Методы секвенирования нового поколения: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
(Показать все непатрулированные изменения)
[непроверенная версия][непроверенная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
исправление cносок
исправление cносок
Строка 1: Строка 1:
'''Секвенирование нового поколения''' (NGS, [[Английский язык|англ.]] ''next generation sequencing'', ''NGS'') — техника определения [[нуклеотидная последовательность|нуклеотидной последовательности]] [[ДНК]] и [[РНК]] для получения формального описания её [[первичная структура|первичной структуры]]. Технология методов [[Секвенирование|секвенирования]] нового поколения позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков [[геном]]а, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. NGS осуществляется с помощью повторяющихся циклов [[Амплификация (молекулярная биология)|удлинения цепи]], индуцированного [[ДНК-полимераза|полимеразой]], или многократного [[Лигаза|лигирования]] [[олигонуклеотид]]ов. В ходе NGS могут генерироваться до сотен [[Спаренные основания|мегабаз]] и [[Спаренные основания|гигабаз]] нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.<ref>{{Статья|ссылка=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19246620/|автор=Voelkerding K.V., Dames S.A., Durtschi J.D.|заглавие=Next-generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics|год=2009|язык=en|издание=Clinical Chemistry|тип=|месяц=02|число=26|том=55|номер=4|страницы=651-658|issn=}}</ref>
'''Секвенирование нового поколения''' (NGS, [[Английский язык|англ.]] ''next generation sequencing'', ''NGS'') — техника определения [[нуклеотидная последовательность|нуклеотидной последовательности]] [[ДНК]] и [[РНК]] для получения формального описания её [[первичная структура|первичной структуры]]. Технология методов [[Секвенирование|секвенирования]] нового поколения позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков [[геном]]а, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. NGS осуществляется с помощью повторяющихся циклов [[Амплификация (молекулярная биология)|удлинения цепи]], индуцированного [[ДНК-полимераза|полимеразой]], или многократного [[Лигаза|лигирования]] [[олигонуклеотид]]ов. В ходе NGS могут генерироваться до сотен [[Спаренные основания|мегабаз]] и [[Спаренные основания|гигабаз]] нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.<ref>{{Статья|ссылка=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19246620/|автор=Voelkerding K.V., Dames S.A., Durtschi J.D.|заглавие=Next-generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics|год=2009|язык=en|издание=Clinical Chemistry|тип=|месяц=02|число=26|том=55|номер=4|страницы=651-658|issn=|doi=10.1373/clinchem.2008.112789}}</ref>


== История секвенирования ==
== История секвенирования ==
[[Файл:Illumina HiSeq 2500.jpg|мини|Секвенатор нового поколения Illumina HiSeq 2500.]]
[[Файл:Illumina HiSeq 2500.jpg|мини|Секвенатор нового поколения Illumina HiSeq 2500.]]
Первая концепция секвенирования была предложена [[Сенгер, Фредерик|Сенгером]] в 1977 году<ref>{{Статья|ссылка=https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1871678409000089|автор=Ansorge W.J.|заглавие=Next-generation DNA sequencing techniques.|год=2009|язык=en|издание=New Biotechnology|тип=|месяц=04|число=|том=25|номер=4|страницы=195-203|issn=}}</ref>. Технология получила название [[метод Сэнгера|«метод обрыва цепи»]]. В том же году Максам и Гилберт предложили альтернативный метод, получивший название «метод химической деградации» — в его основе лежит расщепление меченого по одному концу фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Определение нуклеотидной последовательности проводится методом [[Электрофорез в полиакриламидном геле|электрофореза в полиакриламидном геле]] с последующей [[Авторадиография|авторадиографией]].<ref>{{Статья|ссылка=https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Maxam%E2%80%93Gilbert_sequencing&oldid=915504800|заглавие=Maxam–Gilbert sequencing|год=2019-09-13|язык=en|издание=Wikipedia}}</ref> Необходимость в массовом, качественном и быстром секвенировании стимулировала многочисленные модификации и всевозможные улучшения этих методов. В той или иной степени изменениям подверглись практически все составляющие этого процесса. Переломной точкой развития технологии стало появление [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]] и автоматизация основных этапов «чтения» ДНК, давшие начало методам секвенирования следующего поколения. Платформы для методов нового поколения основываются на распараллеливании процесса «чтения» ДНК, и таким образом за один прогон работы секвенатора можно определить первичные структуры нескольких участков генома. Секвенаторы нового поколения стали значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов [[Спаренные основания#Пара нуклеотидов|пар оснований]], что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.longdom.org/open-access/generations-of-sequencing-technologies-from-first-to-next-generation-0974-8369-1000395.pdf|автор=Kchouk M., Gibrat JF., Elloumi M.|заглавие=Generations of Sequencing Technologies: From First to Next Generation|год=2017|язык=en|издание=Biology and Medicine|тип=|месяц=03|число=06|том=9|номер=3|страницы=|issn=}}</ref>
Первая концепция секвенирования была предложена [[Сенгер, Фредерик|Сенгером]] в 1977 году<ref>{{Статья|ссылка=https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1871678409000089|автор=Ansorge W.J.|заглавие=Next-generation DNA sequencing techniques.|год=2009|язык=en|издание=New Biotechnology|тип=|месяц=04|число=|том=25|номер=4|страницы=195-203|issn=|doi=10.1016/j.nbt.2008.12.009}}</ref>. Технология получила название [[метод Сэнгера|«метод обрыва цепи»]]. В том же году Максам и Гилберт предложили альтернативный метод, получивший название «метод химической деградации» — в его основе лежит расщепление меченого по одному концу фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Определение нуклеотидной последовательности проводится методом [[Электрофорез в полиакриламидном геле|электрофореза в полиакриламидном геле]] с последующей [[Авторадиография|авторадиографией]].<ref>{{Статья|ссылка=https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Maxam%E2%80%93Gilbert_sequencing&oldid=915504800|заглавие=Maxam–Gilbert sequencing|год=2019-09-13|язык=en|издание=Wikipedia}}</ref> Необходимость в массовом, качественном и быстром секвенировании стимулировала многочисленные модификации и всевозможные улучшения этих методов. В той или иной степени изменениям подверглись практически все составляющие этого процесса. Переломной точкой развития технологии стало появление [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]] и автоматизация основных этапов «чтения» ДНК, давшие начало методам секвенирования следующего поколения. Платформы для методов нового поколения основываются на распараллеливании процесса «чтения» ДНК, и таким образом за один прогон работы секвенатора можно определить первичные структуры нескольких участков генома. Секвенаторы нового поколения стали значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов [[Спаренные основания#Пара нуклеотидов|пар оснований]], что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.longdom.org/open-access/generations-of-sequencing-technologies-from-first-to-next-generation-0974-8369-1000395.pdf|автор=Kchouk M., Gibrat JF., Elloumi M.|заглавие=Generations of Sequencing Technologies: From First to Next Generation|год=2017|язык=en|издание=Biology and Medicine|тип=|месяц=03|число=06|том=9|номер=3|страницы=|issn=|doi=10.4172/0974-8369.1000395}}</ref>


== Методы ==
== Методы ==
{| class="wikitable"
{| class="wikitable"
|+
|+
Сравнение различных методов NGS<ref>{{Статья|ссылка=https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-13-341|автор=Quail M.A., Smith M., Coupland P. et al.|заглавие=A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers|год=2012|язык=en|издание=BMC Genomics|тип=|месяц=07|число=24|том=13|номер=341|страницы=|issn=}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/|автор=Liu L.,Li Y., Li S., Hu N., He Y., Pong R., Lin D., Lu L., Law M.|заглавие=Comparison of Next-Generation Sequencing Systems|год=2012|язык=en|издание=Journal of Biomedicine and Biotechnology|тип=|месяц=07|число=05|том=2012|номер=|страницы=|issn=}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.mdpi.com/1999-4915/6/1/106|автор=Barba M., Czosnek H., Hadidi A.|заглавие=Historical Perspective, Development and Applications of Next-Generation Sequencing in Plant Virology|год=2014|язык=en|издание=Viruses|тип=|месяц=01|число=06|том=6|номер=|страницы=106-136|issn=}}</ref>
Сравнение различных методов NGS<ref>{{Статья|ссылка=https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-13-341|автор=Quail M.A., Smith M., Coupland P. et al.|заглавие=A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers|год=2012|язык=en|издание=BMC Genomics|тип=|месяц=07|число=24|том=13|номер=341|страницы=|issn=|doi=10.1186/1471-2164-13-341}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/|автор=Liu L.,Li Y., Li S., Hu N., He Y., Pong R., Lin D., Lu L., Law M.|заглавие=Comparison of Next-Generation Sequencing Systems|год=2012|язык=en|издание=Journal of Biomedicine and Biotechnology|тип=|месяц=07|число=05|том=2012|номер=|страницы=|issn=|doi=10.1155/2012/251364}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.mdpi.com/1999-4915/6/1/106|автор=Barba M., Czosnek H., Hadidi A.|заглавие=Historical Perspective, Development and Applications of Next-Generation Sequencing in Plant Virology|год=2014|язык=en|издание=Viruses|тип=|месяц=01|число=06|том=6|номер=|страницы=106-136|issn=|doi=10.3390/v6010106}}</ref>
|-
|-
!метод ||принцип ||масимальная длина прочтения, пар оснований||стоимость секвенирования 1 млн пар оснований||стоимость секвенатора||время работы за цикл||количество прочтений за цикл||преимущества||недостатки
!метод ||принцип ||масимальная длина прочтения, пар оснований||стоимость секвенирования 1 млн пар оснований||стоимость секвенатора||время работы за цикл||количество прочтений за цикл||преимущества||недостатки
Строка 35: Строка 35:
|количество материала, цена
|количество материала, цена
|-
|-
|MinION Mk1B<ref>{{Cite web|url=http://nanoporetech.com/products/comparison|title=Product comparison|publisher=Oxford Nanopore Technologies|lang=en|accessdate=2020-04-19}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2683588/|автор=Daniel Branton, David W Deamer, Andre Marziali, Hagan Bayley, Steven A Benner|заглавие=The potential and challenges of nanopore sequencing|год=2008-10|издание=Nature biotechnology|том=26|выпуск=10|страницы=1146–1153|issn=1087-0156|doi=10.1038/nbt.1495}}</ref>
|MinION Mk1B<ref>{{Cite web|url=http://nanoporetech.com/products/comparison|title=Product comparison|publisher=Oxford Nanopore Technologies|lang=en|accessdate=2020-04-19}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2683588/|автор=Branton D., Deamer D.W., Marziali A., Bayley H., Benner S.A.|заглавие=The potential and challenges of nanopore sequencing|год=2008-10|язык=|издание=Nature biotechnology|тип=|месяц=|число=|том=26|выпуск=10|номер=|страницы=1146–1153|issn=1087-0156|doi=10.1038/nbt.1495}}</ref>
|изменение силы тока по мере прохождения цепи через нанопору
|изменение силы тока по мере прохождения цепи через нанопору
|длина всей НК, до 2 000 000
|длина всей НК, до 2 000 000
Строка 48: Строка 48:


=== Массивно-параллельное опознавательное секвенирование (MPSS) ===
=== Массивно-параллельное опознавательное секвенирование (MPSS) ===
Массивно-параллельное опознавательное секвенирование ([[Английский язык|англ.]] ''massively parallel signature sequencing'', ''MPSS'') — одна из первых технологий NGS, которая была разработана в 1990-х компанией Lynx Therapeutics для секвенирования [[Матричная РНК|мРНК]] [[Транскрипт (биология)|транскриптов]] и оценки [[Экспрессия генов|генной экспрессии]], основываясь на индивидуальных уровнях мРНК в отдельной клетке.<ref>{{Статья|ссылка=https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Massively_parallel_signature_sequencing&oldid=950373563|заглавие=Massively parallel signature sequencing|год=2020-04-11|язык=en|издание=Wikipedia}}</ref> В методе MPSS транскрипты захватываются на отдельных микрогранулах с матрицей ДНК; мРНК прочитываются гибридизацией с флуоресцентной меткой, а затем удаляются, и так несколько раз подряд. В результате получаются последовательности длиной от 17 до 20 пар оснований (п.о.). Количество транскриптов, показывающих уровень экспрессии, определяется числом транскриптов на миллион молекул. Данный метод не требует идентификации генов перед началом анализа, а его чувствительность — несколько молекул мРНК на клетку.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10835600|автор=S. Brenner, M. Johnson, J. Bridgham, G. Golda, D. H. Lloyd|заглавие=Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays|год=2000-06|издание=Nature Biotechnology|том=18|выпуск=6|страницы=630–634|issn=1087-0156|doi=10.1038/76469}}</ref>[[Файл:Developments in next generation sequencing.jpg|мини|436x436пкс|Развитие методов NGS.]]
Массивно-параллельное опознавательное секвенирование ([[Английский язык|англ.]] ''massively parallel signature sequencing'', ''MPSS'') — одна из первых технологий NGS, которая была разработана в 1990-х компанией Lynx Therapeutics для секвенирования [[Матричная РНК|мРНК]] [[Транскрипт (биология)|транскриптов]] и оценки [[Экспрессия генов|генной экспрессии]], основываясь на индивидуальных уровнях мРНК в отдельной клетке.<ref>{{Статья|ссылка=https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Massively_parallel_signature_sequencing&oldid=950373563|заглавие=Massively parallel signature sequencing|год=2020-04-11|язык=en|издание=Wikipedia}}</ref> В методе MPSS транскрипты захватываются на отдельных микрогранулах с матрицей ДНК; мРНК прочитываются гибридизацией с флуоресцентной меткой, а затем удаляются, и так несколько раз подряд. В результате получаются последовательности длиной от 17 до 20 пар оснований (п.о.). Количество транскриптов, показывающих уровень экспрессии, определяется числом транскриптов на миллион молекул. Данный метод не требует идентификации генов перед началом анализа, а его чувствительность — несколько молекул мРНК на клетку.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10835600|автор=Brenner S., Johnson M., Bridgham J., Golda G., Lloyd D.H.|заглавие=Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays|год=2000-06|язык=|издание=Nature Biotechnology|тип=|месяц=|число=|том=18|выпуск=6|номер=|страницы=630–634|issn=1087-0156|doi=10.1038/76469}}</ref>[[Файл:Developments in next generation sequencing.jpg|мини|436x436пкс|Развитие методов NGS.]]


=== Roche/454 Life Sciences ===
=== Roche/454 Life Sciences ===
Строка 65: Строка 65:


=== Полони-секвенирование ===
=== Полони-секвенирование ===
{{Основная статья|Полони-секвенирование}}Технология NGS без [[Электрофорез ДНК|электрофоретического]] разделения, позволяющая прочитывать миллионы коротких иммобилизованных последовательностей [[ДНК]]. Основная идея метода — генерация большого числа уникальных 'полоний' (молекулярных колоний, сгенерированных полимеразой), которые секвенируются в случайном порядке. Полони-секвенирование проводится для библиотеки парных концевых тэгов (paired-end tags): каждая молекула ДНК имеет длину 135 пар оснований (п.о.), содержит два тэга длиной 17-18 п.о., разделённых и фланкированных общей последовательностью.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12895469|автор=Robi D. Mitra, Jay Shendure, Jerzy Olejnik, null Edyta-Krzymanska-Olejnik, George M. Church|заглавие=Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies|год=2003-09-01|издание=Analytical Biochemistry|том=320|выпуск=1|страницы=55–65|issn=0003-2697|doi=10.1016/s0003-2697(03)00291-4}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16081699|автор=Jay Shendure, Gregory J. Porreca, Nikos B. Reppas, Xiaoxia Lin, John P. McCutcheon|заглавие=Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome|год=2005-09-09|издание=Science (New York, N.Y.)|том=309|выпуск=5741|страницы=1728–1732|issn=1095-9203|doi=10.1126/science.1117389}}</ref>
{{Основная статья|Полони-секвенирование}}Технология NGS без [[Электрофорез ДНК|электрофоретического]] разделения, позволяющая прочитывать миллионы коротких иммобилизованных последовательностей [[ДНК]]. Основная идея метода — генерация большого числа уникальных 'полоний' (молекулярных колоний, сгенерированных полимеразой), которые секвенируются в случайном порядке. Полони-секвенирование проводится для библиотеки парных концевых тэгов (paired-end tags): каждая молекула ДНК имеет длину 135 пар оснований (п.о.), содержит два тэга длиной 17-18 п.о., разделённых и фланкированных общей последовательностью.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12895469|автор=Mitra R.D., Shendure J., Olejnik J., Edyta-Krzymanska-Olejnik, Church J.M.|заглавие=Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies|год=2003-09-01|язык=|издание=Analytical Biochemistry|тип=|месяц=|число=|том=320|выпуск=1|номер=|страницы=55–65|issn=0003-2697|doi=10.1016/s0003-2697(03)00291-4}}</ref><ref>{{Статья|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16081699|автор=Shendure J., Porreca G.J., Reppas N.B., Lin X., McCutcheon J.P.|заглавие=Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome|год=2005-09-09|язык=|издание=Science (New York, N.Y.)|тип=|месяц=|число=|том=309|выпуск=5741|номер=|страницы=1728–1732|issn=1095-9203|doi=10.1126/science.1117389}}</ref>


=== Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences ===
=== Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences ===
{{main|Helicos Biosciences}}
{{main|Helicos Biosciences}}
Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope (Helicos BioSciences) имеет производительность около 1Gb/день. Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим [[Процессинг РНК|полиаденилированием]] на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой.<ref>{{Статья|ссылка=https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13353-011-0057-x|автор=Pareek C.S., Smoczynski R., Tretyn A.|заглавие=Sequencing technologies and genome sequencing.|год=2011|язык=en|издание=J Appl Genetics|тип=|месяц=06|число=23|том=|номер=52|страницы=413-435|issn=}}</ref>
Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope (Helicos BioSciences) имеет производительность около 1Gb/день. Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим [[Процессинг РНК|полиаденилированием]] на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой.<ref>{{Статья|ссылка=https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13353-011-0057-x|автор=Pareek C.S., Smoczynski R., Tretyn A.|заглавие=Sequencing technologies and genome sequencing.|год=2011|язык=en|издание=J Appl Genetics|тип=|месяц=06|число=23|том=|номер=52|страницы=413-435|issn=|doi=10.1007/s13353-011-0057-x}}</ref>


=== DNA nanoball sequencing ===
=== DNA nanoball sequencing ===
[[Файл:BGI DNA nanoball tube to array 2.png|альт=|мини|270x270пкс|Создание наношариков и их прикрепление на субстрат]]
[[Файл:BGI DNA nanoball tube to array 2.png|альт=|мини|270x270пкс|Создание наношариков и их прикрепление на субстрат]]
В данном методе в секвенируемый фрагмент ДНК последовательно вносятся 4 адаптера, благодаря которым в ходе дальнейшей репликации {{Не переведено 5|Phi29 ДНК-полимеразой|||Φ29 DNA polymerase}} [[Репликация по типу катящегося кольца|(rolling circle replication)]] синтезируемая молекула ДНК сворачивается в ДНК-наношарики. Затем, наношарики наносятся на субстрат, имеющий многочисленные поля размером ~300 нм для связывания ДНК, организованные в виде решётки.<ref name=":0">{{Статья|ссылка=https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.1181498|автор=R. Drmanac, A. B. Sparks, M. J. Callow, A. L. Halpern, N. L. Burns|заглавие=Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays|год=2010-01-01|язык=en|издание=Science|том=327|выпуск=5961|страницы=78–81|issn=0036-8075, 1095-9203|doi=10.1126/science.1181498}}</ref> Организация этих полей позволяет уместить больше ДНК на субстрат и увеличить плотность информации в изображении по сравнению со случайным нанесением ДНК на субстрат (например, как в полони-секвенировании).
В данном методе в секвенируемый фрагмент ДНК последовательно вносятся 4 адаптера, благодаря которым в ходе дальнейшей репликации {{Не переведено 5|Phi29 ДНК-полимеразой|||Φ29 DNA polymerase}} [[Репликация по типу катящегося кольца|(rolling circle replication)]] синтезируемая молекула ДНК сворачивается в ДНК-наношарики. Затем, наношарики наносятся на субстрат, имеющий многочисленные поля размером ~300 нм для связывания ДНК, организованные в виде решётки.<ref name=":0">{{Статья|ссылка=https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.1181498|автор=Drmanac R., Sparks A.B. , Callow M.J., Halpern A.L. , Burns N.L.|заглавие=Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays|год=2010-01-01|язык=en|издание=Science|тип=|месяц=|число=|том=327|выпуск=5961|номер=|страницы=78–81|issn=0036-8075, 1095-9203|doi=10.1126/science.1181498}}</ref> Организация этих полей позволяет уместить больше ДНК на субстрат и увеличить плотность информации в изображении по сравнению со случайным нанесением ДНК на субстрат (например, как в полони-секвенировании).


=== cPAL ===
=== cPAL ===
Строка 82: Строка 82:
Метод основан на связи между химической и цифровой информацией; эта технология также называется [[Водородный показатель|рН]]-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать.
Метод основан на связи между химической и цифровой информацией; эта технология также называется [[Водородный показатель|рН]]-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать.


Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать [[транскриптом]]ы, малые РНК, проводить [[ChIP-seq]]. Более того, с его помощью можно изучать геномы микробных сообществ.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nmeth.f.330|автор=Rusk N.|заглавие=Torrents of sequence|год=2011|язык=en|издание=Nat Methods|тип=|месяц=|число=|том=8|номер=44|страницы=|issn=}}</ref>
Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать [[транскриптом]]ы, малые РНК, проводить [[ChIP-seq]]. Более того, с его помощью можно изучать геномы микробных сообществ.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nmeth.f.330|автор=Rusk N.|заглавие=Torrents of sequence|год=2011|язык=en|издание=Nat Methods|тип=|месяц=|число=|том=8|номер=44|страницы=|issn=|doi=10.1038/nmeth.f.330}}</ref>
[[Файл:202001 nanopore sequencing.svg|мини|Изображение процесса генерации электрического сигнала во время прохождения молекулы ДНК через нанопору в методе нанопорового секвенирования.|201x201пкс]]
[[Файл:202001 nanopore sequencing.svg|мини|Изображение процесса генерации электрического сигнала во время прохождения молекулы ДНК через нанопору в методе нанопорового секвенирования.|201x201пкс]]


=== Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences ===
=== Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences ===
{{main|Одномолекулярное секвенирование в реальном времени}}
{{main|Одномолекулярное секвенирование в реальном времени}}
Появление метода одномолекулярного секвенирования в реальном времени ({{lang-en|[[:en:Single molecule real time sequencing|Single molecule real time sequencing]]}}, SMRT) дало возможность наблюдать за работой ДНК-полимеразы, наращивающей синтезируемую цепь, в реальном времени. Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности фрагментов геномной ДНК с лигированными к их концам специфическими ДНК-адаптерами, необходимыми для последующего секвенирования. Смысл SMRT-секвенирования схож с описанными ранее методами NGS — ДНК-полимераза достраивает вторую цепь исследуемой молекулы ДНК, используя нуклеотиды, меченные различными флуоресцентными метками, которые регистрируют при помощи [[Конфокальная микроскопия|конфокальной микроскопии]] высокого разрешения.<ref>{{Статья|ссылка=https://science.sciencemag.org/content/323/5910/133.long|автор=Eid J., Fehr A., Gray J., Luong K., Lyle J., et al.|заглавие=Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules|год=2009|язык=|издание=Science|тип=|месяц=01|число=02|том=323|номер=5910|страницы=133-138|issn=}}</ref>
Появление метода одномолекулярного секвенирования в реальном времени ({{lang-en|[[:en:Single molecule real time sequencing|Single molecule real time sequencing]]}}, SMRT) дало возможность наблюдать за работой ДНК-полимеразы, наращивающей синтезируемую цепь, в реальном времени. Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности фрагментов геномной ДНК с лигированными к их концам специфическими ДНК-адаптерами, необходимыми для последующего секвенирования. Смысл SMRT-секвенирования схож с описанными ранее методами NGS — ДНК-полимераза достраивает вторую цепь исследуемой молекулы ДНК, используя нуклеотиды, меченные различными флуоресцентными метками, которые регистрируют при помощи [[Конфокальная микроскопия|конфокальной микроскопии]] высокого разрешения.<ref>{{Статья|ссылка=https://science.sciencemag.org/content/323/5910/133.long|автор=Eid J., Fehr A., Gray J., Luong K., Lyle J., et al.|заглавие=Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules|год=2009|язык=|издание=Science|тип=|месяц=01|число=02|том=323|номер=5910|страницы=133-138|issn=|doi=10.1126/science.1162986}}</ref>


=== Нанопоровое секвенирование ===
=== Нанопоровое секвенирование ===
{{main|Нанопоровое секвенирование}}
{{main|Нанопоровое секвенирование}}
Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей [[Липидная мембрана на подложке|мембране]]. При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nbt0412-295|автор=Eisenstein, M.|заглавие=Oxford Nanopore announcement sets sequencing sector abuzz.|год=2012|язык=en|издание=Nat Biotechnol|тип=|месяц=|число=|том=30|номер=|страницы=295-296|issn=|doi=10.1038/nbt0412-295}}</ref>
Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей [[Липидная мембрана на подложке|мембране]]. При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nbt0412-295|автор=Eisenstein M.|заглавие=Oxford Nanopore announcement sets sequencing sector abuzz.|год=2012|язык=en|издание=Nat Biotechnol|тип=|месяц=|число=|том=30|номер=|страницы=295-296|issn=|doi=10.1038/nbt0412-295}}</ref>


== Применение секвенирования нового поколения ==
== Применение секвенирования нового поколения ==
Быстрота и дешевизна методов NGS, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря NGS появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nbt1486|автор=Shendure J., Ji H.|заглавие=Next-generation DNA sequencing.|год=2008|язык=en|издание=Nature Biotechnologies|тип=|месяц=10|число=09|том=|номер=26|страницы=1135-1145|issn=}}</ref>.
Быстрота и дешевизна методов NGS, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря NGS появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nbt1486|автор=Shendure J., Ji H.|заглавие=Next-generation DNA sequencing.|год=2008|язык=en|издание=Nature Biotechnologies|тип=|месяц=10|число=09|том=|номер=26|страницы=1135-1145|issn=|doi=10.1038/nbt1486}}</ref>.


=== ChiP-seq ===
=== ChiP-seq ===
Строка 116: Строка 116:
=== Секвенирование транскриптома ===
=== Секвенирование транскриптома ===
{{main|Секвенирование РНК}}
{{main|Секвенирование РНК}}
На основе NGS создан новый подход [[Секвенирование РНК|РНК-секвенирования]] (RNA-seq)<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nrg2626|автор=Metzker M.|заглавие=Sequencing technologies — the next generation.|год=2010|язык=en|издание=Nature Reviews Genetics|тип=|месяц=|число=|том=|номер=11|страницы=31-46|issn=}}</ref> для картирования и подсчёта транскриптов в биологических образцах. У этого метода есть преимущества над используемым ранее методом [[ДНК-микрочип]]ов. Например, ДНК-чипы зависят от перекрытия геномных последовательностей, в то время как RNA-seq позволяет охарактеризовать [[транскрипция (биология)|транскрипцию]] без предварительного знания места начала транскрипции.
На основе NGS создан новый подход [[Секвенирование РНК|РНК-секвенирования]] (RNA-seq)<ref>{{Статья|ссылка=https://www.nature.com/articles/nrg2626|автор=Metzker M.|заглавие=Sequencing technologies — the next generation.|год=2010|язык=en|издание=Nature Reviews Genetics|тип=|месяц=|число=|том=|номер=11|страницы=31-46|issn=|doi=10.1038/nrg2626}}</ref> для картирования и подсчёта транскриптов в биологических образцах. У этого метода есть преимущества над используемым ранее методом [[ДНК-микрочип]]ов. Например, ДНК-чипы зависят от перекрытия геномных последовательностей, в то время как RNA-seq позволяет охарактеризовать [[транскрипция (биология)|транскрипцию]] без предварительного знания места начала транскрипции.


=== Перспективы применения секвенирования в медицине ===
=== Перспективы применения секвенирования в медицине ===
В недалёком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их для идентификации мишеней для лекарственной терапии онкологических больных. Уже в 2013 году анализ по технологии секвенирования следующего поколения от момента биопсии до завершения NGS занимал менее 100 дней. Столько же времени занимает секвенирование всего генома (whole genome sequencing, WGS) и секвенирование всего транскриптома (whole transcriptome sequencing, WTS)<ref>{{Статья|ссылка=https://journals.plos.org/plosone/article/related?id=10.1371/journal.pone.0076438|автор=Weiss G. J., Liang W. S., Demeure M. J., Kiefer J. A., Hostetter G. et al.|заглавие=A Pilot Study Using Next-Generation Sequencing in Advanced Cancers: Feasibility and Challenges.|год=2013|язык=en|издание=PLoS ONE|тип=|месяц=10|число=30|том=8|номер=10|страницы=|issn=}}</ref>.
В недалёком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их для идентификации мишеней для лекарственной терапии онкологических больных. Уже в 2013 году анализ по технологии секвенирования следующего поколения от момента биопсии до завершения NGS занимал менее 100 дней. Столько же времени занимает секвенирование всего генома (whole genome sequencing, WGS) и секвенирование всего транскриптома (whole transcriptome sequencing, WTS)<ref>{{Статья|ссылка=https://journals.plos.org/plosone/article/related?id=10.1371/journal.pone.0076438|автор=Weiss G. J., Liang W. S., Demeure M. J., Kiefer J. A., Hostetter G. et al.|заглавие=A Pilot Study Using Next-Generation Sequencing in Advanced Cancers: Feasibility and Challenges.|год=2013|язык=en|издание=PLoS ONE|тип=|месяц=10|число=30|том=8|номер=10|страницы=|issn=|doi=10.1371/journal.pone.0076438}}</ref>.


== См. также ==
== См. также ==

Версия от 20:50, 5 мая 2020

Секвенирование нового поколения (NGS, англ. next generation sequencing, NGS) — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. NGS осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе NGS могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.[1]

История секвенирования

Секвенатор нового поколения Illumina HiSeq 2500.

Первая концепция секвенирования была предложена Сенгером в 1977 году[2]. Технология получила название «метод обрыва цепи». В том же году Максам и Гилберт предложили альтернативный метод, получивший название «метод химической деградации» — в его основе лежит расщепление меченого по одному концу фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Определение нуклеотидной последовательности проводится методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей авторадиографией.[3] Необходимость в массовом, качественном и быстром секвенировании стимулировала многочисленные модификации и всевозможные улучшения этих методов. В той или иной степени изменениям подверглись практически все составляющие этого процесса. Переломной точкой развития технологии стало появление ПЦР и автоматизация основных этапов «чтения» ДНК, давшие начало методам секвенирования следующего поколения. Платформы для методов нового поколения основываются на распараллеливании процесса «чтения» ДНК, и таким образом за один прогон работы секвенатора можно определить первичные структуры нескольких участков генома. Секвенаторы нового поколения стали значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов пар оснований, что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.[4]

Методы

Сравнение различных методов NGS[5][6][7]
метод принцип масимальная длина прочтения, пар оснований стоимость секвенирования 1 млн пар оснований стоимость секвенатора время работы за цикл количество прочтений за цикл преимущества недостатки
454 Life Sciences пиросеквенирование и люцифераза 400 10$ 500 000$ 7 часов 1 000 000 длина прочтённых геномных участков; скорость стоимость; погрешность
Illumina-SOLEXA нуклеотиды с флуорофором и снимаемыми терминаторами 300 0,05—0,15$ 2 000 000$ (HiSeq) -

7 500 500$ (MiSeq)

4 часа — 55 часов до 5 000 000 000 эффективность, стоимость скорость
SOLiD лигирование олигонуклеотидных зондов с флуорофором 35—50 0,13$ 595 000$ до 10 дней до 2 400 000 000 стоимость скорость
Helicos нуклеотиды с флуорофором и снимаемыми терминаторами 2900 2$ 1 350 000$ 1 час 35 000—75 000 длина прочтённых геномных участков; скорость низкая производительность при желаемой малой погрешности; стоимость
IonTorrent изменение pH в процессе присоединения нуклеотидов 600 1$ 50 000$ 3 часа до 5 000 000 стоимость; скорость погрешность
PacBio Sequel[8] нуклеотиды с флуорофором 20 000 2$ 600 000$ 20-30 часов До 500 000 длина прочтений, точность количество материала, цена
MinION Mk1B[9][10] изменение силы тока по мере прохождения цепи через нанопору длина всей НК, до 2 000 000 0,47-0,90$ 1000$ 1 мин — 2 суток - длина прочтений, стоимость, отсутствие амплификации и сложных химических превращений погрешность

В связи со стремительным развитием методов секвенирования, параметры методов, такие как стоимость секвенаторов и их работы, время и длины прочтённых участков, могут меняться.

Массивно-параллельное опознавательное секвенирование (MPSS)

Массивно-параллельное опознавательное секвенирование (англ. massively parallel signature sequencing, MPSS) — одна из первых технологий NGS, которая была разработана в 1990-х компанией Lynx Therapeutics для секвенирования мРНК транскриптов и оценки генной экспрессии, основываясь на индивидуальных уровнях мРНК в отдельной клетке.[11] В методе MPSS транскрипты захватываются на отдельных микрогранулах с матрицей ДНК; мРНК прочитываются гибридизацией с флуоресцентной меткой, а затем удаляются, и так несколько раз подряд. В результате получаются последовательности длиной от 17 до 20 пар оснований (п.о.). Количество транскриптов, показывающих уровень экспрессии, определяется числом транскриптов на миллион молекул. Данный метод не требует идентификации генов перед началом анализа, а его чувствительность — несколько молекул мРНК на клетку.[12]

Развитие методов NGS.

Roche/454 Life Sciences

Основная статья: Пиросеквенирование

Первая эффективно используемая на коммерческой основе платформа NGS. Компания 454 Life Sciences основана в 2000 году Джонатаном Ротбергом (в производство запущена в 2005 году). Данная технология представляет собой последовательный синтез методов эмульсионного ПЦР и пиросеквенирования.[13]

Амплификация ДНК проходит в каплях воды в масляной эмульсии. В каждой капле воды находится одноцепочечная матрица ДНК, связанная с праймером на бусинке. Далее, каждая бусина помещается на чип, представляющий собой оптическое волокно. Туда же помещаются необходимые для секвенирования ферменты: ДНК-полимераза, люцифераза, АТФ-сульфурилаза[англ.]. В последней сборке реакция секвенирования идёт в ячейках объёмом 3,4·106 пкл, на стенках которых есть специальное металлическое покрытие, нивелирующее шум.

Illumina/Solexa

Основная статья: Illumina/Solexa method

Авторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод[14] секвенирования использует прикреплённые к микросферам единичные молекулы ДНК. В 2006 году была запущена Solexa Genome Analyzer 1G, первая платформа, генерирующая короткие участки генома. После её приобретения компанией Illumina Genome Analyzer использует оптически прозрачные ячейки с 8 индивидуальными поверхностями (иногда меньше: 4, 2 или даже 1), где связываются олигонуклеотиды. В отличие от пиросеквенирования удлинение последовательности происходит постепенно, что позволяет за раз с помощью камеры снимать большие ДНК-чипы.

Applied Biosystems/SOLiD

Основная статья: SOLiD

Платформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная Applied Biosystems — технология секвенирования коротких чтений, основанная на лигировании. Метод был предложен в лаборатории Джорджа Черча и опубликован в 2005 году.[15] Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности небольших фрагментов (25-75 п.о.) геномной ДНК; к обоим концам предварительно фрагментированной ДНК лигируют адаптеры[англ.], необходимые для эмульсионной ПЦР на магнитных шариках и последующего секвенирования на проточной ячейке.

Полони-секвенирование

Основная статья: Полони-секвенирование

Технология NGS без электрофоретического разделения, позволяющая прочитывать миллионы коротких иммобилизованных последовательностей ДНК. Основная идея метода — генерация большого числа уникальных 'полоний' (молекулярных колоний, сгенерированных полимеразой), которые секвенируются в случайном порядке. Полони-секвенирование проводится для библиотеки парных концевых тэгов (paired-end tags): каждая молекула ДНК имеет длину 135 пар оснований (п.о.), содержит два тэга длиной 17-18 п.о., разделённых и фланкированных общей последовательностью.[16][17]

Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences

Основная статья: Helicos Biosciences

Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope (Helicos BioSciences) имеет производительность около 1Gb/день. Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим полиаденилированием на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой.[18]

DNA nanoball sequencing

Создание наношариков и их прикрепление на субстрат

В данном методе в секвенируемый фрагмент ДНК последовательно вносятся 4 адаптера, благодаря которым в ходе дальнейшей репликации Phi29 ДНК-полимеразой[англ.] (rolling circle replication) синтезируемая молекула ДНК сворачивается в ДНК-наношарики. Затем, наношарики наносятся на субстрат, имеющий многочисленные поля размером ~300 нм для связывания ДНК, организованные в виде решётки.[19] Организация этих полей позволяет уместить больше ДНК на субстрат и увеличить плотность информации в изображении по сравнению со случайным нанесением ДНК на субстрат (например, как в полони-секвенировании).

cPAL

Combinatorial probe anchor ligation — комбинированный метод секвенирования, использующий комбинацию гибридизации и лигирования пула зондов. Каждый зонд состоит из девяти оснований, которые вырождены (то есть могут быть любыми из четырёх) во всех, кроме одной позиции, которую собираются прочитать. Интересующая позиция помечена одним из четырёх красителей, соответствующие каждому азотистому основанию. На матрицу гибридизируют якорную последовательность, комплементарную адаптеру и зонды. Зонды, гибридизованные напротив одного из концов якорной последовательности, затем лигируются. После гибридизации и лигирования избыток зондов смывают и снимают изображение. Затем смывают весь якорно-зондовый комплекс и процесс повторяют, используя зонды для других позиций. После считывания 5 смежных оснований процесс повторяется с использованием якорей с пятью дополнительными вырожденными основаниями, что позволяет секвенировать до 10 оснований с каждой стороны адаптера. В общей сложности секвенируется прочтение в 70 оснований из исходного фрагмента, по 35 оснований на каждом конце адаптера. Из-за расстояния между адаптерами эти последовательности в 35 оснований не являются смежными, поскольку они содержат гэп в два основания и гэп в пять оснований.[20]

Ion Torrent Sequencing

Основная статья: Ion semiconductor sequencing

Метод основан на связи между химической и цифровой информацией; эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать.

Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК, проводить ChIP-seq. Более того, с его помощью можно изучать геномы микробных сообществ.[21]

Изображение процесса генерации электрического сигнала во время прохождения молекулы ДНК через нанопору в методе нанопорового секвенирования.

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences

Основная статья: Одномолекулярное секвенирование в реальном времени

Появление метода одномолекулярного секвенирования в реальном времени (англ. Single molecule real time sequencing, SMRT) дало возможность наблюдать за работой ДНК-полимеразы, наращивающей синтезируемую цепь, в реальном времени. Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности фрагментов геномной ДНК с лигированными к их концам специфическими ДНК-адаптерами, необходимыми для последующего секвенирования. Смысл SMRT-секвенирования схож с описанными ранее методами NGS — ДНК-полимераза достраивает вторую цепь исследуемой молекулы ДНК, используя нуклеотиды, меченные различными флуоресцентными метками, которые регистрируют при помощи конфокальной микроскопии высокого разрешения.[22]

Нанопоровое секвенирование

Основная статья: Нанопоровое секвенирование

Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей мембране. При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.[23]

Применение секвенирования нового поколения

Быстрота и дешевизна методов NGS, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря NGS появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты[24].

ChiP-seq

Основные статьи: ChIP-seq, Определение конформации хромосом, DNase-Seq и ChIA-PET

Использование NGS позволило определять места связывания белков с ДНК (ChIP-seq), взаимодействующие участки ДНК (Определение конформации хромосом) и участки открытого хроматина на протяжении всего генома.

Удешевление и распространение NGS позволяет осуществлять проекты ENCODE и modENCODE.

ChiP-seq используется для картирования сайтов связывания ДНК-связывающих белков[25], что раньше достигалось методами иммунопреципитации хроматина и гибридизации без секвенирования на микрочипах .

Геномный анализ

Стали доступны геномы разных по сложности живых систем от микроорганизмов до человека, включая геном цитогенетически находящихся в норме клеток миелоидной лейкемии. Увеличение длины чтений ускорило сборку целых геномов.[26]

Направленное пересеквенирование геномов

Секвенирование определённых регионов в геномах используется для выявления полиморфизмов (в частности однонуклеотидных полиморфизмов) и мутаций в генах, задействованных в развитии опухолевых и других заболеваний. Примером одной из таких широкомасштабных работ может служить проект 1000 геномов.[27]

Метагеномика

Основная статья: Метагеномика

NGS широко используется в исследованиях разнообразия микроорганизмов в различных образцах (например, микробные популяции в океане и почве, идентификация новых вирусов в органах, подлежащих трансплантации, описание характерной для ЖКТ микрофлоры и т. д.)[28]

Секвенирование транскриптома

Основная статья: Секвенирование РНК

На основе NGS создан новый подход РНК-секвенирования (RNA-seq)[29] для картирования и подсчёта транскриптов в биологических образцах. У этого метода есть преимущества над используемым ранее методом ДНК-микрочипов. Например, ДНК-чипы зависят от перекрытия геномных последовательностей, в то время как RNA-seq позволяет охарактеризовать транскрипцию без предварительного знания места начала транскрипции.

Перспективы применения секвенирования в медицине

В недалёком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их для идентификации мишеней для лекарственной терапии онкологических больных. Уже в 2013 году анализ по технологии секвенирования следующего поколения от момента биопсии до завершения NGS занимал менее 100 дней. Столько же времени занимает секвенирование всего генома (whole genome sequencing, WGS) и секвенирование всего транскриптома (whole transcriptome sequencing, WTS)[30].

См. также

Примечания

  1. ↑ Voelkerding K.V., Dames S.A., Durtschi J.D. Next-generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics (англ.) // Clinical Chemistry. — 2009. — 26 February (vol. 55, no. 4). — P. 651-658. — doi:10.1373/clinchem.2008.112789.
  2. ↑ Ansorge W.J. Next-generation DNA sequencing techniques. (англ.) // New Biotechnology. — 2009. — April (vol. 25, no. 4). — P. 195-203. — doi:10.1016/j.nbt.2008.12.009.
  3. ↑ Maxam–Gilbert sequencing (англ.) // Wikipedia. — 2019-09-13.
  4. ↑ Kchouk M., Gibrat JF., Elloumi M. Generations of Sequencing Technologies: From First to Next Generation (англ.) // Biology and Medicine. — 2017. — 6 March (vol. 9, no. 3). — doi:10.4172/0974-8369.1000395.
  5. ↑ Quail M.A., Smith M., Coupland P. et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers (англ.) // BMC Genomics. — 2012. — 24 July (vol. 13, no. 341). — doi:10.1186/1471-2164-13-341.
  6. ↑ Liu L.,Li Y., Li S., Hu N., He Y., Pong R., Lin D., Lu L., Law M. Comparison of Next-Generation Sequencing Systems (англ.) // Journal of Biomedicine and Biotechnology. — 2012. — 5 July (vol. 2012). — doi:10.1155/2012/251364.
  7. ↑ Barba M., Czosnek H., Hadidi A. Historical Perspective, Development and Applications of Next-Generation Sequencing in Plant Virology (англ.) // Viruses. — 2014. — 6 January (vol. 6). — P. 106-136. — doi:10.3390/v6010106.
  8. ↑ PacBio Sequel Systems. www.pacb.com. Дата обращения: 19 апреля 2020.
  9. ↑ Product comparison (англ.). Oxford Nanopore Technologies. Дата обращения: 19 апреля 2020.
  10. ↑ Branton D., Deamer D.W., Marziali A., Bayley H., Benner S.A. The potential and challenges of nanopore sequencing // Nature biotechnology. — 2008-10. — Т. 26, вып. 10. — С. 1146–1153. — ISSN 1087-0156. — doi:10.1038/nbt.1495.
  11. ↑ Massively parallel signature sequencing (англ.) // Wikipedia. — 2020-04-11.
  12. ↑ Brenner S., Johnson M., Bridgham J., Golda G., Lloyd D.H. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays // Nature Biotechnology. — 2000-06. — Т. 18, вып. 6. — С. 630–634. — ISSN 1087-0156. — doi:10.1038/76469.
  13. ↑ 454 Life Sciences (англ.) // Wikipedia. — 2020-04-14.
  14. ↑ An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology (англ.).
  15. ↑ SOLiD System (англ.). Applied Biotechnologies.
  16. ↑ Mitra R.D., Shendure J., Olejnik J., Edyta-Krzymanska-Olejnik, Church J.M. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies // Analytical Biochemistry. — 2003-09-01. — Т. 320, вып. 1. — С. 55–65. — ISSN 0003-2697. — doi:10.1016/s0003-2697(03)00291-4.
  17. ↑ Shendure J., Porreca G.J., Reppas N.B., Lin X., McCutcheon J.P. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome // Science (New York, N.Y.). — 2005-09-09. — Т. 309, вып. 5741. — С. 1728–1732. — ISSN 1095-9203. — doi:10.1126/science.1117389.
  18. ↑ Pareek C.S., Smoczynski R., Tretyn A. Sequencing technologies and genome sequencing. (англ.) // J Appl Genetics. — 2011. — 23 June (no. 52). — P. 413-435. — doi:10.1007/s13353-011-0057-x.
  19. ↑ Drmanac R., Sparks A.B. , Callow M.J., Halpern A.L. , Burns N.L. Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays (англ.) // Science. — 2010-01-01. — Vol. 327, iss. 5961. — P. 78–81. — ISSN 1095-9203 0036-8075, 1095-9203. — doi:10.1126/science.1181498.
  20. ↑ Complete Genomics (англ.). AllSeq.
  21. ↑ Rusk N. Torrents of sequence (англ.) // Nat Methods. — 2011. — Vol. 8, no. 44. — doi:10.1038/nmeth.f.330.
  22. ↑ Eid J., Fehr A., Gray J., Luong K., Lyle J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules // Science. — 2009. — 2 января (т. 323, № 5910). — С. 133-138. — doi:10.1126/science.1162986.
  23. ↑ Eisenstein M. Oxford Nanopore announcement sets sequencing sector abuzz. (англ.) // Nat Biotechnol. — 2012. — Vol. 30. — P. 295-296. — doi:10.1038/nbt0412-295.
  24. ↑ Shendure J., Ji H. Next-generation DNA sequencing. (англ.) // Nature Biotechnologies. — 2008. — 9 October (no. 26). — P. 1135-1145. — doi:10.1038/nbt1486.
  25. ↑ Bailey T.,Krajewski P., Ladunga I., Lefebvre C., Li Q. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data // PLoS computational biology. — 2013. — Т. 9, вып. 11. — С. e1003326. — ISSN 1553-7358. — doi:10.1371/journal.pcbi.1003326.
  26. ↑ Henson J, Tischler G, Ning Z. 2012;13(8):901‐915. doi:10.2217/pgs.12.72. Next-generation sequencing and large genome assemblies. (англ.) // Pharmacogenomics. — 2012. — 20 March (vol. 13, no. 8). — P. 901-915. — doi:10.2217/pgs.12.72.
  27. ↑ Mills R., Walter K., Stewart C. et al. Mapping copy number variation by population-scale genome sequencing. (англ.) // Nature. — 2011. — 2 February (vol. 470). — P. 59-65. — doi:10.1038/nature09708.
  28. ↑ Eisen J. A. Environmental shotgun sequencing: its potential and challenges for studying the hidden world of microbes. (англ.) // PLoS Biol.. — 2007. — Vol. 5, no. 3. — P. e82. — doi:10.1371/journal.pbio.0050082.
  29. ↑ Metzker M. Sequencing technologies — the next generation. (англ.) // Nature Reviews Genetics. — 2010. — No. 11. — P. 31-46. — doi:10.1038/nrg2626.
  30. ↑ Weiss G. J., Liang W. S., Demeure M. J., Kiefer J. A., Hostetter G. et al. A Pilot Study Using Next-Generation Sequencing in Advanced Cancers: Feasibility and Challenges. (англ.) // PLoS ONE. — 2013. — 30 October (vol. 8, no. 10). — doi:10.1371/journal.pone.0076438.

Литература

  • G. A. Pavlopoulos, A. Oulas, E. Iacucci, et al. (2013) Unraveling genomic variation from next generation sequencing data. BioData Mining, 6:13 doi:10.1186/1756-0381-6-13.
  • Next-Generation DNA Sequencing Informatics by Stuart Brown, Cold Spring Harbor, 2013.
  • Ребриков Д. В., Коростин Д. О., Шубина Е. С., Ильинский В. В. NGS. Высокопроизводительное секвенирование. — М.: Бином 2014. — 232 с. — ISBN 978-5-9963-1784-4
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Методы_секвенирования_нового_поколения&oldid=106825621