Секвенирование экзома: различия между версиями
| [отпатрулированная версия] | [непроверенная версия] |
Kosta1974 (обсуждение | вклад) Статья «Секвенирование экзома» НЕ избрана с помощью гаджета QA (v. 0nafdm6) |
Akartar.n (обсуждение | вклад) м Отредактировала раздел "Гибридизационное обогащение" Метки: через визуальный редактор с мобильного устройства из мобильной версии |
||
| Строка 25: | Строка 25: | ||
==== [[Гибридизация ДНК|Гибридизационное]] обогащение ==== |
==== [[Гибридизация ДНК|Гибридизационное]] обогащение ==== |
||
Для этого вида обогащения образцов экзомными участками создаются специальные микрочипы, содержащие закрепленные на подложке одноцепочечные олигонуклеотиды с последовательностями из генома человека, способными покрыть интересующий участок. Геномная ДНК разрезается на двухцепочечные фрагменты. Фрагменты подвергаются концевой репарации, чтобы получить тупые концы, к которым добавляются адаптеры с универсальными праймерными последовательностями. Эти фрагменты гибридизуются с олигонуклеотидами на микрочипах. Негибридизованные фрагменты отмываются с подложки, и при этом остаются только нужные участки, которые затем амплифицируются с помощью ПЦР.<ref name="genParitioning" /> Ограничения метода связаны с дороговизной аппаратуры и необходимостью достаточно больших количеств ДНК для анализа. |
Для этого вида обогащения образцов экзомными участками создаются специальные микрочипы, содержащие закрепленные на подложке одноцепочечные олигонуклеотиды с последовательностями из генома человека, способными покрыть интересующий участок. Геномная ДНК разрезается на двухцепочечные фрагменты. Фрагменты подвергаются концевой репарации, чтобы получить тупые концы, к которым добавляются адаптеры с универсальными праймерными последовательностями. Эти фрагменты гибридизуются с олигонуклеотидами (зондами) на микрочипах. Негибридизованные фрагменты отмываются с подложки, и при этом остаются только нужные участки, которые затем амплифицируются с помощью ПЦР.<ref name="genParitioning" /> Ограничения метода связаны с дороговизной аппаратуры, количеством зондов, которые можно разместить на матрице и необходимостью достаточно больших количеств ДНК для анализа. |
||
Компания Roche NimbleGen впервые адаптировала оригинальную технологию прямого геномного отбора для секвенирования нового поколения, разработав микрочип Sequence Capture Human Exome 2.1M Array для захвата ~180 000 кодирующих экзонов.<ref name="pmid19861545">{{Cite journal |author=Choi M, Scholl UI, Ji W, Liu T, Tikhonova IR, Zumbo P, Nayir A, Bakkaloğlu A, Ozen S, Sanjad S, Nelson-Williams C, Farhi A, Mane S, Lifton RP |title=Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing |journal=Proc Natl Acad Sci U S A |date=10 November 2009|volume=106 |issue=45 |pages=19096–19101 |pmid=19861545 |pmc=2768590 |doi=10.1073/pnas.0910672106|bibcode = 2009PNAS..10619096C |last2=Scholl |last3=Ji |last4=Liu |last5=Tikhonova |last6=Zumbo |last7=Nayir |last8=Bakkaloglu |last9=Ozen |last10=Sanjad |last11=Nelson-Williams |last12=Farhi |last13=Mane |last14=Lifton }}</ref> Этот метод |
Компания Roche NimbleGen впервые адаптировала оригинальную технологию прямого геномного отбора для секвенирования нового поколения, разработав микрочип Sequence Capture Human Exome 2.1M Array для захвата ~180 000 кодирующих экзонов.<ref name="pmid19861545">{{Cite journal |author=Choi M, Scholl UI, Ji W, Liu T, Tikhonova IR, Zumbo P, Nayir A, Bakkaloğlu A, Ozen S, Sanjad S, Nelson-Williams C, Farhi A, Mane S, Lifton RP |title=Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing |journal=Proc Natl Acad Sci U S A |date=10 November 2009|volume=106 |issue=45 |pages=19096–19101 |pmid=19861545 |pmc=2768590 |doi=10.1073/pnas.0910672106|bibcode = 2009PNAS..10619096C |last2=Scholl |last3=Ji |last4=Liu |last5=Tikhonova |last6=Zumbo |last7=Nayir |last8=Bakkaloglu |last9=Ozen |last10=Sanjad |last11=Nelson-Williams |last12=Farhi |last13=Mane |last14=Lifton }}</ref> Этот метод первым начал использоваться для обогащения экзома.<ref>{{Статья|автор=Thomas J Albert, Michael N Molla, Donna M Muzny, Lynne Nazareth, David Wheeler|год=2007-11|doi=10.1038/nmeth1111|issn=1548-7091, 1548-7105|выпуск=11|страницы=903–905|издание=Nature Methods|заглавие=Direct selection of human genomic loci by microarray hybridization|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nmeth1111|том=4}}</ref> Но он был в значительной степени вытеснен методами, которые требуют меньше входной ДНК и, следовательно, потенциально более эффективны. <ref>{{Статья|автор=Amanda Warr, Christelle Robert, David Hume, Alan Archibald, Nader Deeb|год=2015-8|doi=10.1534/g3.115.018564|issn=2160-1836|выпуск=8|язык=en|страницы=1543–1550|издание=G3&#58; Genes{{!}}Genomes{{!}}Genetics|заглавие=Exome Sequencing: Current and Future Perspectives|ссылка=http://g3journal.org/lookup/doi/10.1534/g3.115.018564|том=5}}</ref> Однако было обнаружено, что адаптация NimbleGen на основе этой технологии работала лучше, чем альтернативы, в регионах с низким процентным содержанием GC, обнаружение [[Однонуклеотидный полиморфизм|однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)]] было более специфичным. <ref name=":0">{{Статья|автор=Asan, Yu Xu, Hui Jiang, Chris Tyler-Smith, Yali Xue|год=2011|doi=10.1186/gb-2011-12-9-r95|issn=1465-6906|выпуск=9|язык=en|страницы=R95|издание=Genome Biology|заглавие=Comprehensive comparison of three commercial human whole-exome capture platforms|ссылка=http://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2011-12-9-r95|том=12}}</ref> <ref name=":1">{{Статья|автор=K. Bodi, A. G. Perera, P. S. Adams, D. Bintzler, K. Dewar|год=2013-7|doi=10.7171/jbt.13-2402-002|issn=1524-0215, 1943-4731|выпуск=2|страницы=73–86|издание=Journal of Biomolecular Techniques : JBT|заглавие=Comparison of Commercially Available Target Enrichment Methods for Next-Generation Sequencing|ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3605921/|том=24}}</ref> |
||
==== Обогащение в растворе ==== |
==== Обогащение в растворе ==== |
||
| Строка 34: | Строка 34: | ||
=== Секвенирование === |
=== Секвенирование === |
||
{{main|Методы секвенирования нового поколения}} |
{{main|Методы секвенирования нового поколения}} |
||
Существует несколько технологий секвенирования, включая классический метод [[Секвенирование по Сэнгеру|секвенирования по Сэнгеру]]. Методы секвенирования нового поколения используют платформы Roche/454 Life Sciences (основана на принципе [[Пиросеквенирование|пиросеквенирования]], к середине 2016 года компания закончит поддержку платформы<ref>{{Cite web|url = https://www.genomeweb.com/sequencing/following-roches-decision-shut-down-454-customers-make-plans-move-other-platform|title = Following Roche's Decision to Shut Down 454, Customers Make Plans to Move to Other Platforms|author = |work = |date = |publisher = }}</ref>), [[Illumina/Solexa method|Illumina]], [[SOLiD]] и [[Ионное полупроводниковое секвенирование|Ion-Torrent]]. Все эти методы могут использоваться в том числе и для секвенирования экзома. |
Существует несколько технологий секвенирования, включая классический метод [[Секвенирование по Сэнгеру|секвенирования по Сэнгеру]]. Методы секвенирования нового поколения используют платформы Roche/454 Life Sciences (основана на принципе [[Пиросеквенирование|пиросеквенирования]], к середине 2016 года компания закончит поддержку платформы<ref>{{Cite web|url = https://www.genomeweb.com/sequencing/following-roches-decision-shut-down-454-customers-make-plans-move-other-platform|title = Following Roche's Decision to Shut Down 454, Customers Make Plans to Move to Other Platforms|author = |work = |date = |publisher = }}</ref>), [[Illumina/Solexa method|Illumina]], [[SOLiD]] и [[Ионное полупроводниковое секвенирование|Ion-Torrent]]. Все эти методы могут использоваться в том числе и для секвенирования экзома. Однако основными поставщиками платформ для секвенирования экзома являются [[Транскриптомные технологии|NimbleGen]], [[Agilent Technologies|Agilent]] и [[Illumina/Solexa method|Illumina]]. |
||
<br /> |
|||
=== Анализ результатов === |
=== Анализ результатов === |
||
| Строка 97: | Строка 99: | ||
== Примечания == |
== Примечания == |
||
{{примечания}} |
{{примечания}}<ref name=":0" /><ref name=":1" /> |
||
<br /> |
|||
[[Категория:Секвенирование]] |
[[Категория:Секвенирование]] |
||
[[Категория:Методы молекулярной биологии]] |
[[Категория:Методы молекулярной биологии]] |
||
Версия от 11:50, 22 апреля 2019
Секвенирование экзома — технология секвенирования всех белок-кодирующих генов в геноме (то есть экзома). Она состоит из двух шагов: первый шаг — выбор участков ДНК, кодирующих белки. Эти участки известны как экзоны. У человека насчитывается около 180 000 экзонов, что составляет примерно 1 % от размера генома, или приблизительно 30 миллионов пар нуклеотидов. Второй шаг — секвенирование экзонов с использованием любой платформы высокопроизводительного секвенирования ДНК[1].
Секвенирование экзома ставит своей целью обнаружить генетические изменения, приводящие к изменению белковых последовательностей, что может приводить к возникновению менделевских (например, фенилкетонурия) и неменделевских полигенных заболеваний, таких как атеросклероз или болезнь Альцгеймера. Основное преимущество экзомного секвенирования в том, что оно позволяет проводить массовый скрининг генов и обнаруживать мутации в белок-кодирующих последовательностях, ассоциированные с заболеваниями, но при этом проще и дешевле, чем полногеномное секвенирование.
Цели метода и сравнение с другими подходами
Секвенирование экзома особенно эффективно для изучения редких менделевских заболеваний, так как это наиболее продуктивный путь для поиска генетических вариаций во всех генах индивида. Такие заболевания чаще всего вызваны очень редкими генетическими вариантами, которые встречаются лишь у очень небольшого числа людей[2].
В прошлом клинические генетические тесты выбирались на основе клинической картины заболевания (то есть фокусировались на одном или небольшом числе генов, для которых связь с конкретным синдромом была хорошо изучена), или исследовались только определённые типы генных вариантов. Такой подход позволял поставить определённые генетические диагнозы менее чем в половине случаев[3]. Экзомное секвенирование все чаще используется дополнительно к другим тестам: для того чтобы найти новые мутации в генах, связь которых с конкретным заболеванием уже известна, а также чтобы обнаружить новые гены, связанные с заболеванием, методом сравнения экзомов пациентов со схожими признаками.
Методология
Секвенирование экзома включает в себя три этапа: отбор интересующей фракции ДНК (обогащение образцов), секвенирование отобранного материала и анализ полученных результатов.
Стратегии обогащения образцов
Так как экзом составляет всего около 1 % от всей ДНК клетки, эффективность метода зависит от чистоты фракции ДНК и требует предварительной очистки образцов от других последовательностей ДНК (например, интронов, промоторных областей и негенных участков). Стратегии обогащения образцов позволяют селективно отбирать нужные геномные участки из образцов ДНК до этапа секвенирования. С момента описания первого оригинального метода прямого геномного отбора в 2005 году[4] разработано несколько стратегий обогащения образцов, подходящих для целей экзомного секвенирования.
ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко применяется для отбора требуемых фрагментов ДНК уже более 20 лет.[5] ПЦР позволяет амплифицировать (размножить) определённые последовательности ДНК. Обычно ПЦР использует только одну стартовую точку (праймер) для амплификации, однако разработаны методы мультиплексной ПЦР, которая использует несколько праймеров и позволяет одновременно амплифицировать несколько ДНК-мишеней в ходе одного процесса (например, разных генов). Такой подход может использоваться в классическом секвенировании по Сэнгеру. Мультиплексные ПЦР, использующие несколько праймеров, довольно сложны для работы, хотя сейчас разработаны подходы, позволяющие обойти эти сложности. Эти ограничения связаны с размером геномной мишени, необходимым для реакции количеством ДНК и качеством ДНК на выходе. Подходы, использующие ПЦР, очень эффективны, хотя и не позволяют работать с участками генома длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов (п. н.) из-за высокой цены и низкого качества получающихся образцов.
Метод молекулярной инверсии
Метод молекулярной инверсии — это ферментативная техника, которая позволяет получить образцы ДНК, обогащенные амплифицированными инвертированными участками целевых последовательностей. Отбор нужных последовательностей происходит за счет замыкания целевого участка в кольцо. Праймер для этого метода представляет собой одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид, в центральной части которого содержится универсальная последовательность с рестриктным сайтом, а концы комплементарны двум участкам геномной ДНК, между которыми находится интересующая последовательность (например, экзон). Образцы, не вступившие в реакцию, остаются линейными и удаляются экзонуклеазами.[6][7] За счет высокопроизводительного секвенирования с использованием этого метода можно получить довольно точные генотипы. Метод может быть полезен для работы с небольшим числом мишеней в большом количестве образцов. Главный недостаток такого метода целевого обогащения — единообразие получаемых образцов, а также высокая цена при необходимости покрыть большой набор целевых участков.[5]
Гибридизационное обогащение
Для этого вида обогащения образцов экзомными участками создаются специальные микрочипы, содержащие закрепленные на подложке одноцепочечные олигонуклеотиды с последовательностями из генома человека, способными покрыть интересующий участок. Геномная ДНК разрезается на двухцепочечные фрагменты. Фрагменты подвергаются концевой репарации, чтобы получить тупые концы, к которым добавляются адаптеры с универсальными праймерными последовательностями. Эти фрагменты гибридизуются с олигонуклеотидами (зондами) на микрочипах. Негибридизованные фрагменты отмываются с подложки, и при этом остаются только нужные участки, которые затем амплифицируются с помощью ПЦР.[6] Ограничения метода связаны с дороговизной аппаратуры, количеством зондов, которые можно разместить на матрице и необходимостью достаточно больших количеств ДНК для анализа. Компания Roche NimbleGen впервые адаптировала оригинальную технологию прямого геномного отбора для секвенирования нового поколения, разработав микрочип Sequence Capture Human Exome 2.1M Array для захвата ~180 000 кодирующих экзонов.[8] Этот метод первым начал использоваться для обогащения экзома.[9] Но он был в значительной степени вытеснен методами, которые требуют меньше входной ДНК и, следовательно, потенциально более эффективны. [10] Однако было обнаружено, что адаптация NimbleGen на основе этой технологии работала лучше, чем альтернативы, в регионах с низким процентным содержанием GC, обнаружение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) было более специфичным. [11] [12]
Обогащение в растворе
Для обогащения образцов ДНК целевыми геномными участками с использованием техники обогащения в растворе синтезируется специальный набор олигонуклеотидов (зондов), которые прикрепляются к микрошарикам. Микрошарики с олигонуклеотидными зондами помещаются в раствор с фрагментированной геномной ДНК, где происходит селективная гибридизация зондов с нужными геномными участками, после чего шарики с интересующими фрагментами можно осадить и отмыть от излишков ДНК. Затем шарики удаляются, и геномные участки секвенируются. Этот метод был разработан для усовершенствования метода гибридизационного обогащения: он позволяет создать избыток зондов к целевым участкам по сравнению с необходимым количеством образца.[5] Оптимальный размер целевого участка ДНК — около 3,5 миллионов п. н., так при последующем секвенировании получается очень хорошее покрытие. Выбор конкретного метода зависит от многих факторов, в том числе от размера интересующего участка, потребности в покрытии при секвенировании, имеющегося в наличии оборудования и т. д.[13]
Секвенирование
Существует несколько технологий секвенирования, включая классический метод секвенирования по Сэнгеру. Методы секвенирования нового поколения используют платформы Roche/454 Life Sciences (основана на принципе пиросеквенирования, к середине 2016 года компания закончит поддержку платформы[14]), Illumina, SOLiD и Ion-Torrent. Все эти методы могут использоваться в том числе и для секвенирования экзома. Однако основными поставщиками платформ для секвенирования экзома являются NimbleGen, Agilent и Illumina.
Анализ результатов
Первичные («сырые») данные секвенирования представляют собой огромный набор небольших последовательностей (чтений), длина и качество которых зависят от технических характеристик секвенатора, а также от способа приготовления конкретных образцов. Качество чтений можно контролировать, например, при помощи программного пакета FastQС. Полученные чтения по возможности фильтруются: отрезаются концевые участки, которые часто имеют большое число ошибок из-за несовершенства технологий секвенирования, и удаляются адаптерные последовательности, которые нужны для осуществления реакций при секвенировании, однако не несут смысловой нагрузки для дальнейшего анализа (например, с помощью Trimmomatic или sickle); затем корректируются ошибки (Bloocoo, Lighter). Отфильтрованные чтения картируются на геном человека (то есть определяется место в геноме, которому соответствует каждая конкретная последовательность), затем они по возможности складываются в более длинные последовательности, соответствующие отдельным экзонам. Далее в экзонах можно искать полиморфизмы, инсерции, делеции и другие мутации. В настоящий момент существует множество программ, которые осуществляют каждый этап подготовки данных секвенирования и их анализа, большинство из них требует больших вычислительных мощностей, так как объём получаемых данных очень велик.
Значение
В 2009 году опубликовано исследование, которое рассматривает доводы в пользу возможности идентификации генетических вариантов, вызывающих болезни, с помощью экзомного секвенирования. Авторы отсеквенировали экзомы 4 пациентов с синдромом Фримэна-Шелдона (редким генетическим аутосомным доминантным заболеванием, которое связано с мутацией в гене MYH3).[1] Дополнительно были отсеквенированы экзомы 8 индивидов для того, чтобы исключить частые полиморфизмы, не вызывающие заболевание, и определить ген, ответственный за развитие синдрома Фримэна-Шелдона. После исключения распространенных нейтральных вариантов авторы смогли определить, что причиной заболевания в этих случаях был ген MYH3, что подтверждает возможности экзомного секвенирования для определения генов, вызывающих редкие наследственные заболевания.[1] Это было первое опубликованное исследование, которое использовало методы секвенирования экзомов для идентификации неизвестных ранее генов, вызывающих определённое заболевание.
Впоследствии ещё одна группа сообщила об успешном клиническом диагнозе для пациента с подозрением на синдром Барттера.[8] Этот синдром характеризуется нарушением солевого баланса в почках, при этом почки теряют способность удерживать ионы калия и реабсорбировать ионы хлора. Секвенирование экзома неожиданно выявило консервативную рецессивную мутацию в гене SLC26A3, который связан также с врожденной хлоридной диареей. Поставленный таким образом диагноз был подтвержден врачом. Приведенный пример подтверждает возможность применения экзомного секвенирования как дополнительного инструмента для постановки диагнозов и обнаружения наследственных заболеваний в клинической практике. Это сообщение стало одним из первых примеров использования технологий секвенирования нового поколения для молекулярной диагностики.
Другое сообщение посвящено экзомному секвенированию пациентов с редкой менделевской болезнью — синдромом Миллера. Были исследованы экзомы двух братьев и ещё двух неродственных друг другу пациентов. Исследователи вели поиск потенциально патогенных несинонимичных мутаций, сайтов альтернативного сплайсинга, инсерций, делеций и т. п.[2] Так как синдром Миллера достаточное редкое заболевание, предполагалось, что мутация, приводящая к развитию болезни, ещё не обнаружена. Предшествующие исследования по экзомному секвенированию использовались, чтобы исключить из поиска обычные ОНП, зарегистрированные в базах данных. После такой фильтрации авторы обнаружили мутации в гене DHODH, общие для всех 4 пациентов с синдромом Миллера, включенных в исследование. Все обследованные оказались составными гетерозиготами (компаундами, то есть содержащими два различных рецессивных мутантных аллеля) по мутациям DHODH, которые они унаследовали от каждого из родителей-носителей.[2]
Экзомное секвенирование позволяет определять новые гены, ответственные за развитие редких менделевских заболеваний. По всей видимости, использование экзомного секвенирования может помочь обнаружить гены, вовлеченные в развитие комплексных заболеваний, которые невозможно определить традиционными методами. Целевое обогащение и высокопроизводительное секвенирование представляет удобную и эффективную стратегию с высокой чувствительностью и специфичностью для определения полиморфизмов, вызывающих изменения в белках отдельных индивидов.
Сравнение с генотипированием с использованием микрочипов
Существует множество технологий для поиска генов, связанных с заболеваниями. Каждая из них имеет свои ограничения по выходу, финансовым затратам, техническим потребностям. Например, методы микрочипирования требуют зондов для гибридизации с известной последовательностью, поэтому они ограничены в области разработки зондов и не позволяют выявить некоторые генетические изменения. Технологии высокопроизводительного секвенирования, используемые для секвенирования экзома, позволяют узнать последовательности тысяч локусов одновременно и определить неизвестные до сих пор источники многих болезней.[15] Эта технология позволяет обойти ограничения генотипирующих чипов и классического секвенирования.
Секвенирование экзома — процедура более дорогая, чем использование генотипирующих чипов, но она позволяет охватить гораздо больше генов. По мере уменьшения финансовых затрат и увеличения производительности методов геномного секвенирования этот метод все шире используется в практике для работы с редкими генетическими заболеваниями. Накапливающиеся в ходе экзомного секвенирования данные требуют тщательного анализа. Программы для анализа данных экзомного секвенирования постоянно совершенствуются. Различные платформы секвенирования различаются по характеристикам получаемых данных: различаются длины полученных чтений, уровень ошибок, могут использоваться парные и непарные чтения. Все это должно быть учтено при сборке и анализе результатов.[5] Этим различиям нужно уделить особое внимание при сравнении результатов, полученных с использованием разных методов подготовки образцов и секвенирования.
Ограничения
Экзомное секвенирование позволяет обнаружить мутации в белок-кодирующих областях генов, которые нарушают функционирование белков. В то же время некоторые болезни могут быть связаны с мутациями в некодирующих областях или структурными перестройками, которые секвенирование экзома не позволит выявить.[1] Для выявления таких мутаций может быть использовано полногеномное секвенирование: оно покрывает оставшиеся 99 % генома и позволяет выявить более глубокие взаимосвязи, однако этот метод гораздо более дорогой и трудоемкий. На нынешнем этапе развития науки и технологий экзомное секвенирование представляется оптимальным методом для клинической диагностики редких наследственных заболеваний, не выявляемых микрочипами.[8]
Статистический анализ больших объёмов данных в ходе секвенирования экзома — отдельная трудоемкая задача. Возможность ложноположительных и ложноотрицательных результатов требует повторного дорогостоящего секвенирования, что представляет проблему. Есть несколько подходов для улучшения качества экзомных данных:
- сравнение полиморфизмов, определённых с помощью секвенирования и микрочипирования;[1]
- сравнение кодирующих ОНП с данными полногеномного секвенирования пациентов с таким же заболеванием;[1]
- сравнение кодирующих ОНП с гаплотипами, отсеквенированными по Сэнгеру.[1]
ОНП, вызывающие редкие рецессивные болезни, вероятнее всего, не будут представлены в базах данных, таких как dbSNP, тогда как полиморфизмы, связанные с более распространенными рецессивными фенотипами, могут в них присутствовать. Например, наиболее частый полиморфизм, вызывающий кистозный фиброз, в большинстве популяций имеет частоту около 3 %. Отсеивание таких генов может ошибочно исключить их из рассмотрения. Гены рецессивных заболеваний определить проще, чем доминантных, так как маловероятно, что такой ген будет иметь более одной патологической несинонимичной замены[1]. Система скрининга частых генетических вариаций основывается на данных, которые есть в dbSNP, однако в ней может быть неполная информация об имеющихся в популяции аллелях. Использование списков аллельных вариантов, полученных в ходе экзомного или полногеномного секвенирования, может быть более надежным источником данных для скрининга. Однако по мере увеличения объёма данных секвенирования экзомов, количество описанных аллельных вариантов в базах, подобных dbSNP, также будет увеличиваться, и необходимо будет разработать подходы для определения порогов частых ОНП, связь которых с болезнями маловероятна.[15]
Генетическая гетерогенность и этническая принадлежность также могут повышать количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что дополнительно затрудняет поиск генов-кандидатов. Конечно, при наличии подобной гетерогенности можно понижать строгость пороговых величин, однако это уменьшит и предсказательную силу. Для решения этой проблемы можно при идентификации генов-кандидатов использовать подход «первичности генотипа» (который подразумевает, что пациент сначала характеризуется по генотипу, а уже после по клиническим фенотипическим проявлениям).
Этические вопросы
Новые технологии в сфере геномики изменили подход исследователей как в фундаментальной, так и в прикладной науке. Средства экзомного секвенирования позволили существенно повысить качество данных об индивидуальных геномах, что порождает ряд вопросов об использовании большого количества подобной информации. Необходимо ли предоставлять доступ к этой информации самим исследуемым индивидам или их страховым компаниям? Эти данные могут привести к неожиданным открытиям, что усложняет ответы на вопросы о клинической применимости метода и пользе для пациента. Исследователи ищут пути решения этих вопросов.[15]
Применение экзомного секвенирования
Используя экзомное секвенирование, в ходе исследований с фиксированными затратами могут секвенироваться последовательности с существенно большей глубиной покрытия по сравнению с покрытием, получаемым методами полногеномного секвенирования. Благодаря этому экзомное секвенирование больше подходит для некоторых задач, требующих надежного определения полиморфизмов.
Картирование редких полиморфизмов при комплексных расстройствах
Текущие крупные международные исследования направлены на определение в геноме частых полиморфизмов, которые легче всего идентифицировать современными методами. Однако из-за отрицательного отбора полиморфизмы, вызывающие очень тяжелые заболевания, встречаются с существенно меньшей аллельной частотой и могут быть не найдены в ходе поиска генов-кандидатов при использовании современных стандартных методов генотипирования, при этом чаще всего они расположены в границах экзома. Полное секвенирование генома — подход, позволяющий находить в геноме новые полиморфизмы. Так как при комплексных расстройствах с риском заболевания связано большое количество генов, для обнаружения их необходимы исследования очень большой выборки, поэтому, с точки зрения издержек, полногеномное секвенирование не является оптимальным. К тому же полиморфизмы в кодирующих областях изучаются очень подробно, и их функциональное значение проще определить, что уже сейчас делает возможным практическое применение данных о полиморфизмах внутри целевого участка экзома.
Обнаружение менделевских болезней
Имеющиеся в настоящий момент данные о тяжелых менделевских болезнях свидетельствуют о том, что подобные синдромы вызываются всего одним или несколькими полиморфизмами в кодирующих генах. Ввиду серьезности этих синдромов, вызвающие их полиморфизмы предположительно очень редки или ранее не существовали в популяции и потому не описаны существующими методами генотипирования. Экзомное секвенирование позволяет достичь высокого покрытия полиморфизмов в кодирующих областях, которое необходимо для отделения истинных полиморфизмов от шума. Успешная модель идентификации менделевских генов включает определение возникающих de novo полиморфизмов при секвенировании генов двух родителей и потомка.
Клиническая диагностика
29-го сентября 2011 года компания Ambry Genetics стала первой сертифицированной компанией, предлагающей секвенирование экзомов и клиническую диагностику заболеваний на его основе.[16] В компании утверждают, что результаты экзомного секвенирования позволят сотрудникам диагностировать пациентов с болезнями, при которых традиционные диагностические подходы неприменимы.
Идентификация мутаций, вызывающих заболевания, может внести существенный вклад в диагностические и терапевтические подходы, поможет прогнозировать развитие заболевания и позволит тестировать родственников, находящихся в зоне риска.[1][2][8][17][18][19] Есть несколько факторов, делающих экзомное секвенирование предпочтительнее моногенного анализа: прежде всего, возможность идентифицировать мутации в генах, не подвергшихся тестированию ввиду нетипичного клинического проявления[19] и идентификация клинических случаев, при которых мутации в разных генах вызывают различные проявления у одного и того же пациента.[2]
Авторы важнейшей рецензированной публикации об экзомном секвенировании подчеркивают полезность этого метода для клинической практики. Авторы, применившие экзомное секвенирование для идентификации мутации, вызывающей синдром Барттера и конгенительную хлоридную диарею, заявляют:
«Мы видим будущее, в котором подобная информация станет частью повседневной клинической оценки пациентов с подозрениями на генетические заболевания с неясным диагнозом… Мы предвидим, что полноэкзомное секвенирование внесет огромный вклад в понимание того, какие гены и какими путями участвуют в развитии редких и частых человеческих болезней, а также в клиническую практику».[8]
Группа Билгулара, также использовавшая экзомное секвенирование и определившая мутацию у пациента с тяжелыми пороками развития мозга, утверждает: «[Эти открытия] выдвигают на первый план использование полноэкзомного секвенирования для идентификации локусов, ответственных за болезни, в условиях, когда традиционные методы продемонстрировали свою несостоятельность… Наши результаты показывают, что эта технология будет особенно ценна для определения генов в условиях, когда картирование затруднено из-за гетерогенности локусов и размытости границ диагностических классификаций, и её в ярком будущем ждет широкое применение в медицине».[17]
Также экзомное секвенирование было использовано для диагностики причины трудноизлечимого воспалительного заболевания кишечника у ребёнка. После десятков неинформативных тестов, более 100 хирургических процедур, безрезультатных консультаций с врачами со всего мира, экзомное севквенирование выявило причину заболевания — мутацию. Определение мутации и знание функции гена сделали возможным направленное лечение, включавшее пересадку костного мозга, исцелившее ребёнка от болезни. В оригинальной публикации авторы говорят, что этот случай «…демонстрирует возможность при помощи экзомного секвенирования ставить молекулярный диагноз каждому конкретному пациенту с новой болезнью, когда все стандартные методы диагностики исчерпали себя, и показывает, как эта технология может быть использована в клинических условиях».[18]
Примечания
- ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ng SB, Turner EH, Robertson PD, Flygare SD, Bigham AW, Lee C, Shaffer T, Wong M, Bhattacharjee A, Eichler EE, Bamshad M, Nickerson DA, Shendure J; Turner; Robertson; Flygare; Bigham; Lee; Shaffer; Wong; et al. (10 September 2009). "Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes". Nature. 461 (7261): 272—276. Bibcode:2009Natur.461..272N. doi:10.1038/nature08250. PMC 2844771. PMID 19684571.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ 1 2 3 4 5 Sarah B Ng, Kati J Buckingham, Choli Lee, Abigail W Bigham, Holly K Tabor, Karin M Dent, Chad D Huff, Paul T Shannon, Ethylin Wang Jabs, Deborah A Nickerson, Jay Shendure & Michael J Bamshad (2010). "Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder". Nature Genetics. 42 (1): 30—35. doi:10.1038/ng.499. PMC 2847889. PMID 19915526.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ Rauch, A; Hoyer, J; Guth, S; Zweier, C; Kraus, C; Becker, C; Zenker, M; Hüffmeier, U; Thiel, C; Rüschendorf, F; Nürnberg, P; Reis, A; Trautmann, U (Oct 1, 2006). "Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation". American journal of medical genetics. Part A. 140 (19): 2063—74. doi:10.1002/ajmg.a.31416. PMID 16917849.
- ↑ Stavros Basiardes, Rose Veile, Cindy Helms, Elaine R. Mardis, Anne M. Bowcock and Michael Lovett (2005). "Direct Genomic Selection". Nature Methods. 1 (2): 63—69. doi:10.1038/nchembio0705-63.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ 1 2 3 4 Kahvejian A, Quackenbush J, Thompson JF (2008). "What would you do if you could sequence everything?". Nature Biotechnology. 26 (10): 1125—1133. doi:10.1038/nbt1494. PMID 18846086.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ 1 2 Emily H. Turner, Sarah B. Ng, Deborah A. Nickerson, and Jay Shendure (2009). "Methods for Genomic Partitioning". Nature Genetics. 10: 30—35. doi:10.1146/annurev-genom-082908-150112. PMID 19630561.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ Mertes F, Elsharawy A, Sauer S, van Helvoort JM, van der Zaag PJ, Franke A, Nilsson M, Lehrach H, Brookes AJ. (2011). "Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing". Brief Funct Genomics. 10 (6): 374—386. doi:10.1093/bfgp/elr033. PMC 3245553. PMID 22121152.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ 1 2 3 4 5 Choi M, Scholl UI, Ji W, Liu T, Tikhonova IR, Zumbo P, Nayir A, Bakkaloğlu A, Ozen S, Sanjad S, Nelson-Williams C, Farhi A, Mane S, Lifton RP; Scholl; Ji; Liu; Tikhonova; Zumbo; Nayir; Bakkaloglu; Ozen; Sanjad; Nelson-Williams; Farhi; Mane; Lifton (10 November 2009). "Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing". Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (45): 19096—19101. Bibcode:2009PNAS..10619096C. doi:10.1073/pnas.0910672106. PMC 2768590. PMID 19861545.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ Thomas J Albert, Michael N Molla, Donna M Muzny, Lynne Nazareth, David Wheeler. Direct selection of human genomic loci by microarray hybridization // Nature Methods. — 2007-11. — Т. 4, вып. 11. — С. 903–905. — ISSN 1548-7105 1548-7091, 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth1111.
- ↑ Amanda Warr, Christelle Robert, David Hume, Alan Archibald, Nader Deeb. Exome Sequencing: Current and Future Perspectives (англ.) // G3: Genes|Genomes|Genetics. — 2015-8. — Vol. 5, iss. 8. — P. 1543–1550. — ISSN 2160-1836. — doi:10.1534/g3.115.018564.
- ↑ Asan, Yu Xu, Hui Jiang, Chris Tyler-Smith, Yali Xue. Comprehensive comparison of three commercial human whole-exome capture platforms (англ.) // Genome Biology. — 2011. — Vol. 12, iss. 9. — P. R95. — ISSN 1465-6906. — doi:10.1186/gb-2011-12-9-r95.
- ↑ K. Bodi, A. G. Perera, P. S. Adams, D. Bintzler, K. Dewar. Comparison of Commercially Available Target Enrichment Methods for Next-Generation Sequencing // Journal of Biomolecular Techniques : JBT. — 2013-7. — Т. 24, вып. 2. — С. 73–86. — ISSN 1943-4731 1524-0215, 1943-4731. — doi:10.7171/jbt.13-2402-002.
- ↑ Lira Mamanova; Coffey, Alison J; Scott, Carol E; Kozarewa, Iwanka; Turner, Emily H; Kumar, Akash; Howard, Eleanor; Shendure, Jay; Turner, Daniel J; et al. (February 2010). "Target-enrichment strategies for nextgeneration sequencing". Nature Methods. 7 (2): 111—118. doi:10.1038/nmeth.1419. PMID 20111037.
{{cite journal}}: Явное указание et al. в:|author=(справка) - ↑ Following Roche's Decision to Shut Down 454, Customers Make Plans to Move to Other Platforms.
- ↑ 1 2 3 Biesecker LG (Jan 2010). "Exome sequencing makes medical genomics a reality". Nat. Genet. 42 (1): 13—14. doi:10.1038/ng0110-13. PMID 20037612.
- ↑ 'Ambry Genetics First to Offer Exome Sequencing Service for Clinical Diagnostics'
- ↑ 1 2 Bilgüvar K, Oztürk AK, Louvi A, Kwan KY, Choi M, Tatli B, Yalnizoğlu D, Tüysüz B, Cağlayan AO, Gökben S, Kaymakçalan H, Barak T, Bakircioğlu M, Yasuno K, Ho W, Sanders S, Zhu Y, Yilmaz S, Dinçer A, Johnson MH, Bronen RA, Koçer N, Per H, Mane S, Pamir MN, Yalçinkaya C, Kumandaş S, Topçu M, Ozmen M, Sestan N, Lifton RP, State MW, Günel M; Öztürk; Louvi; Kwan; Choi; Tatlı; Yalnızoğlu; Tüysüz; et al. (9 September 2010). "Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations". Nature. 467 (7312): 207—210. Bibcode:2010Natur.467..207B. doi:10.1038/nature09327. PMC 3129007. PMID 20729831.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ 1 2 Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, Helbling D, Bonacci BB, Decker B, Serpe JM, Dasu T, Tschannen MR, Veith RL, Basehore MJ, Broeckel U, Tomita-Mitchell A, Arca MJ, Casper JT, Margolis DA, Bick DP, Hessner MJ, Routes JM, Verbsky JW, Jacob HJ, Dimmock DP. Making a definitive diagnosis: successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease (Mar 2011). "Making a definitive diagnosis: Successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease". Genet Med. 13 (3): 255—262. doi:10.1097/GIM.0b013e3182088158. PMID 21173700.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) - ↑ 1 2 Raffan E, Hurst LA, Turki SA, Carpenter G, Scott C, Daly A, Coffey A, Bhaskar S, Howard E, Khan N, Kingston H, Palotie A, Savage DB, O'Driscoll M, Smith C, O'Rahilly S, Barroso I, Semple RK (2011). "Early Diagnosis of Werner's Syndrome Using Exome-Wide Sequencing in a Single, Atypical Patient". Front Endocrinol (Lausanne). 2 (8): 8. doi:10.3389/fendo.2011.00008. PMC 3356119. PMID 22654791.
{{cite journal}}: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) Википедия:Обслуживание CS1 (не помеченный открытым DOI) (ссылка)