Питательная среда для эмбрионов
Питательная среда для эмбрионов (культуральная среда для эмбрионов) – водный раствор сложного состава для содержания ранних (преимплантационных) эмбрионов млекопитающих (в том числе человека) в культуре in vitro.
Культуральная среда для эмбрионов используется в сельском хозяйстве, ветеринарии и в научных исследованиях для работы с эмбрионами млекопитающих животных вне организма матери, так как эмбрионы млекопитающих должны постоянно находиться в водной среде. В медицине культуральные среды для эмбрионов используются в программах экстракорпорального оплодотворения для содержания эмбрионов человека в культуре in vitro.
В состав современных культуральных сред для эмбрионов входит около 40 различных веществ, в том числе "физиологические соли", компоненты буферного раствора, энергетические субстраты (глюкоза, пируват, лактат), аминокислоты, витамины, сыворотка крови или её заменители и другие вещества. Часто в состав культуральной среды входят антибиотики и цветовой индикатор кислотности - феноловый красный. Исторически культуральные среды для эмбрионов появились как модификация сред для культивирования клеток. На заре репродуктивной медицины (70-80-е годы XX в.) эмбрионы человека зачастую выращивали в средах для клеточных культур.
По целям применения культуральные среды можно разделить на три категории:
1) Собственно культуральные среды предназначены для длительного содержания эмбрионов в культуре (от нескольких часов до нескольких дней). Эти среды всегда имеют в своём составе бикарбонатный буфер и требуют наличия повышенного содержания углекислого газа в атмосфере (5-7%), поэтому среды этой категории могут быть использованы только совместно с CO2-инкубатором (прибор, поддерживающий определенный газовый состав).
2) Манипуляционные среды предназначены для выполнения манипуляций с эмбрионами вне CO2-инкубатора (например, для выполнения процедуры искусственного оплодотворения яйцеклетки методом ИКСИ). Эти среды, как правило, имеют в своём составе буфер на основе гидроксиэтилпиперазинэтансульфоната (ГЕПЕС-буфер), позволяющий поддерживать физиологический pH вне атмосферы CO2-инкубатора.
3) Специальные среды - это манипуляционные среды, в состав которых введен какой-либо компонент, используемый для специальных задач. Например, среда с гиалуронидазой используется для очищения яйцеклетки от фолликулярных клеток перед процедурой искусственного оплодотворения методом ИКСИ. Или например, растворы для криоконсервации - манипуляционные среды, имеющие в своём составе криопротекторы - используются для замораживания эмбрионов.
Принято выделять 4 поколения культуральных сред для эмбрионов: 1) простые солевые растворы; 2) обогащенные среды; 3) двуступенчатые (двушаговые, секвенциальные) среды; 4) одноступенчатые (одношаговые) среды на основе KSOM (K+ Simple Optimized Medium). Простые солевые растворы использовали для культивирования эмбрионов животных в 50-80 г.г. XX столетия, а также используют до сих пор для простых процедур в репродуктивной медицине (например, обработка спермы), на их основе часто создают специальные среды. Обогащенные среды имеют сложный состав и включают в себя избыточное количество компонентов, многие из которых, как было показано в 90-е годы XX столетия оказывают подавляющий эффект на развитие эмбрионов. Обогащенные среды применяли для культивирования эмбрионов человека с 80-х годов XX столетия до середины 2000-х. Двуступенчатые среды представляют собой пару сред сходного состава, первая из которых применяется в первые 2 дня развития эмбриона человека, вторая - с 3 по 5 день развития эмбриона человека. Принцип двуступенчатых сред основан на концепции различий в потребности эмбрионов разного возраста в концентрации глюкозы и аминокислот. Двуступенчатые среды превосходят по эффективности культивирования обогащенные среды, их применение в медицине началось с середины 2000-х и продолжается по настоящее время. Джон Биггерс - разработчик среды KSOM - отрицает существование различных потребностей в компонентах среды у эмбрионов первых двух дней развития и 3-5 дней развития. Он утверждает, что эксперименты, указывающие на токсическое влияние избытка глюкозы и некоторых аминокислот, являются эффектом несовершенства сред. Разработанная им среда KSOM, в которой изменены пропорции физиологических солей, не показывает эффекта токсичности глюкозы и аминокислот на ранние эмбрионы. Таким образом, среды на основе KSOM одинаково подходят для всех стадий и являются универсальными (одношаговыми). Среды на основе KSOM применяются в репродуктивной медицине с начала 10-х годов XXI столетия. В настоящее время двушаговые среды и среды на основе KSOM соперничают друг с другом по эффективности, но намечается тенденция к постепенному вытеснению двушаговых сред из репродуктивной медицины.
История
[править | править код]Концепция помещения эмбрионов в питательную среду пришла из сельского хозяйства. Технология ускорения роста через замачивание семян, с целью растворить химические элементы в семенной оболочке использовалась еще в Древнем Египте. Впоследствии в растворы стал добавляться гумус, где основным элементом была гуминовая кислота, соедержащая глутаминовую кислоту, которая в XX веке стала использоваться для экспериментов по развитию эмбрионов.
К концу XIX века в медицине накопилась статистика наблюдений, обобщенная в концепцию Milieu intérieur «Внутренняя среда организма» французским ученым Клодом Бернардом. Он заявил, что жидкости в организме являются такими же важными, как и сами органы, фактически являясь жидкими органами, функционируя как микромеханические посредники при передаче и обмене энергией.
В 1880-х английский фармацевт Самюэль Рингер установил, что в растворе для перфузии сердца лягушки должны содержаться соли натрия, калия и кальция в найденной им пропорции, чтобы изолированное сердце лягушки продолжало биться в течение длительного времени. Раствор Рингера стал основной для экспериментов с эмбрионами животных во многих странах.
В 1910 году американский фармацевт Морис Тироде создает раствор Тироде (thyrode solution Т6) – усовершенствованный раствор Рингера для питания соматических клеток животных.
В 1943 в Институте онкологии США цитолог и генетик Вильям Эрл создал буферный раствор Эрла, по PH идентичный человеческой крови.
В 1963 году в лаборатории доктора Джорджа Ерганана в Исследовательском фонде рака Бостона был разработан масло-жировой раствор Ham's F-10 (Hamster хомяк, F – fluid – жидкость, 10 – номер версии с момента запуска клеточной линии в 1957 году). Раствор предназначался для питания бессмертной клеточной линии яичника Китайского Хомяка Cricetulus griseus. По сравнению с другими базальными средами F-10 содержала намного более широкий спектр компонентов, включая цинк, гипоксантин и тимидин. Эта среда была первой, содержащей микроэлементы - медь и цинк. В раствор входило 45 компонентов: 20 аминокислот, 10 витаминов, 10 солей, декстроза, гипоксантин, липоевая кислота, пируват натрия – как дополнительный источник энергии клеток, тимидин для синхронизации клеток в фазе митоза.
В 1978 году раствор Эрла, Ham's F10 и раствор Тироде Т6 были использованы Робертом Эдвансом для первого ЭКО.
До 1990-х годов клиники, которые осуществляли ЭКО, либо готовили культуральные среды самостоятельно, либо покупали готовые среды для клеточных культур (например, Ham's F10 или Medium-199).
В 1988 году в продажу поступила первая коммерчески доступная среда для эмбрионов, разработанная компанией MediCult (Дания). Это был модифицированный раствор Эрла.
Состав
[править | править код]В настоящее время на рынке имеется около 20 видов питательных сред от разных производителей. Питательные среды для выращивания эмбрионов постоянно совершенствуются. Основными элементами современных питательных сред для эмбрионов являются:
- Вода (питательная среда на 99% состоит из воды, отфильтрованной под давлением);
- Синтетическая сыворотка, насыщенная глобулинами;
- Рекомбинатный альбумин;
- Соли (хлорид натрия, хлорид калия, дигидроортофосфат калия, гидрокарбонат натрия и другие.);
- Углеводы: углеводы присутствуют в репродуктивных путях женщины. Их концентрация различна на всем протяжении фаллопиевых труб и матки и зависит от фазы менструального цикла. Вместе с аминокислотами углеводы являются основным источником энергии для эмбриона;
- Аминокислоты: cреды, используемые для поддержки развития от зиготы до восьмиклеточного эмбриона, содержат незаменимые аминокислоты. В питательные среды, где эмбрион культивируется с восьмиклеточной стадии до бластоцисты, добавляют заменимые аминокислоты;
- Антибиотики: Большинство лабораторий используют питательные среды, содержащие антибиотики для минимизирования риска роста микробов. Наиболее часто используется пенициллин (действующий на грамположительные бактерии) и стрептомицин (действующий на грамотрицательные бактерии). Использование гентамицина все еще обсуждается и лишь некоторые лаборатории добавляют его;
- этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) используется для лучшей усвояемости веществ. Кроме того, она предотвращает гликолиз (расщепление глюкозы);
- GM-CSF (фактор роста), содержащийся в матке (среда EmbrioGen).
См. также
[править | править код]Ссылки
[править | править код]Шафеи Р.А. Химия и биохимия культуральных сред (вебинар)
Embryo culture media for human IVF: which possibilities exist? Irmhild Gruber and Matthias Klein
IVF culture media: past, present and future. Elpiniki Chronopoulou1, and Joyce C. Harper
Production of Malignancy in Vitro. The Mouse Fibroblast Cultures and Changes Seen in the Living Cells. WILTON R. EARLE, EDWARD L. SCHILLING,THOMAS H. STARK, NANCY P. STRAUS, MARY F. BROWN, EMMA SHELTON Архивная копия от 22 декабря 2018 на Wayback Machine
 | В статье есть список источников, но не хватает сносок. |