Эта статья является кандидатом в добротные статьи

Позиционирование нуклеосом: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
[отпатрулированная версия][отпатрулированная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
мНет описания правки
Нет описания правки
Строка 8: Строка 8:


=== Классический подход ===
=== Классический подход ===
Экспериментальный метод определения участков ДНК, входящих в состав нуклеосом, основан на применении [[Микрококковая нуклеаза |микрококковой нуклеазы]] (метод MNase-seq). [[Клетка (биология)|Клетки]] замораживают и измельчают, дают оттаять. После оттаивания содержащий хроматин гомогенат обрабатывают микроккоковой нуклеазой. Нуклеаза расщепляет линкерные, не защищённые нуклеосомами участки ДНК. При помощи [[протеаза|протеаз]] и [[Рибонуклеазы|РНКаз]] раствор очищают от белков и [[РНК]]. ДНК экстрагируется из раствора. Применяется как [[Хроматографическая колонка|колоночная хроматография]], так варианты жидкостной экстракции — {{нп5|фенол-хлороформная экстракция||en|Phenol–chloroform extraction}}.
Экспериментальный метод определения участков ДНК, входящих в состав нуклеосом, основан на применении [[Микрококковая нуклеаза |микрококковой нуклеазы]] (метод MNase-seq). [[Клетка (биология)|Клетки]] замораживают и измельчают, дают оттаять. После оттаивания содержащий хроматин гомогенат обрабатывают микроккоковой нуклеазой. Нуклеаза расщепляет линкерные, не защищённые нуклеосомами участки ДНК. При помощи [[протеаза|протеаз]] и [[Рибонуклеазы|РНКаз]] раствор очищают от белков и [[РНК]]. ДНК экстрагируется из раствора. Применяется как [[Хроматографическая колонка|колоночная хроматография]], так варианты жидкостной экстракции — {{нп5|фенол-хлороформная экстракция||en|Phenol–chloroform extraction}}<ref>{{cite pmid|24676786}}</ref>.


ДНК осаждается [[этанол]]ом. Не все линкерные участки могли расщепиться нуклеазой. На этой стадии ДНК-продукт состоит из смеси ДНК фрагментов, соответствующих участкам, с различным покрытием нуклеосомами. Фрагменты ДНК разделяются по размеру [[электрофорез]]ом на [[Агароза|агарозном]] геле. ДНК экстрагируется из полоски геля, содержащей мононуклеосомный продукт. Полученные фрагменты ДНК приготавливают к [[Секвенирование|секвенированию]]. Распространено применение высокоэффективной [[SOLiD]] технологии. В результате секвенирования получают {{нп5|Библиотека (биология)|библиотеку|en|Library (biology)}} ДНК-фрагментов. Фрагменты картируются на [[геном]]. По величине покрытия различных участков генома судят о расположении нуклеосом по последовательности ДНК<ref name="Valouev">{{cite pmid|21602827}}</ref><ref>{{cite pmid|18477713}}</ref>.
ДНК осаждается [[этанол]]ом. Не все линкерные участки могли расщепиться нуклеазой. На этой стадии ДНК-продукт состоит из смеси ДНК фрагментов, соответствующих участкам, с различным покрытием нуклеосомами. Фрагменты ДНК разделяются по размеру [[электрофорез]]ом на [[Агароза|агарозном]] геле. ДНК экстрагируется из полоски геля, содержащей мононуклеосомный продукт. Полученные фрагменты ДНК приготавливают к [[Секвенирование|секвенированию]]. Распространено применение высокоэффективной [[SOLiD]] технологии. В результате секвенирования получают {{нп5|Библиотека (биология)|библиотеку|en|Library (biology)}} ДНК-фрагментов. Фрагменты картируются на [[геном]]. По величине покрытия различных участков генома судят о расположении нуклеосом по последовательности ДНК<ref name="Valouev">{{cite pmid|21602827}}</ref><ref>{{cite pmid|18477713}}</ref>.

Версия от 19:58, 6 июня 2016

Позициони́рование нуклеосо́м — определение положения нуклеосом на последовательности ДНК эукариот. Участки ДНК могут либо входить в нуклеосомные комплексы, либо быть в составе линкерной, межнуклеосомной ДНК. Эта характеристика ДНК определяет её доступность для взаимодействия[англ.] с белками.

Начало развития метода

Разработка методов по позиционированию нуклеосом берет своё начало в 1973 году, тогда было показано свойство ядерного хроматина под действием эндогенных нуклеаз расщепляться на серию отдельных фрагментов ДНК приблизительно равной длины. Первоначально в экспериментах в качестве нуклеазы использовалась дезоксирибонуклеаза I, впоследствии широкое распространение получила микрококковая нуклеаза[1].

Позиционирование нуклеосом при использовании микрококковой нуклеазы

Классический подход

Экспериментальный метод определения участков ДНК, входящих в состав нуклеосом, основан на применении микрококковой нуклеазы (метод MNase-seq). Клетки замораживают и измельчают, дают оттаять. После оттаивания содержащий хроматин гомогенат обрабатывают микроккоковой нуклеазой. Нуклеаза расщепляет линкерные, не защищённые нуклеосомами участки ДНК. При помощи протеаз и РНКаз раствор очищают от белков и РНК. ДНК экстрагируется из раствора. Применяется как колоночная хроматография, так варианты жидкостной экстракции — фенол-хлороформная экстракция[англ.][2].

ДНК осаждается этанолом. Не все линкерные участки могли расщепиться нуклеазой. На этой стадии ДНК-продукт состоит из смеси ДНК фрагментов, соответствующих участкам, с различным покрытием нуклеосомами. Фрагменты ДНК разделяются по размеру электрофорезом на агарозном геле. ДНК экстрагируется из полоски геля, содержащей мононуклеосомный продукт. Полученные фрагменты ДНК приготавливают к секвенированию. Распространено применение высокоэффективной SOLiD технологии. В результате секвенирования получают библиотеку[англ.] ДНК-фрагментов. Фрагменты картируются на геном. По величине покрытия различных участков генома судят о расположении нуклеосом по последовательности ДНК[3][4].

Использование именно микроккоковой нуклеазы обусловлено тем, что она обладает как эндонуклеазной, так и экзонуклеазной активностями. Нуклеаза разрезает ДНК и последовательно отщепляет нуклеотиды со свободных концов. Недостатком микроккоковой нуклеазы является предпочтение ею, как эндонуклеазы, сайтов, составленных из чередующихся dA и dT нуклеотидов, следующими за dC или dG. В то же время она плохо распознаёт сайты из только повторяющихся dA или dT (4—6). Как экзонуклеаза микрококковая нуклеаза медленнее отщепляет dC и dG нуклеотиды. Работа фермента сильно тормозится на участках ДНК, взаимодействующих с белками. При большом времени выдержки нуклеаза начинает щепить и нуклеосомную ДНК, преимущественно в местах близости к поверхности нуклеосомы. Работа фермента в эксперименте останавливается добавлением раствора ЭДТА[5].

Метод MNase-seq может дополняться ультразвуковым разрушением и/или иммунопреципитацией гистона H3 (ChIP-seq), а также использованием таких ферментов, как ДНКаза (DNase-seq), транспозаза (ATAC-seq) и CpG[англ.]-метилтрансфераза (NOME-seq). Может использоваться непосредственное химическое разрушение ДНК между нуклеосомами, например, при помощи гидроксильного радикала или малых ароматических молекул вроде метидиумпропил-ЭДТА, который внедряется в двойную спираль ДНК?! преимущественно в участках между нуклеосомами и разрушает её в присутствии катионов Fe2+ (метод MRE-seq)[6].

Позиционирование нуклеосом in vitro

При изучении различных факторов, влияющих на распределение нуклеосом по ДНК, обычно стараются выделить компоненту влияния собственно последовательности нуклеотидов. Для этого комплекс ДНК с белками гистонами собирается in vitro из предварительно очищенной от белков ДНК и гистоновых октамеров. Количества ДНК и гистонов берутся в определённом соотношении, приблизительно один гистоновый октамер на 850 пар оснований. Далее производятся те же манипуляции, что и в обычном методе с использованием микроккоковой нуклеазы[3].

Предсказание сайтов связывания нуклеосом

В настоящее время развиваются методы позиционирования нуклеосом методами биоинформатики. Основа методов — экспериментально выявленные закономерности распределения нуклеосом в различных областях генома, и зависимости этих распределений от последовательности нуклеотидов ДНК[7]. Данные по результатам экспериментального картирования нуклеосом собраны в базе данных NPRD[англ.] (англ. Nucleosome Positioning Region Database)[8].

Примечания

  1. ↑ Hewish D. R., Burgoyne L. A. Chromatin sub-structure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease. (англ.) // Biochemical and biophysical research communications. — 1973. — Vol. 52, no. 2. — P. 504—510. — PMID 4711166. [исправить]
  2. ↑ Rizzo J. M., Sinha S. Analyzing the global chromatin structure of keratinocytes by MNase-seq. (англ.) // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). — 2014. — Vol. 1195. — P. 49—59. — doi:10.1007/7651_2014_77. — PMID 24676786. [исправить]
  3. ↑ 1 2 Valouev A., Johnson S. M., Boyd S. D., Smith C. L., Fire A. Z., Sidow A. Determinants of nucleosome organization in primary human cells. (англ.) // Nature. — 2011. — Vol. 474, no. 7352. — P. 516—520. — doi:10.1038/nature10002. — PMID 21602827. [исправить]
  4. ↑ Valouev A., Ichikawa J., Tonthat T., Stuart J., Ranade S., Peckham H., Zeng K., Malek J. A., Costa G., McKernan K., Sidow A., Fire A., Johnson S. M. A high-resolution, nucleosome position map of C. elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning. (англ.) // Genome research. — 2008. — Vol. 18, no. 7. — P. 1051—1063. — doi:10.1101/gr.076463.108. — PMID 18477713. [исправить]
  5. ↑ Clark D. J. Nucleosome positioning, nucleosome spacing and the nucleosome code. (англ.) // Journal of biomolecular structure & dynamics. — 2010. — Vol. 27, no. 6. — P. 781—793. — doi:10.1080/073911010010524945. — PMID 20232933. [исправить]
  6. ↑ Teif V. B. Nucleosome positioning: resources and tools online. (англ.) // Briefings in bioinformatics. — 2015. — doi:10.1093/bib/bbv086. — PMID 26411474. [исправить]
  7. ↑ Xi L., Fondufe-Mittendorf Y., Xia L., Flatow J., Widom J., Wang J. P. Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model. (англ.) // BMC bioinformatics. — 2010. — Vol. 11. — P. 346. — doi:10.1186/1471-2105-11-346. — PMID 20576140. [исправить]
  8. ↑ Levitsky V. G., Katokhin A. V., Podkolodnaya O. A., Furman D. P., Kolchanov N. A. NPRD: Nucleosome Positioning Region Database. (англ.) // Nucleic acids research. — 2005. — Vol. 33. — P. D67–70. — doi:10.1093/nar/gki049. — PMID 15608285. [исправить]

Ссылки

Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Позиционирование_нуклеосом&oldid=78816075