Эта статья является кандидатом в добротные статьи

Секвенирование экзома: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
[непроверенная версия][непроверенная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
отмена правки 99602774 участника Akartar.n (обс.) было правильно
Метка: отмена
м Источники по шаблону
Строка 1: Строка 1:
'''Секвенирование экзома''' — [[секвенирование]] всех белок-кодирующих [[ген]]ов в [[геном]]е (то есть [[экзом]]а). Она состоит из двух шагов: первый шаг — отбор [[экзон]]ов. В зависимости от организма, экзоны покрывают 1-2 % генома<ref name=":2">{{Статья|автор=Amanda Warr, Christelle Robert, David Hume, Alan Archibald, Nader Deeb|год=2015-8|doi=10.1534/g3.115.018564|issn=2160-1836|выпуск=8|язык=en|страницы=1543–1550|издание=G3&amp;#58; Genes{{!}}Genomes{{!}}Genetics|заглавие=Exome Sequencing: Current and Future Perspectives|ссылка=http://g3journal.org/lookup/doi/10.1534/g3.115.018564|том=5}}</ref>. У человека их насчитывается около 180 000, примерно 1 % от всего генома, или приблизительно 30 миллионов пар нуклеотидов. Второй шаг — секвенирование экзонов с использованием любой [[Методы секвенирования нового поколения|платформы высокопроизводительного секвенирования]] ДНК<ref name="S">{{Cite journal |author=Ng SB, Turner EH, Robertson PD, Flygare SD, Bigham AW, Lee C, Shaffer T, Wong M, Bhattacharjee A, Eichler EE, Bamshad M, Nickerson DA, Shendure J |title=Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes |journal=Nature |date=10 September 2009 |volume=461 |issue=7261 |pages=272–276 |pmid=19684571 |pmc=2844771 |bibcode=2009Natur.461..272N |last2=Turner |last3=Robertson |last4=Flygare |last5=Bigham |last6=Lee |last7=Shaffer |last8=Wong |last9=Bhattacharjee |doi=10.1038/nature08250|display-authors=8 |last10=Eichler |last11=Bamshad |last12=Nickerson |last13=Shendure }}</ref>.
'''Секвенирование экзома''' — [[секвенирование]] всех белок-кодирующих [[ген]]ов в [[геном]]е (то есть [[экзом]]а). Она состоит из двух шагов: первый шаг — отбор [[экзон]]ов. В зависимости от организма, экзоны покрывают 1-2 % генома.<ref name=":2">{{Статья|автор=Amanda Warr, Christelle Robert, David Hume, Alan Archibald, Nader Deeb|год=2015-8|doi=10.1534/g3.115.018564|issn=2160-1836|выпуск=8|язык=en|страницы=1543–1550|издание=G3&amp;#58; Genes{{!}}Genomes{{!}}Genetics|заглавие=Exome Sequencing: Current and Future Perspectives|ссылка=http://g3journal.org/lookup/doi/10.1534/g3.115.018564|том=5}}</ref> У человека их насчитывается около 180 000, примерно 1 % от всего генома, или приблизительно 30 миллионов пар нуклеотидов. Второй шаг — секвенирование экзонов с использованием любой [[Методы секвенирования нового поколения|платформы высокопроизводительного секвенирования]] ДНК.<ref name=":0">{{Статья|автор=Sarah B. Ng, Emily H. Turner, Peggy D. Robertson, Steven D. Flygare, Abigail W. Bigham|год=2009-09-10|doi=10.1038/nature08250|issn=0028-0836, 1476-4687|выпуск=7261|страницы=272–276|издание=Nature|заглавие=Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature08250|том=461}}</ref>


Секвенирование экзома позволяет обнаружить генетические изменения, приводящие к изменению белковых последовательностей, которые могут приводить к возникновению заболеваний, таких как [[атеросклероз]], [[болезнь Альцгеймера]] и др. Основное преимущество экзомного секвенирования в возможности проводить массовый скрининг генов и обнаруживать [[Мутация|мутации]], ассоциированные с заболеваниями, но при этом проще и дешевле, чем [[Геном|полногеномное]] секвенирование<ref name=":2" />.
Секвенирование экзома позволяет обнаружить генетические изменения, приводящие к изменению белковых последовательностей, которые могут приводить к возникновению заболеваний, таких как [[атеросклероз]], [[болезнь Альцгеймера]] и др. Основное преимущество экзомного секвенирования в возможности проводить массовый скрининг генов и обнаруживать [[Мутация|мутации]], ассоциированные с заболеваниями, но при этом проще и дешевле, чем [[Геном|полногеномное]] секвенирование.<ref name=":2" />
[[Файл:Exome Sequencing Workflow 1a rus.png|thumb|Схема секвенирования экзома. Начало.]]
[[Файл:Exome Sequencing Workflow 1a rus.png|thumb|Схема секвенирования экзома. Начало.]]
[[Файл:Exome Sequencing workflow 1b rus.png|thumb|Схема секвенирования экзома. Окончание.]]
[[Файл:Exome Sequencing workflow 1b rus.png|thumb|Схема секвенирования экзома. Окончание.]]


== Методология ==
== Методология ==
Секвенирование экзома включает в себя четыре этапа: выделение ДНК из предоставленного материала, отбор интересующей фракции ДНК (обогащение образцов), секвенирование отобранного материала и анализ полученных результатов [https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing/exome-sequencing.html].
Секвенирование экзома включает в себя четыре этапа: выделение ДНК из предоставленного материала, отбор интересующей фракции ДНК (обогащение образцов), секвенирование отобранного материала и анализ полученных результатов.<ref>{{Cite web|url=https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing/exome-sequencing.html|title=Whole Exome Sequencing {{!}} Detect exonic variants|publisher=www.illumina.com|accessdate=2019-05-05}}</ref>


=== Выделение ДНК ===
=== Выделение ДНК ===
Строка 12: Строка 12:


=== Стратегии обогащения образцов ===
=== Стратегии обогащения образцов ===
Стратегии обогащения образцов позволяют селективно отбирать нужные геномные участки, то есть экзоны, из образцов ДНК до этапа секвенирования. С момента описания первого оригинального метода в 2005 году разработано несколько стратегий обогащения образцов, подходящих для целей экзомного секвенирования<ref name="genParitioning" />. Выбор конкретного метода зависит от размеров интересующих участков, потребности в покрытии при секвенировании, имеющегося в наличии оборудования и т. д<ref>{{Cite journal|author=Lira Mamanova, ''et al.''|title=Target-enrichment strategies for nextgeneration sequencing|journal=Nature Methods|date=February 2010|volume=7|issue=2|pages=111–118|doi=10.1038/nmeth.1419|pmid=20111037|last2=Coffey|first2=Alison J|last3=Scott|first3=Carol E|last4=Kozarewa|first4=Iwanka|last5=Turner|first5=Emily H|last6=Kumar|first6=Akash|last7=Howard|first7=Eleanor|last8=Shendure|first8=Jay|last9=Turner|first9=Daniel J}}</ref>.
Стратегии обогащения образцов позволяют селективно отбирать нужные геномные участки, то есть экзоны, из образцов ДНК до этапа секвенирования. С момента описания первого оригинального метода в 2005 году разработано несколько стратегий обогащения образцов, подходящих для целей экзомного секвенирования.<ref name=":1">{{Статья|автор=Emily H. Turner, Sarah B. Ng, Deborah A. Nickerson, Jay Shendure|год=2009-9|doi=10.1146/annurev-genom-082908-150112|issn=1527-8204, 1545-293X|выпуск=1|язык=en|страницы=263–284|издание=Annual Review of Genomics and Human Genetics|заглавие=Methods for Genomic Partitioning|ссылка=http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-genom-082908-150112|том=10}}</ref> Выбор конкретного метода зависит от размеров интересующих участков, потребности в покрытии при секвенировании, имеющегося в наличии оборудования и т. д.<ref>{{Статья|автор=Lira Mamanova, Alison J Coffey, Carol E Scott, Iwanka Kozarewa, Emily H Turner|год=2010-2|doi=10.1038/nmeth.1419|issn=1548-7091, 1548-7105|выпуск=2|язык=en|страницы=111–118|издание=Nature Methods|заглавие=Target-enrichment strategies for next-generation sequencing|ссылка=http://www.nature.com/articles/nmeth.1419|том=7}}</ref>


==== ПЦР ====
==== ПЦР ====
[[Файл:Polymerase chain reaction.rus.png|thumb|Принцип полимеразной цепной реакции]]
[[Файл:Polymerase chain reaction.rus.png|thumb|Принцип полимеразной цепной реакции]]
[[Полимеразная цепная реакция]] (ПЦР) широко применяется для амплификации (размножения) требуемых фрагментов [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|ДНК]] уже более 20 лет.<ref name="A">{{Cite journal |author=Kahvejian A, Quackenbush J, Thompson JF |year=2008 |title=What would you do if you could sequence everything? |journal=Nature Biotechnology |volume=26 |pages=1125–1133 |doi=10.1038/nbt1494 |pmid=18846086 |issue=10}}</ref> Обычно в ПЦР используют только 2 [[праймер]]а, однако разработаны методы мультиплексной ПЦР, которая использует несколько праймеров и позволяет одновременно амплифицировать несколько ДНК-мишеней в ходе одного процесса. Подходы, использующие [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]], очень эффективны, но не позволяют работать с участками генома длиной в несколько миллионов пар [[Нуклеотиды|нуклеотидов]] (п. н.) из-за высокой цены и низкого качества получающихся образцов<ref name=":2" />.
[[Полимеразная цепная реакция]] (ПЦР) широко применяется для амплификации (размножения) требуемых фрагментов [[Дезоксирибонуклеиновая кислота|ДНК]] уже более 20 лет.<ref name=":12">{{Статья|автор=Avak Kahvejian, John Quackenbush, John F Thompson|год=2008-10|doi=10.1038/nbt1494|issn=1087-0156, 1546-1696|выпуск=10|язык=en|страницы=1125–1133|издание=Nature Biotechnology|заглавие=What would you do if you could sequence everything?|ссылка=http://www.nature.com/articles/nbt1494|том=26}}</ref> Обычно в ПЦР используют только 2 [[праймер]]а, однако разработаны методы мультиплексной ПЦР, которая использует несколько праймеров и позволяет одновременно амплифицировать несколько ДНК-мишеней в ходе одного процесса. Подходы, использующие [[Полимеразная цепная реакция|ПЦР]], очень эффективны, но не позволяют работать с участками генома длиной в несколько миллионов пар [[Нуклеотиды|нуклеотидов]] (п. н.) из-за высокой цены и низкого качества получающихся образцов<ref name=":2" />.


==== Метод молекулярной инверсии ====
==== Метод молекулярной инверсии ====
[[Файл:Метод молекулярной инверсии.png|thumb|Метод молекулярной инверсии]]
[[Файл:Метод молекулярной инверсии.png|thumb|Метод молекулярной инверсии]]
Метод молекулярной инверсии — это техника, которая позволяет получить образцы ДНК, обогащенные амплифицированными [[Инверсия (биология)|инвертированными участками]] целевых последовательностей. Отбор нужных последовательностей происходит за счет замыкания интересующего участка в кольцо. Праймер для этого метода представляет собой одноцепочечный ДНК-[[олигонуклеотид]], в центральной части которого содержится универсальная последовательность с сайтами рестрикции, а концы [[Комплементарность (биология)|комплементарны]] двум участкам геномной ДНК, между которыми находится интересующая последовательность (например, экзон). Образцы, не вступившие в реакцию, остаются линейными и удаляются [[Экзонуклеазы|экзонуклеазами]]<ref name="genParitioning">{{Cite journal |author=Emily H. Turner, Sarah B. Ng, Deborah A. Nickerson, and Jay Shendure |year=2009 |title=Methods for Genomic Partitioning |journal=Nature Genetics |volume=10 |pages=30–35 |doi=10.1146/annurev-genom-082908-150112|pmid=19630561 }}</ref><ref>{{Cite journal | author=Mertes F, Elsharawy A, Sauer S, van Helvoort JM, van der Zaag PJ, Franke A, Nilsson M, Lehrach H, Brookes AJ. | title=Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing | journal=Brief Funct Genomics. | year=2011 | volume=10 | pages=374–386 | doi=10.1093/bfgp/elr033 | pmc=3245553 |issue=6 | pmid=22121152}}</ref>. Метод может быть полезен для работы с небольшим числом мишеней в большом количестве образцов. Главный недостаток такого метода целевого обогащения — единообразие получаемых образцов, а также высокая цена при необходимости покрыть большой набор участков<ref name="A" />.
Метод молекулярной инверсии — это техника, которая позволяет получить образцы ДНК, обогащенные амплифицированными [[Инверсия (биология)|инвертированными участками]] целевых последовательностей. Отбор нужных последовательностей происходит за счет замыкания интересующего участка в кольцо. Праймер для этого метода представляет собой одноцепочечный ДНК-[[олигонуклеотид]], в центральной части которого содержится универсальная последовательность с сайтами рестрикции, а концы [[Комплементарность (биология)|комплементарны]] двум участкам геномной ДНК, между которыми находится интересующая последовательность (например, экзон). Образцы, не вступившие в реакцию, остаются линейными и удаляются [[Экзонуклеазы|экзонуклеазами]].<ref name=":1" /><ref>{{Статья|автор=F. Mertes, A. ElSharawy, S. Sauer, J. M. L. M. van Helvoort, P. J. van der Zaag|год=2011-11-01|doi=10.1093/bfgp/elr033|issn=2041-2649, 2041-2657|выпуск=6|язык=en|страницы=374–386|издание=Briefings in Functional Genomics|заглавие=Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing|ссылка=https://academic.oup.com/bfg/article-lookup/doi/10.1093/bfgp/elr033|том=10}}</ref> Метод может быть полезен для работы с небольшим числом мишеней в большом количестве образцов. Главный недостаток такого метода целевого обогащения — единообразие получаемых образцов, а также высокая цена при необходимости покрыть большой набор участков.<ref name=":12" />


==== [[Гибридизация ДНК|Гибридизационное]] обогащение ====
==== [[Гибридизация ДНК|Гибридизационное]] обогащение ====
Для этого вида обогащения образцов экзомными участками создаются специальные микрочипы, содержащие закрепленные на подложке одноцепочечные олигонуклеотиды (зонды) с последовательностями из генома, способными покрыть интересующие участки. Геномная ДНК разрезается на фрагменты. Концы фрагментов [[Эндонуклеазы рестрикции|затупляют]], добавляют адаптеры с универсальными праймерными последовательностями. Эти фрагменты гибридизуются с олигонуклеотидами (зондами) на микрочипах. Негибридизованные фрагменты отмываются с подложки, а оставшиеся затем амплифицируются ПЦР<ref name="genParitioning" />. Ограничения метода связаны с дороговизной аппаратуры, количеством зондов, которые можно разместить на матрице и необходимостью достаточно больших количеств ДНК для анализа<ref name=":2" />.
Для этого вида обогащения образцов экзомными участками создаются специальные микрочипы, содержащие закрепленные на подложке одноцепочечные олигонуклеотиды (зонды) с последовательностями из генома, способными покрыть интересующие участки. Геномная ДНК разрезается на фрагменты. Концы фрагментов [[Эндонуклеазы рестрикции|затупляют]], добавляют адаптеры с универсальными праймерными последовательностями. Эти фрагменты гибридизуются с олигонуклеотидами (зондами) на микрочипах. Негибридизованные фрагменты отмываются с подложки, а оставшиеся затем амплифицируются ПЦР.<ref name=":1" /> Ограничения метода связаны с дороговизной аппаратуры, количеством зондов, которые можно разместить на матрице и необходимостью достаточно больших количеств ДНК для анализа.<ref name=":2" />


==== Обогащение в растворе ====
==== Обогащение в растворе ====
[[Файл:In solution capture rus.png|thumb|Обогащение в растворе]]
[[Файл:In solution capture rus.png|thumb|Обогащение в растворе]]
В растворе синтезируется специальный набор олигонуклеотидов (зондов), которые прикрепляются к стрептавидиновым шарикам. Шарики с олигонуклеотидными зондами помещаются в раствор с фрагментированной геномной ДНК, где происходит селективная гибридизация зондов с нужными геномными участками, после чего шарики с интересующими фрагментами можно осадить и отмыть. Затем оставшиеся участки секвенируют. Этот метод был разработан для усовершенствования метода гибридизационного обогащения: он позволяет создать избыток зондов к целевым участкам по сравнению с необходимым количеством образца. Оптимальный размер целевого участка ДНК — около 3,5 миллионов п. н., так при последующем секвенировании получается очень хорошее покрытие<ref name="A" />.
В растворе синтезируется специальный набор олигонуклеотидов (зондов), которые прикрепляются к стрептавидиновым шарикам. Шарики с олигонуклеотидными зондами помещаются в раствор с фрагментированной геномной ДНК, где происходит селективная гибридизация зондов с нужными геномными участками, после чего шарики с интересующими фрагментами можно осадить и отмыть. Затем оставшиеся участки секвенируют. Этот метод был разработан для усовершенствования метода гибридизационного обогащения: он позволяет создать избыток зондов к целевым участкам по сравнению с необходимым количеством образца. Оптимальный размер целевого участка ДНК — около 3,5 миллионов п. н., так при последующем секвенировании получается очень хорошее покрытие.<ref name=":12" />


==== Платформы, используемые для обогащения экзома ====
==== Платформы, используемые для обогащения экзома ====
Основными поставщиками платформ для обогащения экзома являются [[Транскриптомные технологии|NimbleGen]], [[Agilent Technologies|Agilent]] и [[Illumina/Solexa method|Illumina]]<ref name=":2" />.
Основными поставщиками платформ для обогащения экзома являются [[Транскриптомные технологии|NimbleGen]], [[Agilent Technologies|Agilent]] и [[Illumina/Solexa method|Illumina]].<ref name=":2" />
{| class="wikitable sortable"
{| class="wikitable sortable"
|+ '''Сравнение характеристик каждой из наиболее распространенных платформ для обогащения экзома'''<ref name=":2" />
|+ '''Сравнение характеристик каждой из наиболее распространенных платформ для обогащения экзома'''<ref name=":2" />
Строка 76: Строка 76:
|-
|-
|Риды, остающиеся после фильтрации
|Риды, остающиеся после фильтрации
|66 %
|66%
|71,7 %
|71,7%
|54,8 %<ref name=":4">{{Статья|автор=Chandra Sekhar Chilamakuri, Susanne Lorenz, Mohammed-Amin Madoui, Daniel Vodák, Jinchang Sun|год=2014|doi=10.1186/1471-2164-15-449|issn=1471-2164|выпуск=1|язык=en|страницы=449|издание=BMC Genomics|заглавие=Performance comparison of four exome capture systems for deep sequencing|ссылка=http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-15-449|том=15}}</ref>
|54,8%<ref name=":4">{{Статья|автор=Chandra Sekhar Chilamakuri, Susanne Lorenz, Mohammed-Amin Madoui, Daniel Vodák, Jinchang Sun|год=2014|doi=10.1186/1471-2164-15-449|issn=1471-2164|выпуск=1|язык=en|страницы=449|издание=BMC Genomics|заглавие=Performance comparison of four exome capture systems for deep sequencing|ссылка=http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-15-449|том=15}}</ref>
|40,1 %
|40,1%
|-
|-
|Основные сильные стороны
|Основные сильные стороны
Строка 99: Строка 99:
|Нет
|Нет
|}
|}
В настоящее время, в дополнение к наборам, нацеленным лишь на человека, NimbleGen предлагает наборы для экзомов кукурузы, ячменя, пшеницы, сои, мыши и свиньи, а Agilent — для экзомов мыши, крупного рогатого скота и рыбок [[данио]]. Оба провайдера также предлагают возможность разрабатывать индивидуальные комплекты для других видов. Наборы для нечеловеческих видов используют протоколы и зонды, аналогичные человеческим наборам поставщиков. Оба производителя предлагают гибкий процесс проектирования, который позволяет вносить изменения для улучшения покрытия для конкретных регионов и целей<ref name=":2" />.
В настоящее время, в дополнение к наборам, нацеленным лишь на человека, NimbleGen предлагает наборы для экзомов кукурузы, ячменя, пшеницы, сои, мыши и свиньи, а Agilent — для экзомов мыши, крупного рогатого скота и рыбок [[данио]]. Оба провайдера также предлагают возможность разрабатывать индивидуальные комплекты для других видов. Наборы для нечеловеческих видов используют протоколы и зонды, аналогичные человеческим наборам поставщиков. Оба производителя предлагают гибкий процесс проектирования, который позволяет вносить изменения для улучшения покрытия для конкретных регионов и целей.<ref name=":2" />


=== Секвенирование ===
=== Секвенирование ===
{{main|Методы секвенирования нового поколения}}
{{main|Методы секвенирования нового поколения}}
Существует несколько технологий секвенирования, включая классический метод [[Секвенирование по Сэнгеру|секвенирования по Сэнгеру]]. Методы секвенирования нового поколения используют платформы [[Illumina/Solexa method|Illumina]], [[SOLiD]] и [[Ионное полупроводниковое секвенирование|Ion-Torrent]]. Все эти методы могут использоваться в том числе и для [[Секвенирование|секвенирования]] экзома<ref>Quail, M., Smith, M. E., Coupland, P., Otto, T. D., Harris, S. R., Connor, T. R., … Gu, Y. (2012). A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics, 13(1), 341. <nowiki>https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-341</nowiki></ref>.
Существует несколько технологий секвенирования, включая классический метод [[Секвенирование по Сэнгеру|секвенирования по Сэнгеру]]. Методы секвенирования нового поколения используют платформы [[Illumina/Solexa method|Illumina]], [[SOLiD]] и [[Ионное полупроводниковое секвенирование|Ion-Torrent]]. Все эти методы могут использоваться в том числе и для [[Секвенирование|секвенирования]] экзома.<ref>{{Статья|автор=Michael Quail, Miriam E Smith, Paul Coupland, Thomas D Otto, Simon R Harris|год=2012|doi=10.1186/1471-2164-13-341|issn=1471-2164|выпуск=1|язык=en|страницы=341|издание=BMC Genomics|заглавие=A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers|ссылка=http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-13-341|том=13}}</ref>


=== Анализ результатов ===
=== Анализ результатов ===
Первичные («сырые») данные секвенирования представляют собой огромный набор небольших последовательностей (чтений), длина и качество которых зависят от технических характеристик секвенатора и способа приготовления образцов. Качество чтений можно контролировать, например, при помощи программного пакета [http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ FastQС]. Полученные чтения фильтруются: отрезаются концевые участки, которые часто имеют большое число ошибок, и удаляются адаптерные последовательности (например, с помощью [http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic Trimmomatic] или [https://github.com/najoshi/sickle sickle]); затем корректируются ошибки ([https://gatb.inria.fr/software/bloocoo/ Bloocoo], [https://github.com/mourisl/Lighter Lighter]). Отфильтрованные чтения [[Картирование коротких прочтений|картируются]] на геном, где собираются в последовательности, соответствующие экзонам. В настоящий момент существует множество программ, которые осуществляют каждый этап подготовки данных секвенирования и их анализа, большинство из них требует больших вычислительных мощностей, так как объём получаемых данных очень велик<ref>Mardis, E. R. (2016). The challenges of big data. Disease Models & Mechanisms, 9(5), 483—485.</ref>.
Первичные («сырые») данные секвенирования представляют собой огромный набор небольших последовательностей (чтений), длина и качество которых зависят от технических характеристик секвенатора и способа приготовления образцов. Качество чтений можно контролировать, например, при помощи программного пакета [http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ FastQС]. Полученные чтения фильтруются: отрезаются концевые участки, которые часто имеют большое число ошибок, и удаляются адаптерные последовательности (например, с помощью [http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic Trimmomatic] или [https://github.com/najoshi/sickle sickle]); затем корректируются ошибки ([https://gatb.inria.fr/software/bloocoo/ Bloocoo], [https://github.com/mourisl/Lighter Lighter]). Отфильтрованные чтения [[Картирование коротких прочтений|картируются]] на геном, где собираются в последовательности, соответствующие экзонам. В настоящий момент существует множество программ, которые осуществляют каждый этап подготовки данных секвенирования и их анализа, большинство из них требует больших вычислительных мощностей, так как объём получаемых данных очень велик.<ref>{{Статья|автор=Elaine R. Mardis|год=2016-05-01|doi=10.1242/dmm.025585|issn=1754-8403, 1754-8411|выпуск=5|язык=en|страницы=483–485|издание=Disease Models & Mechanisms|заглавие=The challenges of big data|ссылка=http://dmm.biologists.org/lookup/doi/10.1242/dmm.025585|том=9}}</ref>


== Применение экзомного секвенирования ==
== Применение экзомного секвенирования ==
Используя экзомное секвенирование, в ходе исследований с фиксированными затратами могут секвенироваться последовательности с существенно большей [[ChIP-seq|глубиной покрытия]] по сравнению с покрытием, получаемым методами полногеномного секвенирования. Благодаря этому экзомное секвенирование больше подходит для некоторых задач, требующих надежного определения полиморфизмов<ref>Pengelly, R. J., Gibson, J., Andreoletti, G., Collins, A., Mattocks, C. J., & Ennis, S. (2013). A SNP profiling panel for sample tracking in whole-exome sequencing studies. Genome Medicine, 5(9), 89. <nowiki>https://doi.org/10.1186/gm492</nowiki></ref>.
Используя экзомное секвенирование, в ходе исследований с фиксированными затратами могут секвенироваться последовательности с существенно большей [[ChIP-seq|глубиной покрытия]] по сравнению с покрытием, получаемым методами полногеномного секвенирования. Благодаря этому экзомное секвенирование больше подходит для некоторых задач, требующих надежного определения полиморфизмов.<ref>{{Статья|автор=Reuben J Pengelly, Jane Gibson, Gaia Andreoletti, Andrew Collins, Christopher J Mattocks|год=2013|doi=10.1186/gm492|issn=1756-994X|выпуск=9|язык=en|страницы=89|издание=Genome Medicine|заглавие=A SNP profiling panel for sample tracking in whole-exome sequencing studies|ссылка=http://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/gm492|том=5}}</ref>


=== Клиническая диагностика ===
=== Клиническая диагностика ===
29-го сентября 2011 года компания Ambry Genetics стала первой сертифицированной компанией, предлагающей секвенирование экзомов и клиническую диагностику заболеваний на его основе.<ref>[http://www.prnewswire.com/news-releases/ambry-genetics-first-to-offer-exome-sequencing-service-for-clinical-diagnostics-130780498.html 'Ambry Genetics First to Offer Exome Sequencing Service for Clinical Diagnostics']</ref> В компании утверждают, что результаты экзомного секвенирования позволят сотрудникам диагностировать пациентов с болезнями, при которых традиционные диагностические подходы неприменимы<ref>Volk, A., Conboy, E., Wical, B., Patterson, M., & Kirmani, S. (2015). Whole-Exome Sequencing in the Clinic: Lessons from Six Consecutive Cases from the Clinician’s Perspective. Molecular Syndromology, 6(1), 23-31. <nowiki>https://doi.org/10.1159/000371598</nowiki></ref>.
29-го сентября 2011 года компания Ambry Genetics стала первой сертифицированной компанией, предлагающей секвенирование экзомов и клиническую диагностику заболеваний на его основе.<ref>{{Cite web|url=https://www.prnewswire.com/news-releases/ambry-genetics-first-to-offer-exome-sequencing-service-for-clinical-diagnostics-130780498.html|title=Ambry Genetics First to Offer Exome Sequencing Service for Clinical Diagnostics.|author=Ambry Genetics|publisher=www.prnewswire.com|lang=en|accessdate=2019-05-05}}</ref> В компании утверждают, что результаты экзомного секвенирования позволят сотрудникам диагностировать пациентов с болезнями, при которых традиционные диагностические подходы неприменимы.<ref>{{Статья|автор=Amber Volk, Erin Conboy, Beverly Wical, Marc Patterson, Salman Kirmani|год=2015-02-03|doi=10.1159/000371598|issn=1661-8769, 1661-8777|выпуск=1|язык=en|страницы=23–31|издание=Molecular Syndromology|заглавие=Whole-Exome Sequencing in the Clinic: Lessons from Six Consecutive Cases from the Clinician's Perspective|ссылка=https://www.karger.com/Article/FullText/371598|том=6}}</ref>


Идентификация мутаций, вызывающих заболевания, может внести существенный вклад в диагностические и терапевтические подходы, поможет прогнозировать развитие заболевания и позволит тестировать родственников, находящихся в зоне риска<ref name="S" /><ref name="multiple">{{Cite journal|author=Sarah B Ng, Kati J Buckingham, Choli Lee, Abigail W Bigham, Holly K Tabor, Karin M Dent, Chad D Huff, Paul T Shannon, Ethylin Wang Jabs, Deborah A Nickerson, Jay Shendure & Michael J Bamshad|year=2010|title=Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder|journal=Nature Genetics|volume=42|pages=30–35|doi=10.1038/ng.499|pmid=19915526|issue=1|pmc=2847889}}</ref><ref name="pmid19861545">{{Cite journal|author=Choi M, Scholl UI, Ji W, Liu T, Tikhonova IR, Zumbo P, Nayir A, Bakkaloğlu A, Ozen S, Sanjad S, Nelson-Williams C, Farhi A, Mane S, Lifton RP|title=Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing|journal=Proc Natl Acad Sci U S A|date=10 November 2009|volume=106|issue=45|pages=19096–19101|pmid=19861545|pmc=2768590|doi=10.1073/pnas.0910672106|bibcode=2009PNAS..10619096C|last2=Scholl|last3=Ji|last4=Liu|last5=Tikhonova|last6=Zumbo|last7=Nayir|last8=Bakkaloglu|last9=Ozen|last10=Sanjad|last11=Nelson-Williams|last12=Farhi|last13=Mane|last14=Lifton}}</ref><ref name="bilguvar">{{Cite journal |author=Bilgüvar K, Oztürk AK, Louvi A, Kwan KY, Choi M, Tatli B, Yalnizoğlu D, Tüysüz B, Cağlayan AO, Gökben S, Kaymakçalan H, Barak T, Bakircioğlu M, Yasuno K, Ho W, Sanders S, Zhu Y, Yilmaz S, Dinçer A, Johnson MH, Bronen RA, Koçer N, Per H, Mane S, Pamir MN, Yalçinkaya C, Kumandaş S, Topçu M, Ozmen M, Sestan N, Lifton RP, State MW, Günel M |title=Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations |journal=Nature |date=9 September 2010|volume=467 |issue=7312 |pages=207–210 |pmid=20729831 |pmc=3129007 |bibcode=2010Natur.467..207B |last2=Öztürk |last3=Louvi |last4=Kwan |last5=Choi |last6=Tatlı |last7=Yalnızoğlu |last8=Tüysüz |last9=Çağlayan |doi=10.1038/nature09327|display-authors=8 |last10=Gökben |last11=Kaymakçalan |last12=Barak |last13=Bakircioğlu |last14=Yasuno |last15=Ho |last16=Sanders |last17=Zhu |last18=Yilmaz |last19=Dinçer |last20=Johnson |last21=Bronen |last22=Koçer |last23=Per |last24=Mane |last25=Pamir |last26=Yalçinkaya |last27=Kumandaş |last28=Topçu |last29=Ozmen |last30=Sestan }}</ref><ref name="worthey">{{Cite journal |author=Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, Helbling D, Bonacci BB, Decker B, Serpe JM, Dasu T, Tschannen MR, Veith RL, Basehore MJ, Broeckel U, Tomita-Mitchell A, Arca MJ, Casper JT, Margolis DA, Bick DP, Hessner MJ, Routes JM, Verbsky JW, Jacob HJ, Dimmock DP. Making a definitive diagnosis: successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease |journal=Genet Med. |date=Mar 2011 |volume=13 |issue=3 |pages=255–262 |pmid=21173700 |doi=10.1097/GIM.0b013e3182088158 |title=Making a definitive diagnosis: Successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease}}</ref><ref name="raffan">{{Cite journal |author=Raffan E, Hurst LA, Turki SA, Carpenter G, Scott C, Daly A, Coffey A, Bhaskar S, Howard E, Khan N, Kingston H, Palotie A, Savage DB, O'Driscoll M, Smith C, O'Rahilly S, Barroso I, Semple RK |title=Early Diagnosis of Werner's Syndrome Using Exome-Wide Sequencing in a Single, Atypical Patient |journal=Front Endocrinol (Lausanne) |year=2011 |volume=2 |issue=8 |pmid=22654791 |pmc=3356119 |pages=8 |doi=10.3389/fendo.2011.00008}}</ref>. Есть несколько факторов, делающих экзомное секвенирование предпочтительнее моногенного анализа: прежде всего, возможность идентифицировать мутации в генах, не подвергшихся тестированию ввиду нетипичного клинического проявления<ref name="raffan" /> и идентификация клинических случаев, при которых мутации в разных генах вызывают различные проявления у одного и того же пациента.<ref name="multiple" /> Кроме того метод позволяет диагностировать заболевания на ранних этапах и у молодых пациентов, до проявления всего спектра характерных симптомов; используется для [[Пренатальный скрининг|пренатальной]] диагностики<ref name=":2" />. В некоторых случаях пренатальное секвенирование экзома позволяет выявить генетические заболевания, в то время как стандартные методы (кариотипирование и использование микрочипов) оказываются неэффективны<ref>{{Статья|автор=Sunayna Best, Karen Wou, Neeta Vora, Ignatia B. Van der Veyver, Ronald Wapner|год=2017-07-25|doi=10.1002/pd.5102|issn=0197-3851|выпуск=1|страницы=10–19|издание=Prenatal Diagnosis|заглавие=Promises, pitfalls and practicalities of prenatal whole exome sequencing|ссылка=http://dx.doi.org/10.1002/pd.5102|том=38|язык=045|тип=|месяц=|число=|номер=}}</ref>.
Идентификация мутаций, вызывающих заболевания, может внести существенный вклад в диагностические и терапевтические подходы, поможет прогнозировать развитие заболевания и позволит тестировать родственников, находящихся в зоне риска.<ref name=":0" /><ref>{{Статья|автор=Sarah B Ng, Kati J Buckingham, Choli Lee, Abigail W Bigham, Holly K Tabor|год=2010-1|doi=10.1038/ng.499|issn=1061-4036, 1546-1718|выпуск=1|язык=en|страницы=30–35|издание=Nature Genetics|заглавие=Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder|ссылка=http://www.nature.com/articles/ng.499|том=42}}</ref><ref name=":13">{{Статья|автор=Murim Choi, Ute I. Scholl, Weizhen Ji, Tiewen Liu, Irina R. Tikhonova|год=2009-11-10|doi=10.1073/pnas.0910672106|issn=0027-8424, 1091-6490|выпуск=45|язык=en|страницы=19096–19101|издание=Proceedings of the National Academy of Sciences|заглавие=Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing|ссылка=http://www.pnas.org/lookup/doi/10.1073/pnas.0910672106|том=106}}</ref><ref>{{Статья|автор=Kaya Bilgüvar, Ali Kemal Öztürk, Angeliki Louvi, Kenneth Y. Kwan, Murim Choi|год=2010-09-09|doi=10.1038/nature09327|issn=0028-0836, 1476-4687|выпуск=7312|страницы=207–210|издание=Nature|заглавие=Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature09327|том=467}}</ref><ref>{{Статья|автор=Elizabeth A Worthey, Alan N Mayer, Grant D Syverson, Daniel Helbling, Benedetta B Bonacci|год=2011-3|doi=10.1097/GIM.0b013e3182088158|issn=1098-3600, 1530-0366|выпуск=3|страницы=255–262|издание=Genetics in Medicine|заглавие=Making a definitive diagnosis: Successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease|ссылка=http://www.nature.com/doifinder/10.1097/GIM.0b013e3182088158|том=13}}</ref><ref name=":14">{{Статья|автор=Eleanor Raffan, Liam A. Hurst, Saeed Al Turki, Gillian Carpenter, Carol Scott|год=2011|doi=10.3389/fendo.2011.00008|issn=1664-2392|издание=Frontiers in Endocrinology|заглавие=Early Diagnosis of Werner's Syndrome Using Exome-Wide Sequencing in a Single, Atypical Patient|ссылка=http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2011.00008/abstract|том=2}}</ref> Есть несколько факторов, делающих экзомное секвенирование предпочтительнее моногенного анализа: прежде всего, возможность идентифицировать мутации в генах, не подвергшихся тестированию ввиду нетипичного клинического проявления<ref name=":14" /> и идентификация клинических случаев, при которых мутации в разных генах вызывают различные проявления у одного и того же пациента.<ref>{{Статья|автор=Sarah B Ng, Kati J Buckingham, Choli Lee, Abigail W Bigham, Holly K Tabor|год=2010-1|doi=10.1038/ng.499|issn=1061-4036, 1546-1718|выпуск=1|язык=en|страницы=30–35|издание=Nature Genetics|заглавие=Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder|ссылка=http://www.nature.com/articles/ng.499|том=42}}</ref> Кроме того метод позволяет диагностировать заболевания на ранних этапах и у молодых пациентов, до проявления всего спектра характерных симптомов; используется для [[Пренатальный скрининг|пренатальной]] диагностики.<ref name=":2" /> В некоторых случаях пренатальное секвенирование экзома позволяет выявить генетические заболевания, в то время как стандартные методы (кариотипирование и использование микрочипов) оказываются неэффективны.<ref>{{Статья|автор=Sunayna Best, Karen Wou, Neeta Vora, Ignatia B. Van der Veyver, Ronald Wapner|год=2017-07-25|doi=10.1002/pd.5102|issn=0197-3851|выпуск=1|страницы=10–19|издание=Prenatal Diagnosis|заглавие=Promises, pitfalls and practicalities of prenatal whole exome sequencing|ссылка=http://dx.doi.org/10.1002/pd.5102|том=38|язык=045|тип=|месяц=|число=|номер=}}</ref>


Авторы важнейшей рецензированной публикации об экзомном секвенировании подчеркивают полезность этого метода для клинической практики. Авторы, применившие экзомное секвенирование для идентификации мутации, вызывающей [[синдром Барттера]] и конгенительную хлоридную диарею, заявляют: ''«Мы видим будущее, в котором подобная информация станет частью повседневной клинической оценки пациентов с подозрениями на генетические заболевания с неясным диагнозом… Мы предвидим, что полноэкзомное секвенирование внесет огромный вклад в понимание того, какие гены и какими путями участвуют в развитии редких и частых человеческих болезней, а также в клиническую практику»<ref name="pmid19861545" />.''
Авторы важнейшей рецензированной публикации об экзомном секвенировании подчеркивают полезность этого метода для клинической практики. Авторы, применившие экзомное секвенирование для идентификации мутации, вызывающей [[синдром Барттера]] и конгенительную хлоридную диарею, заявляют: ''«Мы видим будущее, в котором подобная информация станет частью повседневной клинической оценки пациентов с подозрениями на генетические заболевания с неясным диагнозом… Мы предвидим, что полноэкзомное секвенирование внесет огромный вклад в понимание того, какие гены и какими путями участвуют в развитии редких и частых человеческих болезней, а также в клиническую практику».''<ref name=":13" />


==== Картирование редких полиморфизмов при комплексных расстройствах и менделевских болезнях ====
==== Картирование редких полиморфизмов при комплексных расстройствах и менделевских болезнях ====
Текущие крупные международные исследования направлены на определение в геноме частых [[Однонуклеотидный полиморфизм|полиморфизмов]], которые легче всего идентифицировать современными методами. Однако из-за отрицательного отбора полиморфизмы, вызывающие очень тяжелые заболевания, в частности, менделевские болезни, встречаются с существенно меньшей [[Аллели|аллельной]] частотой и могут быть не найдены в ходе поиска генов-кандидатов при использовании современных стандартных методов генотипирования, при этом чаще всего они расположены в границах экзома. Полное секвенирование экзома — подход, позволяющий находить в геноме новые полиморфизмы. Так как при комплексных расстройствах с риском заболевания связано большое количество генов, для обнаружения их необходимы исследования очень большой выборки, поэтому, с точки зрения издержек, полногеномное секвенирование не является оптимальным. К тому же полиморфизмы в кодирующих областях изучаются очень подробно, и их функциональное значение проще определить<ref>Nickerson, S., Marquis-Nicholson, R., Claxton, K., Ashton, F., Leong, I., Prosser, D., … Love, D. (2015). SNP Analysis and Whole Exome Sequencing: Their Application in the Analysis of a Consanguineous Pedigree Segregating Ataxia. Microarrays, 4(4), 490—502. <nowiki>https://doi.org/10.3390/microarrays4040490</nowiki></ref>. Успешная модель идентификации менделевских генов включает определение возникающих [[:en:De novo|de novo]] полиморфизмов при секвенировании генов двух родителей и потомка<ref name=":12">Lee, H., Deignan, J. L., Dorrani, N., Strom, S. P., Kantarci, S., Quintero-Rivera, F., … Nelson, S. F. (2014). Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA, 312(18), 1880. <nowiki>https://doi.org/10.1001/jama.2014.14604</nowiki></ref>.
Текущие крупные международные исследования направлены на определение в геноме частых [[Однонуклеотидный полиморфизм|полиморфизмов]], которые легче всего идентифицировать современными методами. Однако из-за отрицательного отбора полиморфизмы, вызывающие очень тяжелые заболевания, в частности, менделевские болезни, встречаются с существенно меньшей [[Аллели|аллельной]] частотой и могут быть не найдены в ходе поиска генов-кандидатов при использовании современных стандартных методов генотипирования, при этом чаще всего они расположены в границах экзома. Полное секвенирование экзома — подход, позволяющий находить в геноме новые полиморфизмы. Так как при комплексных расстройствах с риском заболевания связано большое количество генов, для обнаружения их необходимы исследования очень большой выборки, поэтому, с точки зрения издержек, полногеномное секвенирование не является оптимальным. К тому же полиморфизмы в кодирующих областях изучаются очень подробно, и их функциональное значение проще определить.<ref>{{Статья|автор=Sarah Nickerson, Renate Marquis-Nicholson, Karen Claxton, Fern Ashton, Ivone Leong|год=2015-10-23|doi=10.3390/microarrays4040490|issn=2076-3905|выпуск=4|язык=en|страницы=490–502|издание=Microarrays|заглавие=SNP Analysis and Whole Exome Sequencing: Their Application in the Analysis of a Consanguineous Pedigree Segregating Ataxia|ссылка=http://www.mdpi.com/2076-3905/4/4/490|том=4}}</ref> Успешная модель идентификации менделевских генов включает определение возникающих [[:en:De novo|de novo]] полиморфизмов при секвенировании генов двух родителей и потомка<ref>{{Статья|автор=Hane Lee, Joshua L. Deignan, Naghmeh Dorrani, Samuel P. Strom, Sibel Kantarci|год=2014-11-12|doi=10.1001/jama.2014.14604|issn=0098-7484|выпуск=18|язык=en|страницы=1880|издание=JAMA|заглавие=Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders|ссылка=http://jama.jamanetwork.com/article.aspx?doi=10.1001/jama.2014.14604|том=312}}</ref>.


=== Использование в сельском хозяйстве ===
=== Использование в сельском хозяйстве ===
Геномы растений могут быть чрезвычайно сложными, повторяющимися и часто [[Плоидность|полиплоидными]]; в результате некоторые из наиболее экономически важных культур не очень хорошо подходят для изучения с использованием полногеномного секвенирования. Разработан набор для обогащения экзома пшеницы на основе накопленных данных транскриптома<ref name=":7">{{Статья|автор=Mark O. Winfield, Paul A. Wilkinson, Alexandra M. Allen, Gary L. A. Barker, Jane A. Coghill|год=2012-8|выпуск=6|язык=en|страницы=733–742|издание=Plant Biotechnology Journal|заглавие=Targeted re-sequencing of the allohexaploid wheat exome: Wheat exome capture and targeted re-sequencing|ссылка=http://doi.wiley.com/10.1111/j.1467-7652.2012.00713.x|том=10|тип=|месяц=|число=|номер=}}</ref>, с использование которого были проведены исследования нежелательной внутрикультурной генетической гетерогенности экзома, влияющей на [[фенотип]] растения, в частности скорость роста, способность жить в различных условиях и другие важные для [[Селекция растений|селекции]] признаки. Подобные же наборы были использованы при исследовании риса (''Oryza sativa'')<ref name=":8">{{Статья|автор=I. M. Henry, U. Nagalakshmi, M. C. Lieberman, K. J. Ngo, K. V. Krasileva|год=2014-04-01|doi=10.1105/tpc.113.121590|issn=1040-4651, 1532-298X|выпуск=4|язык=en|страницы=1382–1397|издание=The Plant Cell|заглавие=Efficient Genome-Wide Detection and Cataloging of EMS-Induced Mutations Using Exome Capture and Next-Generation Sequencing|ссылка=http://www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.113.121590|том=26}}</ref> и сои (''Glycine max'')<ref name=":9">{{Статья|автор=Y.-T. Bolon, W. J. Haun, W. W. Xu, D. Grant, M. G. Stacey|год=2011-05-01|doi=10.1104/pp.110.170811|issn=0032-0889, 1532-2548|выпуск=1|язык=en|страницы=240–253|издание=PLANT PHYSIOLOGY|заглавие=Phenotypic and Genomic Analyses of a Fast Neutron Mutant Population Resource in Soybean|ссылка=http://www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.110.170811|том=156}}</ref>. Также можно идентифицировать генетические маркеры, отвечающие за особую устойчивость растительных культур к определенным патогенам<ref name=":10">{{Статья|автор=Neele Wendler, Martin Mascher, Christiane Nöh, Axel Himmelbach, Uwe Scholz|год=2014-10|doi=10.1111/pbi.12219|выпуск=8|язык=en|страницы=1122–1131|издание=Plant Biotechnology Journal|заглавие=Unlocking the secondary gene-pool of barley with next-generation sequencing|ссылка=http://doi.wiley.com/10.1111/pbi.12219|том=12}}</ref>.
Геномы растений могут быть чрезвычайно сложными, повторяющимися и часто [[Плоидность|полиплоидными]]; в результате некоторые из наиболее экономически важных культур не очень хорошо подходят для изучения с использованием полногеномного секвенирования. Разработан набор для обогащения экзома пшеницы на основе накопленных данных транскриптома,<ref name=":7">{{Статья|автор=Mark O. Winfield, Paul A. Wilkinson, Alexandra M. Allen, Gary L. A. Barker, Jane A. Coghill|год=2012-8|выпуск=6|язык=en|страницы=733–742|издание=Plant Biotechnology Journal|заглавие=Targeted re-sequencing of the allohexaploid wheat exome: Wheat exome capture and targeted re-sequencing|ссылка=http://doi.wiley.com/10.1111/j.1467-7652.2012.00713.x|том=10|тип=|месяц=|число=|номер=}}</ref> с использование которого были проведены исследования нежелательной внутрикультурной генетической гетерогенности экзома, влияющей на [[фенотип]] растения, в частности скорость роста, способность жить в различных условиях и другие важные для [[Селекция растений|селекции]] признаки. Подобные же наборы были использованы при исследовании риса (''Oryza sativa'')<ref name=":8">{{Статья|автор=I. M. Henry, U. Nagalakshmi, M. C. Lieberman, K. J. Ngo, K. V. Krasileva|год=2014-04-01|doi=10.1105/tpc.113.121590|issn=1040-4651, 1532-298X|выпуск=4|язык=en|страницы=1382–1397|издание=The Plant Cell|заглавие=Efficient Genome-Wide Detection and Cataloging of EMS-Induced Mutations Using Exome Capture and Next-Generation Sequencing|ссылка=http://www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.113.121590|том=26}}</ref> и сои (''Glycine max'')<ref name=":9">{{Статья|автор=Y.-T. Bolon, W. J. Haun, W. W. Xu, D. Grant, M. G. Stacey|год=2011-05-01|doi=10.1104/pp.110.170811|issn=0032-0889, 1532-2548|выпуск=1|язык=en|страницы=240–253|издание=PLANT PHYSIOLOGY|заглавие=Phenotypic and Genomic Analyses of a Fast Neutron Mutant Population Resource in Soybean|ссылка=http://www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.110.170811|том=156}}</ref>. Также можно идентифицировать генетические маркеры, отвечающие за особую устойчивость растительных культур к определенным патогенам.<ref name=":10">{{Статья|автор=Neele Wendler, Martin Mascher, Christiane Nöh, Axel Himmelbach, Uwe Scholz|год=2014-10|doi=10.1111/pbi.12219|выпуск=8|язык=en|страницы=1122–1131|издание=Plant Biotechnology Journal|заглавие=Unlocking the secondary gene-pool of barley with next-generation sequencing|ссылка=http://doi.wiley.com/10.1111/pbi.12219|том=12}}</ref>


Секвенирование экзома также может быть использовано как альтернатива более дорогому секвенированию полного генома, например при исследовании генетических вариаций внутри и между популяциями<ref>{{Статья|автор=Shen Song, Na Yao, Min Yang, Xuexue Liu, Kunzhe Dong|год=2016-02-18|doi=10.1186/s12864-016-2449-0|issn=1471-2164|выпуск=1|издание=BMC Genomics|заглавие=Exome sequencing reveals genetic differentiation due to high-altitude adaptation in the Tibetan cashmere goat (Capra hircus)|ссылка=http://dx.doi.org/10.1186/s12864-016-2449-0|том=17|язык=en|тип=|месяц=|число=|номер=|страницы=}}</ref>.
Секвенирование экзома также может быть использовано как альтернатива более дорогому секвенированию полного генома, например при исследовании генетических вариаций внутри и между популяциями.<ref>{{Статья|автор=Shen Song, Na Yao, Min Yang, Xuexue Liu, Kunzhe Dong|год=2016-02-18|doi=10.1186/s12864-016-2449-0|issn=1471-2164|выпуск=1|издание=BMC Genomics|заглавие=Exome sequencing reveals genetic differentiation due to high-altitude adaptation in the Tibetan cashmere goat (Capra hircus)|ссылка=http://dx.doi.org/10.1186/s12864-016-2449-0|том=17|язык=en|тип=|месяц=|число=|номер=|страницы=}}</ref>


== Сравнение с генотипированием с использованием микрочипов ==
== Сравнение с генотипированием с использованием микрочипов ==
Методы микрочипирования требуют зондов для гибридизации с известной последовательностью, поэтому они ограничены в области разработки зондов и не позволяют выявить некоторые генетические изменения. Технологии высокопроизводительного секвенирования, используемые для секвенирования экзома, позволяют узнать последовательности гораздо большего числа локусов одновременно и определить неизвестные до сих пор источники многих болезней<ref name="L">{{Cite journal|author=Biesecker LG|title=Exome sequencing makes medical genomics a reality|journal=Nat. Genet.|date=Jan 2010|volume=42|issue=1|pages=13–14|pmid=20037612|doi=10.1038/ng0110-13}}</ref>, то есть позволяют обойти ограничения генотипирующих чипов и классического секвенирования<ref>Berberich, A. J., Ho, R., & Hegele, R. A. (2018). Whole genome sequencing in the clinic: empowerment or too much information? Canadian Medical Association Journal, 190(5), E124-E125. <nowiki>https://doi.org/10.1503/cmaj.180076</nowiki></ref>.
Методы микрочипирования требуют зондов для гибридизации с известной последовательностью, поэтому они ограничены в области разработки зондов и не позволяют выявить некоторые генетические изменения. Технологии высокопроизводительного секвенирования, используемые для секвенирования экзома, позволяют узнать последовательности гораздо большего числа локусов одновременно и определить неизвестные до сих пор источники многих болезней,<ref>{{Статья|автор=Leslie G Biesecker|год=2010-1|doi=10.1038/ng0110-13|issn=1061-4036, 1546-1718|выпуск=1|язык=en|страницы=13–14|издание=Nature Genetics|заглавие=Exome sequencing makes medical genomics a reality|ссылка=http://www.nature.com/articles/ng0110-13|том=42}}</ref> то есть позволяют обойти ограничения генотипирующих чипов и классического секвенирования.<ref>{{Статья|автор=Amanda J. Berberich, Rosettia Ho, Robert A. Hegele|год=2018-02-05|doi=10.1503/cmaj.180076|issn=0820-3946, 1488-2329|выпуск=5|язык=en|страницы=E124–E125|издание=Canadian Medical Association Journal|заглавие=Whole genome sequencing in the clinic: empowerment or too much information?|ссылка=http://www.cmaj.ca/lookup/doi/10.1503/cmaj.180076|том=190}}</ref>


Секвенирование экзома — процедура более дорогая, но по мере уменьшения финансовых затрат и увеличения производительности методов секвенирования этот метод все шире используется в практике для работы с редкими генетическими заболеваниями.
Секвенирование экзома — процедура более дорогая, но по мере уменьшения финансовых затрат и увеличения производительности методов секвенирования этот метод все шире используется в практике для работы с редкими генетическими заболеваниями.


== Ограничения ==
== Ограничения ==
Некоторые болезни могут быть связаны с мутациями в некодирующих областях или структурными перестройками, которые секвенирование экзома не позволит выявить<ref name="S" />. Но из-за дороговизны полногеномного секвенирования на нынешнем этапе развития науки и технологий экзомное секвенирование представляется оптимальным методом для клинической диагностики редких наследственных заболеваний, не выявляемых микрочипами<ref name="pmid19861545"/>.
Некоторые болезни могут быть связаны с мутациями в некодирующих областях или структурными перестройками, которые секвенирование экзома не позволит выявить.<ref name=":0" /> Но из-за дороговизны полногеномного секвенирования на нынешнем этапе развития науки и технологий экзомное секвенирование представляется оптимальным методом для клинической диагностики редких наследственных заболеваний, не выявляемых микрочипами.<ref name=":13" />

⚫
Статистический анализ больших объёмов данных в ходе секвенирования экзома — отдельная трудоемкая задача. Есть несколько подходов для улучшения качества экзомных данных:<ref name=":0" />


⚫
Статистический анализ больших объёмов данных в ходе секвенирования экзома — отдельная трудоемкая задача. Есть несколько подходов для улучшения качества экзомных данных<ref name="S" />:
* сравнение полиморфизмов, определённых с помощью секвенирования и микрочипирования;
* сравнение полиморфизмов, определённых с помощью секвенирования и микрочипирования;
* сравнение кодирующих [[Однонуклеотидный полиморфизм|ОНП]] с данными полногеномного секвенирования пациентов с таким же заболеванием;
* сравнение кодирующих [[Однонуклеотидный полиморфизм|ОНП]] с данными полногеномного секвенирования пациентов с таким же заболеванием;
* сравнение кодирующих ОНП с гаплотипами, отсеквенированными по Сэнгеру.
* сравнение кодирующих ОНП с гаплотипами, отсеквенированными по Сэнгеру.


Для некоторых видов качество сборки генома и его аннотация значительно хуже, чем для человека (или секвенированного генома нет вовсе). Это сильно ограничивает применение секвенирования экзома к другим организмам, поскольку осложняет обогащение образцов ДНК и картирование результатов секвенирования на геном<ref name=":2" />.
Для некоторых видов качество сборки генома и его аннотация значительно хуже, чем для человека (или секвенированного генома нет вовсе). Это сильно ограничивает применение секвенирования экзома к другим организмам, поскольку осложняет обогащение образцов ДНК и картирование результатов секвенирования на геном.<ref name=":2" />


== Примечания ==
== Примечания ==

Версия от 12:33, 5 мая 2019

Секвенирование экзома — секвенирование всех белок-кодирующих генов в геноме (то есть экзома). Она состоит из двух шагов: первый шаг — отбор экзонов. В зависимости от организма, экзоны покрывают 1-2 % генома.[1] У человека их насчитывается около 180 000, примерно 1 % от всего генома, или приблизительно 30 миллионов пар нуклеотидов. Второй шаг — секвенирование экзонов с использованием любой платформы высокопроизводительного секвенирования ДНК.[2]

Секвенирование экзома позволяет обнаружить генетические изменения, приводящие к изменению белковых последовательностей, которые могут приводить к возникновению заболеваний, таких как атеросклероз, болезнь Альцгеймера и др. Основное преимущество экзомного секвенирования в возможности проводить массовый скрининг генов и обнаруживать мутации, ассоциированные с заболеваниями, но при этом проще и дешевле, чем полногеномное секвенирование.[1]

Схема секвенирования экзома. Начало.
Схема секвенирования экзома. Окончание.

Методология

Секвенирование экзома включает в себя четыре этапа: выделение ДНК из предоставленного материала, отбор интересующей фракции ДНК (обогащение образцов), секвенирование отобранного материала и анализ полученных результатов.[3]

Выделение ДНК

Первый этап заключается в подготовке высококачественных препаратов геномной ДНК (gDNA) из предоставленных образцов. Стандартный метод выделения ДНК — экстракция смесью фенол-хлороформ.

Стратегии обогащения образцов

Стратегии обогащения образцов позволяют селективно отбирать нужные геномные участки, то есть экзоны, из образцов ДНК до этапа секвенирования. С момента описания первого оригинального метода в 2005 году разработано несколько стратегий обогащения образцов, подходящих для целей экзомного секвенирования.[4] Выбор конкретного метода зависит от размеров интересующих участков, потребности в покрытии при секвенировании, имеющегося в наличии оборудования и т. д.[5]

ПЦР

Принцип полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко применяется для амплификации (размножения) требуемых фрагментов ДНК уже более 20 лет.[6] Обычно в ПЦР используют только 2 праймера, однако разработаны методы мультиплексной ПЦР, которая использует несколько праймеров и позволяет одновременно амплифицировать несколько ДНК-мишеней в ходе одного процесса. Подходы, использующие ПЦР, очень эффективны, но не позволяют работать с участками генома длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов (п. н.) из-за высокой цены и низкого качества получающихся образцов[1].

Метод молекулярной инверсии

Метод молекулярной инверсии

Метод молекулярной инверсии — это техника, которая позволяет получить образцы ДНК, обогащенные амплифицированными инвертированными участками целевых последовательностей. Отбор нужных последовательностей происходит за счет замыкания интересующего участка в кольцо. Праймер для этого метода представляет собой одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид, в центральной части которого содержится универсальная последовательность с сайтами рестрикции, а концы комплементарны двум участкам геномной ДНК, между которыми находится интересующая последовательность (например, экзон). Образцы, не вступившие в реакцию, остаются линейными и удаляются экзонуклеазами.[4][7] Метод может быть полезен для работы с небольшим числом мишеней в большом количестве образцов. Главный недостаток такого метода целевого обогащения — единообразие получаемых образцов, а также высокая цена при необходимости покрыть большой набор участков.[6]

Гибридизационное обогащение

Для этого вида обогащения образцов экзомными участками создаются специальные микрочипы, содержащие закрепленные на подложке одноцепочечные олигонуклеотиды (зонды) с последовательностями из генома, способными покрыть интересующие участки. Геномная ДНК разрезается на фрагменты. Концы фрагментов затупляют, добавляют адаптеры с универсальными праймерными последовательностями. Эти фрагменты гибридизуются с олигонуклеотидами (зондами) на микрочипах. Негибридизованные фрагменты отмываются с подложки, а оставшиеся затем амплифицируются ПЦР.[4] Ограничения метода связаны с дороговизной аппаратуры, количеством зондов, которые можно разместить на матрице и необходимостью достаточно больших количеств ДНК для анализа.[1]

Обогащение в растворе

Обогащение в растворе

В растворе синтезируется специальный набор олигонуклеотидов (зондов), которые прикрепляются к стрептавидиновым шарикам. Шарики с олигонуклеотидными зондами помещаются в раствор с фрагментированной геномной ДНК, где происходит селективная гибридизация зондов с нужными геномными участками, после чего шарики с интересующими фрагментами можно осадить и отмыть. Затем оставшиеся участки секвенируют. Этот метод был разработан для усовершенствования метода гибридизационного обогащения: он позволяет создать избыток зондов к целевым участкам по сравнению с необходимым количеством образца. Оптимальный размер целевого участка ДНК — около 3,5 миллионов п. н., так при последующем секвенировании получается очень хорошее покрытие.[6]

Платформы, используемые для обогащения экзома

Основными поставщиками платформ для обогащения экзома являются NimbleGen, Agilent и Illumina.[1]

Сравнение характеристик каждой из наиболее распространенных платформ для обогащения экзома[1]
NimbleGen’s SeqCap EZ Exome Library Agilent’s Sure Select Human All Exon Kit Illumina’s TruSeq Exome Enrichment Kit Illumina’s Nextera Rapid Capture Exome Kit
Длина зондов 55 — 105[8] 114 — 126[8] 95 95
Рекомендованное количество ДНК пробы 3 микрограмма[9] 3 микрограмма[9] 500 нанограмм[9] 50 нанограмм[9]
Тип нуклеиновой кислоты зонда ДНК РНК ДНК ДНК
Стратегия покрытия интересующего фрагмента зондами Перекрывающиеся зонды[8] Чаще строго последовательные зонды, чем перекрывающиеся Гэпы между последовательностями зондов Гэпы между последовательностями зондов
Метод фрагментации Ультразвук Ультразвук Ультразвук Транспозаза
Размер целевого фрагмента (для человека) 64 50 62 62
Риды, остающиеся после фильтрации 66% 71,7% 54,8%[10] 40,1%
Основные сильные стороны Высокая чувствительность и специфичность. Наиболее равномерное покрытие в трудных регионах.[8][11][12] Хорошее покрытие инделов[8][12][10]. Высокая скорость выравнивания. Меньше повторных чтений, чем у других платформ.[12] Хорошее покрытие UTRs и микроРНК[8] Хорошее покрытие UTRs и микроРНК
Основные слабые стороны Больше повторных чтений, чем у Agilent. Меньшая скорость выравнивания. Меньше качественных чтений, чем у NimbleGen[11] Высокий уровень нецелевого обогащения[8] Высокий уровень нецелевого обогащения. Смещение покрытия для областей с высоким содержанием GC, снижающего однородность
Использование не только для человеческих последовательностей Да Да Нет Нет

В настоящее время, в дополнение к наборам, нацеленным лишь на человека, NimbleGen предлагает наборы для экзомов кукурузы, ячменя, пшеницы, сои, мыши и свиньи, а Agilent — для экзомов мыши, крупного рогатого скота и рыбок данио. Оба провайдера также предлагают возможность разрабатывать индивидуальные комплекты для других видов. Наборы для нечеловеческих видов используют протоколы и зонды, аналогичные человеческим наборам поставщиков. Оба производителя предлагают гибкий процесс проектирования, который позволяет вносить изменения для улучшения покрытия для конкретных регионов и целей.[1]

Секвенирование

Основная статья: Методы секвенирования нового поколения

Существует несколько технологий секвенирования, включая классический метод секвенирования по Сэнгеру. Методы секвенирования нового поколения используют платформы Illumina, SOLiD и Ion-Torrent. Все эти методы могут использоваться в том числе и для секвенирования экзома.[13]

Анализ результатов

Первичные («сырые») данные секвенирования представляют собой огромный набор небольших последовательностей (чтений), длина и качество которых зависят от технических характеристик секвенатора и способа приготовления образцов. Качество чтений можно контролировать, например, при помощи программного пакета FastQС. Полученные чтения фильтруются: отрезаются концевые участки, которые часто имеют большое число ошибок, и удаляются адаптерные последовательности (например, с помощью Trimmomatic или sickle); затем корректируются ошибки (Bloocoo, Lighter). Отфильтрованные чтения картируются на геном, где собираются в последовательности, соответствующие экзонам. В настоящий момент существует множество программ, которые осуществляют каждый этап подготовки данных секвенирования и их анализа, большинство из них требует больших вычислительных мощностей, так как объём получаемых данных очень велик.[14]

Применение экзомного секвенирования

Используя экзомное секвенирование, в ходе исследований с фиксированными затратами могут секвенироваться последовательности с существенно большей глубиной покрытия по сравнению с покрытием, получаемым методами полногеномного секвенирования. Благодаря этому экзомное секвенирование больше подходит для некоторых задач, требующих надежного определения полиморфизмов.[15]

Клиническая диагностика

29-го сентября 2011 года компания Ambry Genetics стала первой сертифицированной компанией, предлагающей секвенирование экзомов и клиническую диагностику заболеваний на его основе.[16] В компании утверждают, что результаты экзомного секвенирования позволят сотрудникам диагностировать пациентов с болезнями, при которых традиционные диагностические подходы неприменимы.[17]

Идентификация мутаций, вызывающих заболевания, может внести существенный вклад в диагностические и терапевтические подходы, поможет прогнозировать развитие заболевания и позволит тестировать родственников, находящихся в зоне риска.[2][18][19][20][21][22] Есть несколько факторов, делающих экзомное секвенирование предпочтительнее моногенного анализа: прежде всего, возможность идентифицировать мутации в генах, не подвергшихся тестированию ввиду нетипичного клинического проявления[22] и идентификация клинических случаев, при которых мутации в разных генах вызывают различные проявления у одного и того же пациента.[23] Кроме того метод позволяет диагностировать заболевания на ранних этапах и у молодых пациентов, до проявления всего спектра характерных симптомов; используется для пренатальной диагностики.[1] В некоторых случаях пренатальное секвенирование экзома позволяет выявить генетические заболевания, в то время как стандартные методы (кариотипирование и использование микрочипов) оказываются неэффективны.[24]

Авторы важнейшей рецензированной публикации об экзомном секвенировании подчеркивают полезность этого метода для клинической практики. Авторы, применившие экзомное секвенирование для идентификации мутации, вызывающей синдром Барттера и конгенительную хлоридную диарею, заявляют: «Мы видим будущее, в котором подобная информация станет частью повседневной клинической оценки пациентов с подозрениями на генетические заболевания с неясным диагнозом… Мы предвидим, что полноэкзомное секвенирование внесет огромный вклад в понимание того, какие гены и какими путями участвуют в развитии редких и частых человеческих болезней, а также в клиническую практику».[19]

Картирование редких полиморфизмов при комплексных расстройствах и менделевских болезнях

Текущие крупные международные исследования направлены на определение в геноме частых полиморфизмов, которые легче всего идентифицировать современными методами. Однако из-за отрицательного отбора полиморфизмы, вызывающие очень тяжелые заболевания, в частности, менделевские болезни, встречаются с существенно меньшей аллельной частотой и могут быть не найдены в ходе поиска генов-кандидатов при использовании современных стандартных методов генотипирования, при этом чаще всего они расположены в границах экзома. Полное секвенирование экзома — подход, позволяющий находить в геноме новые полиморфизмы. Так как при комплексных расстройствах с риском заболевания связано большое количество генов, для обнаружения их необходимы исследования очень большой выборки, поэтому, с точки зрения издержек, полногеномное секвенирование не является оптимальным. К тому же полиморфизмы в кодирующих областях изучаются очень подробно, и их функциональное значение проще определить.[25] Успешная модель идентификации менделевских генов включает определение возникающих de novo полиморфизмов при секвенировании генов двух родителей и потомка[26].

Использование в сельском хозяйстве

Геномы растений могут быть чрезвычайно сложными, повторяющимися и часто полиплоидными; в результате некоторые из наиболее экономически важных культур не очень хорошо подходят для изучения с использованием полногеномного секвенирования. Разработан набор для обогащения экзома пшеницы на основе накопленных данных транскриптома,[27] с использование которого были проведены исследования нежелательной внутрикультурной генетической гетерогенности экзома, влияющей на фенотип растения, в частности скорость роста, способность жить в различных условиях и другие важные для селекции признаки. Подобные же наборы были использованы при исследовании риса (Oryza sativa)[28] и сои (Glycine max)[29]. Также можно идентифицировать генетические маркеры, отвечающие за особую устойчивость растительных культур к определенным патогенам.[30]

Секвенирование экзома также может быть использовано как альтернатива более дорогому секвенированию полного генома, например при исследовании генетических вариаций внутри и между популяциями.[31]

Сравнение с генотипированием с использованием микрочипов

Методы микрочипирования требуют зондов для гибридизации с известной последовательностью, поэтому они ограничены в области разработки зондов и не позволяют выявить некоторые генетические изменения. Технологии высокопроизводительного секвенирования, используемые для секвенирования экзома, позволяют узнать последовательности гораздо большего числа локусов одновременно и определить неизвестные до сих пор источники многих болезней,[32] то есть позволяют обойти ограничения генотипирующих чипов и классического секвенирования.[33]

Секвенирование экзома — процедура более дорогая, но по мере уменьшения финансовых затрат и увеличения производительности методов секвенирования этот метод все шире используется в практике для работы с редкими генетическими заболеваниями.

Ограничения

Некоторые болезни могут быть связаны с мутациями в некодирующих областях или структурными перестройками, которые секвенирование экзома не позволит выявить.[2] Но из-за дороговизны полногеномного секвенирования на нынешнем этапе развития науки и технологий экзомное секвенирование представляется оптимальным методом для клинической диагностики редких наследственных заболеваний, не выявляемых микрочипами.[19]

Статистический анализ больших объёмов данных в ходе секвенирования экзома — отдельная трудоемкая задача. Есть несколько подходов для улучшения качества экзомных данных:[2]

  • сравнение полиморфизмов, определённых с помощью секвенирования и микрочипирования;
  • сравнение кодирующих ОНП с данными полногеномного секвенирования пациентов с таким же заболеванием;
  • сравнение кодирующих ОНП с гаплотипами, отсеквенированными по Сэнгеру.

Для некоторых видов качество сборки генома и его аннотация значительно хуже, чем для человека (или секвенированного генома нет вовсе). Это сильно ограничивает применение секвенирования экзома к другим организмам, поскольку осложняет обогащение образцов ДНК и картирование результатов секвенирования на геном.[1]

Примечания

  1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Amanda Warr, Christelle Robert, David Hume, Alan Archibald, Nader Deeb. Exome Sequencing: Current and Future Perspectives (англ.) // G3&#58; Genes|Genomes|Genetics. — 2015-8. — Vol. 5, iss. 8. — P. 1543–1550. — ISSN 2160-1836. — doi:10.1534/g3.115.018564.
  2. ↑ 1 2 3 4 Sarah B. Ng, Emily H. Turner, Peggy D. Robertson, Steven D. Flygare, Abigail W. Bigham. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes // Nature. — 2009-09-10. — Т. 461, вып. 7261. — С. 272–276. — ISSN 1476-4687 0028-0836, 1476-4687. — doi:10.1038/nature08250.
  3. ↑ Whole Exome Sequencing | Detect exonic variants. www.illumina.com. Дата обращения: 5 мая 2019.
  4. ↑ 1 2 3 Emily H. Turner, Sarah B. Ng, Deborah A. Nickerson, Jay Shendure. Methods for Genomic Partitioning (англ.) // Annual Review of Genomics and Human Genetics. — 2009-9. — Vol. 10, iss. 1. — P. 263–284. — ISSN 1545-293X 1527-8204, 1545-293X. — doi:10.1146/annurev-genom-082908-150112.
  5. ↑ Lira Mamanova, Alison J Coffey, Carol E Scott, Iwanka Kozarewa, Emily H Turner. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing (англ.) // Nature Methods. — 2010-2. — Vol. 7, iss. 2. — P. 111–118. — ISSN 1548-7105 1548-7091, 1548-7105. — doi:10.1038/nmeth.1419.
  6. ↑ 1 2 3 Avak Kahvejian, John Quackenbush, John F Thompson. What would you do if you could sequence everything? (англ.) // Nature Biotechnology. — 2008-10. — Vol. 26, iss. 10. — P. 1125–1133. — ISSN 1546-1696 1087-0156, 1546-1696. — doi:10.1038/nbt1494.
  7. ↑ F. Mertes, A. ElSharawy, S. Sauer, J. M. L. M. van Helvoort, P. J. van der Zaag. Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing (англ.) // Briefings in Functional Genomics. — 2011-11-01. — Vol. 10, iss. 6. — P. 374–386. — ISSN 2041-2657 2041-2649, 2041-2657. — doi:10.1093/bfgp/elr033.
  8. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Michael J Clark, Rui Chen, Hugo Y K Lam, Konrad J Karczewski, Rong Chen. Performance comparison of exome DNA sequencing technologies (англ.) // Nature Biotechnology. — 2011-10. — Vol. 29, iss. 10. — P. 908–914. — ISSN 1546-1696 1087-0156, 1546-1696. — doi:10.1038/nbt.1975.
  9. ↑ 1 2 3 4 Eleanor G. Seaby, Reuben J. Pengelly, Sarah Ennis. Exome sequencing explained: a practical guide to its clinical application (англ.) // Briefings in Functional Genomics. — 2016-9. — Vol. 15, iss. 5. — P. 374–384. — ISSN 2041-2657 2041-2649, 2041-2657. — doi:10.1093/bfgp/elv054.
  10. ↑ 1 2 Chandra Sekhar Chilamakuri, Susanne Lorenz, Mohammed-Amin Madoui, Daniel Vodák, Jinchang Sun. Performance comparison of four exome capture systems for deep sequencing (англ.) // BMC Genomics. — 2014. — Vol. 15, iss. 1. — P. 449. — ISSN 1471-2164. — doi:10.1186/1471-2164-15-449.
  11. ↑ 1 2 Anna-Maija Sulonen, Pekka Ellonen, Henrikki Almusa, Maija Lepistö, Samuli Eldfors. Comparison of solution-based exome capture methods for next generation sequencing (англ.) // Genome Biology. — 2011. — Vol. 12, iss. 9. — P. R94. — ISSN 1465-6906. — doi:10.1186/gb-2011-12-9-r94.
  12. ↑ 1 2 3 K. Bodi, A. G. Perera, P. S. Adams, D. Bintzler, K. Dewar. Comparison of Commercially Available Target Enrichment Methods for Next-Generation Sequencing // Journal of Biomolecular Techniques : JBT. — 2013-7. — Т. 24, вып. 2. — С. 73–86. — ISSN 1943-4731 1524-0215, 1943-4731. — doi:10.7171/jbt.13-2402-002.
  13. ↑ Michael Quail, Miriam E Smith, Paul Coupland, Thomas D Otto, Simon R Harris. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers (англ.) // BMC Genomics. — 2012. — Vol. 13, iss. 1. — P. 341. — ISSN 1471-2164. — doi:10.1186/1471-2164-13-341.
  14. ↑ Elaine R. Mardis. The challenges of big data (англ.) // Disease Models & Mechanisms. — 2016-05-01. — Vol. 9, iss. 5. — P. 483–485. — ISSN 1754-8411 1754-8403, 1754-8411. — doi:10.1242/dmm.025585.
  15. ↑ Reuben J Pengelly, Jane Gibson, Gaia Andreoletti, Andrew Collins, Christopher J Mattocks. A SNP profiling panel for sample tracking in whole-exome sequencing studies (англ.) // Genome Medicine. — 2013. — Vol. 5, iss. 9. — P. 89. — ISSN 1756-994X. — doi:10.1186/gm492.
  16. ↑ Ambry Genetics. Ambry Genetics First to Offer Exome Sequencing Service for Clinical Diagnostics. (англ.). www.prnewswire.com. Дата обращения: 5 мая 2019.
  17. ↑ Amber Volk, Erin Conboy, Beverly Wical, Marc Patterson, Salman Kirmani. Whole-Exome Sequencing in the Clinic: Lessons from Six Consecutive Cases from the Clinician's Perspective (англ.) // Molecular Syndromology. — 2015-02-03. — Vol. 6, iss. 1. — P. 23–31. — ISSN 1661-8777 1661-8769, 1661-8777. — doi:10.1159/000371598.
  18. ↑ Sarah B Ng, Kati J Buckingham, Choli Lee, Abigail W Bigham, Holly K Tabor. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder (англ.) // Nature Genetics. — 2010-1. — Vol. 42, iss. 1. — P. 30–35. — ISSN 1546-1718 1061-4036, 1546-1718. — doi:10.1038/ng.499.
  19. ↑ 1 2 3 Murim Choi, Ute I. Scholl, Weizhen Ji, Tiewen Liu, Irina R. Tikhonova. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2009-11-10. — Vol. 106, iss. 45. — P. 19096–19101. — ISSN 1091-6490 0027-8424, 1091-6490. — doi:10.1073/pnas.0910672106.
  20. ↑ Kaya Bilgüvar, Ali Kemal Öztürk, Angeliki Louvi, Kenneth Y. Kwan, Murim Choi. Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations // Nature. — 2010-09-09. — Т. 467, вып. 7312. — С. 207–210. — ISSN 1476-4687 0028-0836, 1476-4687. — doi:10.1038/nature09327.
  21. ↑ Elizabeth A Worthey, Alan N Mayer, Grant D Syverson, Daniel Helbling, Benedetta B Bonacci. Making a definitive diagnosis: Successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease // Genetics in Medicine. — 2011-3. — Т. 13, вып. 3. — С. 255–262. — ISSN 1530-0366 1098-3600, 1530-0366. — doi:10.1097/GIM.0b013e3182088158.
  22. ↑ 1 2 Eleanor Raffan, Liam A. Hurst, Saeed Al Turki, Gillian Carpenter, Carol Scott. Early Diagnosis of Werner's Syndrome Using Exome-Wide Sequencing in a Single, Atypical Patient // Frontiers in Endocrinology. — 2011. — Т. 2. — ISSN 1664-2392. — doi:10.3389/fendo.2011.00008.
  23. ↑ Sarah B Ng, Kati J Buckingham, Choli Lee, Abigail W Bigham, Holly K Tabor. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder (англ.) // Nature Genetics. — 2010-1. — Vol. 42, iss. 1. — P. 30–35. — ISSN 1546-1718 1061-4036, 1546-1718. — doi:10.1038/ng.499.
  24. ↑ Sunayna Best, Karen Wou, Neeta Vora, Ignatia B. Van der Veyver, Ronald Wapner. Promises, pitfalls and practicalities of prenatal whole exome sequencing (045) // Prenatal Diagnosis. — 2017-07-25. — Т. 38, вып. 1. — С. 10–19. — ISSN 0197-3851. — doi:10.1002/pd.5102.
  25. ↑ Sarah Nickerson, Renate Marquis-Nicholson, Karen Claxton, Fern Ashton, Ivone Leong. SNP Analysis and Whole Exome Sequencing: Their Application in the Analysis of a Consanguineous Pedigree Segregating Ataxia (англ.) // Microarrays. — 2015-10-23. — Vol. 4, iss. 4. — P. 490–502. — ISSN 2076-3905. — doi:10.3390/microarrays4040490.
  26. ↑ Hane Lee, Joshua L. Deignan, Naghmeh Dorrani, Samuel P. Strom, Sibel Kantarci. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders (англ.) // JAMA. — 2014-11-12. — Vol. 312, iss. 18. — P. 1880. — ISSN 0098-7484. — doi:10.1001/jama.2014.14604.
  27. ↑ Mark O. Winfield, Paul A. Wilkinson, Alexandra M. Allen, Gary L. A. Barker, Jane A. Coghill. Targeted re-sequencing of the allohexaploid wheat exome: Wheat exome capture and targeted re-sequencing (англ.) // Plant Biotechnology Journal. — 2012-8. — Vol. 10, iss. 6. — P. 733–742.
  28. ↑ I. M. Henry, U. Nagalakshmi, M. C. Lieberman, K. J. Ngo, K. V. Krasileva. Efficient Genome-Wide Detection and Cataloging of EMS-Induced Mutations Using Exome Capture and Next-Generation Sequencing (англ.) // The Plant Cell. — 2014-04-01. — Vol. 26, iss. 4. — P. 1382–1397. — ISSN 1532-298X 1040-4651, 1532-298X. — doi:10.1105/tpc.113.121590.
  29. ↑ Y.-T. Bolon, W. J. Haun, W. W. Xu, D. Grant, M. G. Stacey. Phenotypic and Genomic Analyses of a Fast Neutron Mutant Population Resource in Soybean (англ.) // PLANT PHYSIOLOGY. — 2011-05-01. — Vol. 156, iss. 1. — P. 240–253. — ISSN 1532-2548 0032-0889, 1532-2548. — doi:10.1104/pp.110.170811.
  30. ↑ Neele Wendler, Martin Mascher, Christiane Nöh, Axel Himmelbach, Uwe Scholz. Unlocking the secondary gene-pool of barley with next-generation sequencing (англ.) // Plant Biotechnology Journal. — 2014-10. — Vol. 12, iss. 8. — P. 1122–1131. — doi:10.1111/pbi.12219.
  31. ↑ Shen Song, Na Yao, Min Yang, Xuexue Liu, Kunzhe Dong. Exome sequencing reveals genetic differentiation due to high-altitude adaptation in the Tibetan cashmere goat (Capra hircus) (англ.) // BMC Genomics. — 2016-02-18. — Vol. 17, iss. 1. — ISSN 1471-2164. — doi:10.1186/s12864-016-2449-0.
  32. ↑ Leslie G Biesecker. Exome sequencing makes medical genomics a reality (англ.) // Nature Genetics. — 2010-1. — Vol. 42, iss. 1. — P. 13–14. — ISSN 1546-1718 1061-4036, 1546-1718. — doi:10.1038/ng0110-13.
  33. ↑ Amanda J. Berberich, Rosettia Ho, Robert A. Hegele. Whole genome sequencing in the clinic: empowerment or too much information? (англ.) // Canadian Medical Association Journal. — 2018-02-05. — Vol. 190, iss. 5. — P. E124–E125. — ISSN 1488-2329 0820-3946, 1488-2329. — doi:10.1503/cmaj.180076.
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Секвенирование_экзома&oldid=99605792