Саузерн-блот

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к: навигация, поиск
Саузерн-блоттинг

Са́узерн-блот[1], Са́узерн-бло́ттинг[2], бло́ттинг по Са́узерну[2], блот Са́зерна[3], бло́ттинг Са́зерна[3], са́зерн-блот[4], са́зерн-бло́ттинг[3] (от англ. Southern blot) — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. Метод называется по имени изобретателя, английского биолога Эдвина Саузерна[5].

Другие технологии переноса (блота, блоттинга), например вестерн-блот, нозерн-блот, саузвестерн-блот, используют сходные методы, но для определения РНК или белка в образце, и называются по образцу метода, придуманного Саузерном.

Метод[править | править вики-текст]

  1. Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.
  2. Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.
  3. В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 тыс. п. н., перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану.
  4. В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.
  5. Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
  6. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).
  7. Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.
  8. После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путём авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).

Результаты[править | править вики-текст]

Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе.

Применение[править | править вики-текст]

Саузерн-блоттинг, который проводят с геномной ДНК, обработанной эндонуклеазами рестрикции, может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, которая гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.

Примечания[править | править вики-текст]

  1. Заяц Р. Г., Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В., Рачковская И. В.. 7.2.2 Анализ фрагментов ДНК // Медицинская биология и общая генетика : учебник. — 2-е изд., испр. — Минск : Вышэйная школа, 2012. — С. 100. — 496 с. — ISBN 978-985-06-2182-5.
  2. 1 2 Арефьев В. А., Лисовенко Л. А.. Southern-blotting, Southern-transfer // Англо-русский толковый словарь генетических терминов / науч. ред. Л. И. Патрушев. — М., 1995. — ISBN 5-85382-132-6.
  3. 1 2 3 блот Сазерна // Большой энциклопедический словарь медицинских терминов / под ред. проф. Э. Г. Улумбекова. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2012. — С. 220. — 2263 с. — 2000 экз. — ISBN 978-5-9704-2010-2.
  4. Блот: вестерн-, нозерн- и сазерн-блот (blot, western, northern, southern) // Эпидемиологический словарь / под ред. Дж. М. Ласта для Международной эпидемиологической ассоциации; отв. ред. русского изд. В. В. Власов. — 4-е изд. — М. : ОИЗ, 2009. — С. 28, 272. — 316 с.
  5. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J Mol Biol.. — 1975. — DOI:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.

См. также[править | править вики-текст]