Секвенирование ДНК одиночных клеток: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
(Показать все непатрулированные изменения)
[непроверенная версия][непроверенная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
мНет описания правки
мНет описания правки
Строка 24: Строка 24:


==== MALBAC ====
==== MALBAC ====
[[:en:MALBAC|MALBAC]] - линейный метод полногеномной амплификации. Основа метода - специальные праймеры: они имеют длину 35 нуклеотидов, 27 из которых одинаковы во всех праймерах (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), а 8 оставшихся нуклеотидов варьируются. Весь процесс амплификации описывается следующим образом:
[[:en:MALBAC|MALBAC]] - гибридный линейный метод полногеномной амплификации. Основа метода - специальные праймеры: они имеют длину 35 нуклеотидов, 27 из которых одинаковы во всех праймерах (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), а 8 оставшихся нуклеотидов варьируются. Весь процесс амплификации описывается следующим образом:


1) Плавление (94°С) двухцепочечной ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов.
1) Плавление (94°С) двухцепочечной ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов.
Строка 51: Строка 51:


==== Сравнение методов полногеномной амплификации ====
==== Сравнение методов полногеномной амплификации ====
В последнее время было проведено несколько исследований, посвященных сравнению этих методов<ref>{{Статья|автор=Yong Hou, Kui Wu, Xulian Shi, Fuqiang Li, Luting Song|заглавие=Comparison of variations detection between whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing|ссылка=|язык=En|издание=|год=|том=|выпуск=|doi=10.1186/s13742-015-0068-3}}</ref><ref>{{Статья|автор=Lei Huang, Fei Ma, Alec Chapman, Sijia Lu, Xiaoliang Sunney Xie|заглавие=Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications|ссылка=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26077818|издание=|год=|том=|страницы=|issn=|doi=10.1146/annurev-genom-090413-025352}}</ref><ref>{{Статья|автор=Minfeng Chen, Pengfei Song, Dan Zou, Xuesong Hu, Shancen Zhao|заглавие=Comparison of Multiple Displacement Amplification (MDA) and Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles (MALBAC) in Single-Cell Sequencing|ссылка=http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0114520|издание=|том=|выпуск=|doi=10.1371/journal.pone.0114520}}</ref>.


MDA и MALBAC имеют набор преимуществ и недостатков, и выбор должен зависеть от поставленной задачи.
==== Выбор способа секвенирования ====


==== Создание библиотек ====
==== Создание библиотек ====
После амплификации можно приступать к приготовлению полногеномной или экзомной библиотек с помощью коммерческих наборов.


== Обработка данных ==
== Обработка данных ==

Версия от 08:44, 10 апреля 2016

Секвенирование ДНК одиночной клеток (Single-cell DNA sequencing) – подход, позволяющий получить данные о последовательности ДНК отдельной клетки с помощью технологии секвенирования и, следовательно, выявлять различия между отдельными клетками одноклеточных организмов, органов, тканей и клеточных субпопуляций многоклеточных организмов. Подход позволяет анализировать функциональные особенности клетки в контексте микроокружения. Секвенирование генома единичной клетки включает несколько шагов: выделение одной клетки, полногеномная амплификация, создание библиотек и секвенирование ДНК с использованием методов секвенирования нового поколения.

С появлением разнообразных методов секвенирования возникла возможность устанавливать последовательность геномной ДНК. Однако большинство данных на текущий момент получены при секвенировании образцов геномной ДНК, выделенных из популяций микроорганизмов или клеточных субпопуляций многоклеточных организмов[1]. Однако известно, что разнообразие внутри обеих групп может быть существенным, так как сами клетки вносят разный вклад в существование популяции или организма.

Секвенирование генома единичной клетки позволяет перевести изучение генома на клеточный уровень. Сегодня это помогает решать такие задачи, как de novo секвенирование некультивируемых микроорганизмов [2], избавление от генетического мозаицизма в нормальных и патологических случаях[3], выявление и изучение вклада клеточных субпопуляций опухолей в развитие рака и возникновение устойчивости к лечению[4].

Технологические задачи

Перед секвенированием ДНК одиночных клеток стоят задачи физического выделения отдельных клеток, выбора метода амплификации с наименьшей вероятностью внесения ошибок для получения достаточного количества материала и выбора способа секвенирования. Для максимизации качества данных, полученных с помощью описываемого подхода, а также для возможности отличить полученный сигнал от шума все шаги должны быть внимательно рассмотрены.

Изолирование отдельных клеток

Первым шагом в изолировании клеток является создание суспензии жизнеспособных клеток, не связанных друг с другом. Целью изолирования может быть как случайный выбор клеток для создания репрезентативной выборочной совокупности при анализе состава субпопуляций, так и целенаправленный поиск определенных клеток. При исследовании твердых тканей необходима предварительная механическая или химическая диссоциация образца, при этом условия диссоциации должны одинаково действовать на все субпопуляции клеток тканей. Это необходимо для создания несмещенной относительно исходного набора клеток выборки, где сохраняется изначальная представленность клеток, что может быть важно для анализа состава субпопуляций. Стоит учитывать, что условия диссоциации нормальных и нездоровых тканей могут различаться, поэтому на данном этапе важно подобрать соответствующие условия. Работа с цельными образцами тканей также возможна, например, с помощью лазерной захватывающей микродиссекции[5].

После получения суспензии можно приступать к изолированию клеток методами серийного разведения[6], микропипетирования[7], разведения в микроячейках[8], с использованием оптического пинцета. Метод проточной флуоресцентной цитометрии может использоваться для отделения клеток с определенными флуоресцентными свойствами, которые могут быть как естественными, так и введены экспериментатором. Большое развитие в последнее время получили автоматизированные методы микроманипуляции[9][10]; взятие нанобиопсий уже позволяет исследовать ДНК отдельных органелл[11].

Изолированные клетки впоследствии подвергаются лизису.

Полногеномная амплификация

Следующий шаг – полногеномная амплификация (whole genome amplification, WGA),- служит для наработки такого количества ДНК, которого достаточно для детекции сигнала и его выделения из шума в дальнейшем при секвенировании. При этом желательно минимизировать внесение таких артефактов, как предпочтительная амплификация простых последовательностей, потеря генома, введение случайных мутаций и формирование химерных последовательностей. За последнее время появился набор возможностей для решения этой задачи. Использование чистой ПЦР не оправдало себя ввиду, например, повышенной частоты введения ошибок термостабильными полимеразами. Поэтому наибольшего распространения добились изотермические и гибридные методы, такие как  метод амплификации со множественным замещением цепи (MDA) и MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles).

MDA

MDA позволяет быстро амплифицировать ДНК, не задействуя ПЦР[12]. Метод основан на использовании фаговой phi29 полимеразы, которая характеризуется повышенной процессивностью (участки свыше 10 kb) и низкой частотой ошибок (1 на 106−107 оснований). Реакция происходит следующим образом: гексамерные праймеры отжигаются на матрице, элонгируются посредством полимеразы; когда фермент встречает другой праймер (который также элонгируется), то он вытесняет (замещает) его и продолжает свой путь по матрице. Замещенный новосинтезированный участок служит местом посадки новых праймеров и становится матрицей. Таким образом формируется ветвистое дерево, где синтез происходит на каждой ветви. В конце процедуры полимераза ингибируется, добавляется S1 нуклеаза для отщепления ветвей в местах ветвления и ДНК-полимераза I для достраивания образующихся одноцепочечных участков.

Метод имеет ряд проблем, таких как потеря аллелей, предпочтительная амплификация и взаимодействия между праймерами. Первая проблема возникает вследствие случайной амплификации только одного из аллелей в гетерозиготах, в результате чего гетерозиготы неверно определяются как гомозиготы. Из-за высокой частоты проявления этого эффекта (0-60%[12]) уменьшается точность генотипирования. Вторая проблема заключается в сверхамплификации одного аллеля по сравнению с другими. Взаимодействия между гексамерными праймерами происходят вследствие случайного характера последовательностей; их можно значительно уменьшить, введя ограничения при синтезе этих праймеров.

MALBAC

MALBAC - гибридный линейный метод полногеномной амплификации. Основа метода - специальные праймеры: они имеют длину 35 нуклеотидов, 27 из которых одинаковы во всех праймерах (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), а 8 оставшихся нуклеотидов варьируются. Весь процесс амплификации описывается следующим образом:

1) Плавление (94°С) двухцепочечной ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов.

2) Охлаждение (0°С), добавление праймеров и полимеразы.

3) Отжиг праймеров в случайных местах на матрице. Bst ДНК-полимераза удлиняет праймеры с образованием полуампликона при 64°С. Все встречные праймеры смещаются с матрицы.

4) Плавление (94°С), отделение полуампликона от матрицы.

5) Охлаждение (0°С), добавление праймеров и полимеразы. Праймеры эффективно связываются и с матрицей, и с полуампликоном.

6) Bst ДНК-полимераза удлиняет праймеры при 64°С. На исходной матрице синтезируются полуампликоны, на полуампликонах, полученных ранее, синтезируются полные ампликоны.

7) Плавление (94°С).

8) Образование петель (58°С): у полных ампликонов 3' и 5' концы комплементарны друг другу и образуют петлю, не допуская использования полного ампликона в качестве матрицы.

9) Повторение шагов 5-8 пять раз.

10) ПЦР с использованием 27 общих нуклеотидов в качестве праймеров для амплификации только полных ампликонов.

Преимуществом метода является уменьшение шума, связанного с экспоненциальным характером ПЦР амплификации, благодаря введению предварительной квази-линейной амплификации. Это позволило увеличить покрытие генома, уменьшить вероятность потери аллелей и однонуклеотидных полиморфизмов[13]. Помимо этого, на вход требуется очень небольшое количество исходной ДНК, однако любое загрязнение образцов способно значительно повлиять на результаты секвенирования[13].

Недостатком является то, что для избавления от ложно-положительных результатов необходимо сравнивать результаты секвенирования 2-3 клеток как из той же, так и из иной клеточных линий[13]. При этом может теряться часть полиморфизмов, так как клетки, принадлежащие одной клеточной линии, все же имеют некоторые различия в геноме. Кроме того, используемая bst ДНК-полимераза имеет высокую частоту ошибок (1 на 105 оснований)[14].

Сравнение методов полногеномной амплификации

В последнее время было проведено несколько исследований, посвященных сравнению этих методов[15][16][17].

MDA и MALBAC имеют набор преимуществ и недостатков, и выбор должен зависеть от поставленной задачи.

Создание библиотек

После амплификации можно приступать к приготовлению полногеномной или экзомной библиотек с помощью коммерческих наборов.

Обработка данных

Ошибки секвенирования ДНК одиночных клеток

Поиск однонуклеотидных полиморфизмов

Вариации числа копий

Сравнительный анализ клеток

Примеры применения

Преимущества и перспективы

Список литературы

  1. ↑ Tringe SG, von Mering C, Kobayashi A, Salamov AA, Chen K, Chang HW, Podar M, Short JM, Mathur EJ, Detter JC, Bork P, Hugenholtz P, Rubin EM. Comparative Metagenomics of Freshwater Microbial Communities (англ.).
  2. ↑ Martin, Hector Garcia Szeto, ErnestPlatt, DarrenHugenholtz, Philip Relman, David a Quake, Stephen R. Dissecting biological ‘‘dark matter’’ with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated TM7 microbes from the human mouth (англ.).
  3. ↑ McConnell, Michael J Lindberg, Michael R Brennand, Kristen J Piper, Julia C Voet, Thierry Cowing-Zitron, Chris Shumilina, Svetlana Lasken, Roger S Vermeesch, Joris R Hall, Ira M Gage, Fred H. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons (англ.).
  4. ↑ Wang, Yong Waters, Jill Leung, Marco L Unruh, Anna Roh, Whijae Shi, Xiuqing Chen, Ken Scheet, Paul Vattathil, Selina Liang, Han Multani, Asha Zhang, Hong Zhao, Rui Michor, Franziska Meric-Bernstam, Funda Navin, Nicholas E. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing (англ.).
  5. ↑ Emmert-Buck MR, Bonner RF, Smith PD, Chuaqui RF, Zhuang Z, Goldstein SR, Weiss RA, Liotta LA. Laser capture microdissection (англ.).
  6. ↑ Richard G Ham. Clonal Growth of Mammalian Cells in a Chemically Defined, Synthetic Medium (англ.).
  7. ↑ Zong, Chenghang Lu, Sijia Chapman, Alec R Xie, X Sunney. Genome-Wide Detection of Single Nucleotide and Copy Number Variations of a Single Human Cell (англ.).
  8. ↑ Jeff Gole, Athurva Gore, Andrew Richards, Yu-Jui Chiu, Ho-Lim Fung, Diane Bushman, Hsin-I Chiang, Jerold Chun, Yu-Hwa Lo, and Kun Zhang. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells (англ.).
  9. ↑ White, A. K. VanInsberghe, M. Petriv, O. I. Hamidi, M. Sikorski, D. Marra, M. A. Piret, J. Aparicio, S. Hansen, C. L. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR (англ.).
  10. ↑ Macosko, E Z Basu, A Satija, R Nemesh, J Shekhar, K Goldman, M Tirosh, I Bialas, A R Kamitaki, N Martersteck, E M Trombetta, J J Weitz, D A Sanes, J R Shalek, A K Regev, A McCarroll, S A. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets (англ.).
  11. ↑ Actis P, Maalouf MM, Kim HJ, Lohith A, Vilozny B, Seger RA, Pourmand N. Compartmental genomics in living cells revealed by single-cell nanobiopsy (англ.).
  12. ↑ 1 2 J. Guillermo Paez, Ming Lin, Rameen Beroukhim, Jeffrey C. Lee, Xiaojun Zhao. Genome coverage and sequence fidelity of ϕ29 polymerase‐based multiple strand displacement whole genome amplification (англ.). — doi:10.1093/nar/gnh069.
  13. ↑ 1 2 3 Chenghang Zong, Sijia Lu, Alec R. Chapman, X. Sunney Xie. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell (англ.). — doi:10.1126/science.1229164.
  14. ↑ Ausubel, F.M. et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. — 1995.
  15. ↑ Yong Hou, Kui Wu, Xulian Shi, Fuqiang Li, Luting Song. Comparison of variations detection between whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing (англ.). — doi:10.1186/s13742-015-0068-3.
  16. ↑ Lei Huang, Fei Ma, Alec Chapman, Sijia Lu, Xiaoliang Sunney Xie. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. — doi:10.1146/annurev-genom-090413-025352.
  17. ↑ Minfeng Chen, Pengfei Song, Dan Zou, Xuesong Hu, Shancen Zhao. Comparison of Multiple Displacement Amplification (MDA) and Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles (MALBAC) in Single-Cell Sequencing. — doi:10.1371/journal.pone.0114520.
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Секвенирование_ДНК_одиночных_клеток&oldid=77687829