH близких к нулю, краситель представляет собой катион с суммарным зарядом +1. Зеленый цвет соответствует незаряженной молекуле. При pH 7 лишь атом азота в составе дифениламина имеет положительный заряд, поэтому молекула в целом является анионом с суммарным зарядом −1. Значения pKa, необходимые для потери двух протонов составляют 1,15 и 1,82. Последний протон отрывается в щелочной среде, при этом молекула приобретает розовую окраску (pKa 12,4).[7]

Красители образуют комплекс с анионными детергентами, например, с лаурилсульфатом натрия.[8] Образование такого комплекса стабилизирует зеленый цвет нейтральной формы красителя. Этот эффект может оказывать влияние на определение концентрации при помощи метода Бредфорда. Вероятно, анионные детергенты конкурируют с красителем за связывание с белком.

Использование в биохимии[править | править исходный текст]

Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков в 1964 году.[9] Образцы белков были разделены электрофорезом на листе ацетата целлюлозы. Лист помещали в сульфосалициловую кислоту для фиксации белков и затем переносили в раствор красителя.

В 1965 году Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле.[10] Гель помещали в раствор красителя, содержащий метанол, уксусную кислоту и воду. После окрашивания белков полиакриамидный гель (ПААГ) должен был быть отмыт электрофоретически. Далее было показано, что гель может быть отмыт раствором уксусной кислоты.

Краситель «G» был впервые использован для визуализации белков в полиакриламидном геле в 1967 году, при этом краситель растворяли в растворе уксусной кислоты с метанолом.[11] Позднее было показано, что белковые полосы могут быть окрашены без коллоидного красителя «G», в растворе трихлоруксусной кислоты без метанола. Использование этого проткола не требует отмывания геля.[12] Современные протоколы используют коллоидную форму красителя «G» в растворе, содержащем фосфорную кислоту, этанол (или метанол) и сульфат аммония.[13][14][15][16]

Метод Бредфорда использует спектральные свойства Coomassie Brilliant Blue G-250 для определения количества белка в растворе.[17] Для этого к образцу белка добавляют раствор красителя в фосфорной кислоте и этаноле. В кислых условиях краска имеет коричневый цвет, но при связывании с белком становится синей. Оптическое поглощение раствора измеряют на длине волны 595 нм.

Связывание белка с отрицательно заряженным Coomassie Brilliant Blue G-250 придает белку отрицательный заряд, что может быть использовано при разделении смесей белков в ПААГ в неденатурирующих условиях при помощи метода Blue Native PAGE.[18][19] Подвижность комплекса в полиакриламидном геле зависит от размера белка, белкового комплекса, а также количества красителя, связываемого белком.

Примечания[править | править исходный текст]

  1. Fox M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes. — Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 38.
  2. Fox M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes. — Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 259.
  3. Colour Index. — 3rd. — Bradford: Society of Dyers and Colourists, 1971. — Vol. 4. — P. 4397–4398.
  4. Шаблон:Cite patent
  5. Шаблон:Cite patent
  6. Шаблон:Cite patent
  7. 1 2 3 (1993) «A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G». Analytical Biochemistry 209 (2): 258–266. DOI:10.1006/abio.1993.1117. PMID 7682385.
  8. (1985) «Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay». Analytical Biochemistry 151 (2): 369–374. DOI:10.1016/0003-2697(85)90190-3. PMID 4096375.
  9. (1963) «Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips». Biochimica et Biophysica Acta 71: 377–391. DOI:10.1016/0006-3002(63)91092-8. PMID 18421828.
  10. (1965) «Use of Coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips». Biochimica et Biophysica Acta 107 (1): 144–145. DOI:10.1016/0304-4165(65)90403-4. PMID 4159310.
  11. (1967) «Zone electrophoresis with polyacrylamide gel». Methods in Enzymology 11: 179–186. DOI:10.1016/S0076-6879(67)11019-7.. Page 184 personal communication from W. J. Saphonov.
  12. (1972) «An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue». Analytical Biochemistry 48 (2): 617–620. DOI:10.1016/0003-2697(72)90117-0. PMID 4115985.
  13. (1985) «Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: a systematic analysis». Electrophoresis 6 (9): 427–448. DOI:10.1002/elps.1150060905.
  14. (2004) «Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis». Electrophoresis 25 (9): 1327–1333. DOI:10.1002/elps.200305844. PMID 15174055.
  15. (2009) «Protein gel staining methods: an introduction and overview». Methods in Enzymology 463: 541–563. DOI:10.1016/S0076-6879(09)63031-7. PMID 19892191.
  16. (2010) «CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility». Electrophoresis 31 (4): 593–598. DOI:10.1002/elps.200900481. PMID 20162584.
  17. Bradford, M. M. (1976). «Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding». Analytical Biochemistry 72: 248–254. DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3. PMID 942051.
  18. (1991) «Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form». Analytical Biochemistry 199 (2): 223–231. DOI:10.1016/0003-2697(91)90094-A. PMID 1812789.
  19. (2006) «Blue native PAGE». Nature Protocols 1 (1): 418–428. DOI:10.1038/nprot.2006.62. PMID 17406264.

Литература[править | править исходный текст]

Протоколы[править | править исходный текст]