FAIRE-Seq: различия между версиями

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Интерактивная навигация по истории
[непроверенная версия][непроверенная версия]
← Предыдущая правкаСледующая правка →
Содержимое удалено Содержимое добавлено
ВизуальныйВики-текст
bibliography
Нет описания правки
Строка 3: Строка 3:


== Описание метода ==
== Описание метода ==
FAIRE — один из методов картирования областей [[Открытый хроматин|открытого хроматина]] наряду с определением участков, гиперчувствительных к [[Дезоксирибонуклеаза I|ДНКазе ]]I, ([[DNase-seq]]) и [[Иммунопреципитация|иммунопреципитации]] хроматина ([[ChIP-seq]], ChIP-on-chip). Идея была предложена в 2003 г. и заключалась в фракционировании хроматина ''[[Saccharomyces cerevisiae]] ''на 2 части: первая — участки, транскрибируемые [[РНК-полимераза|РНК-полимеразой]] II, вторая — некодирующие последовательности и транскрибируемые РНК-полимеразами I или III. В основе разделения лежит разная степень сшивания формальдегидом отдельных регионов хроматина. В 2007 г. метод прошел валидацию для определения регионов, связанных с регуляторной активностью, в хроматине человека и получил свое название FAIRE. На сегодняшний день существует несколько вариантов протокола, предназначенных для тканей животных и растений<ref name=":0">{{Cite pmid|24373132}}</ref>. При работе с растениями требуются более жесткие условия и продолжительное время фиксации формальдегидом из-за клеточной стенки, восковой кутикулы листьев и воздушных пространств в [[Мезофилл|губчатом мезофилле]]. Кроме картирования регуляторных участков, позволяет сравнивать активные элементы в разных тканях (как опухолевых, так и здоровых)<ref>{{Cite pmid|22262007}}</ref>. Эксперименты с использованием FAIRE-seq занимают в среднем около трех дней, не включая анализ и интерпретацию полученных данных.
FAIRE — один из методов картирования областей [[Открытый хроматин|открытого хроматина]] наряду с определением участков, гиперчувствительных к [[Дезоксирибонуклеаза I|ДНКазе ]]I, ([[DNase-seq]]) и [[Иммунопреципитация|иммунопреципитации]] хроматина ([[ChIP-seq]], ChIP-on-chip). Идея была предложена в 2003 г. и заключалась в фракционировании хроматина ''[[Saccharomyces cerevisiae]] ''на 2 части: первая — участки, транскрибируемые [[РНК-полимераза|РНК-полимеразой]] II, вторая — некодирующие последовательности и транскрибируемые РНК-полимеразами I или III. В основе разделения лежит разная степень сшивания формальдегидом отдельных регионов хроматина. В 2007 г. метод прошел валидацию для определения регионов, связанных с регуляторной активностью, в хроматине человека и получил свое название FAIRE. На сегодняшний день существует несколько вариантов протокола, предназначенных для тканей животных и растений<ref name=":0">{{Cite pmid|24373132}}</ref>. При работе с растениями требуются более жесткие условия и продолжительное время фиксации формальдегидом из-за клеточной стенки, восковой кутикулы листьев и воздушных пространств в [[Мезофилл|губчатом мезофилле]]. Кроме картирования регуляторных участков, позволяет сравнивать активные элементы в разных тканях (как опухолевых, так и здоровых)<ref name=":1">{{Cite pmid|22262007}}</ref>. Эксперименты с использованием FAIRE-seq занимают в среднем около трех дней, не включая анализ и интерпретацию полученных данных.


== Стадии ==
== Стадии ==
Строка 14: Строка 14:
# Анализ фрагментов ДНК.
# Анализ фрагментов ДНК.
Далее в зависимости от метода анализа полученных участков ДНК выделяют ''FAIRE-seq'' (высокопроизводительное секвенирование фрагментов ДНК, например используя [[Illumina/Solexa method|Illumina]]), ''FAIRE-chip'' (гибридизация флуоресцентномеченных фрагметов ДНК с [[ДНК-микрочип]]ами), ''FAIRE-qPCR ''(количественный анализ участков ДНК с помощью [[ПЦР в реальном времени]]). Сейчас ''FAIRE-seq'' почти полностью вытеснил другие способы детекции экстрагированных фрагментов ДНК.
Далее в зависимости от метода анализа полученных участков ДНК выделяют ''FAIRE-seq'' (высокопроизводительное секвенирование фрагментов ДНК, например используя [[Illumina/Solexa method|Illumina]]), ''FAIRE-chip'' (гибридизация флуоресцентномеченных фрагметов ДНК с [[ДНК-микрочип]]ами), ''FAIRE-qPCR ''(количественный анализ участков ДНК с помощью [[ПЦР в реальном времени]]). Сейчас ''FAIRE-seq'' почти полностью вытеснил другие способы детекции экстрагированных фрагментов ДНК.

Для анализа данных секвенирования требуется выравнивать последовательности с референсным геномом, для чего используется, например, [http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml Bowtie]. Затем производится поиск значимых участков (''significant enrichment regions''). Для этих целей рекомендуется<ref name=":1" /> использование [https://code.google.com/p/zinba/ ZINBA].


== Суть метода ==
== Суть метода ==
[[Файл:Faire scheme.png|мини|Принцип метода FAIRE|404x404px]]
[[Файл:Faire scheme.png|мини|Принцип метода FAIRE|404x404px]]
В эукариотических клетках открытый хроматин наблюдается в активных регуляторных областях, поэтому выделение участков, небогатых нуклеосомами, позволило бы картировать регуляторные элементы генома вне зависимости от типа клеток. При добавлении формальдегида к культуре ткани образуются сшивки (crosslinking) между белками, белками и нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК и гистонами или между гистонами. При последующей экстракции фенол-хлороформом свободная от белков ДНК будет находится в водной фазе, а ковалентно связанные ДНК-белковые комплексы — на границе раздела фаз. Таким образом, участки генома, ассоциированные с регуляторной активностью и свободные от нуклеосом (или с небольшим их количеством), находятся над границей раздела фаз в воде. Они могут быть извлечены оттуда, еще раз очищены от оставшихся белков с помощью фенол-хлороформа и [[Спиртовое осаждение|переосаждены]]. Последующая обработка РНКазой А позволит избавится от РНК, оставшихся в полученном растворе. В качестве контроля используется образец ДНК, полученный из той же культуры ткани с помощью тех же процедур, но без фиксации формальдегидом. (про ZINBA, Bowtie)
В эукариотических клетках открытый хроматин наблюдается в активных регуляторных областях, поэтому выделение участков, небогатых нуклеосомами, позволило бы картировать регуляторные элементы генома вне зависимости от типа клеток. При добавлении формальдегида к культуре ткани образуются сшивки (crosslinking) между белками, белками и нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК и гистонами или между гистонами. При последующей экстракции фенол-хлороформом свободная от белков ДНК будет находится в водной фазе, а ковалентно связанные ДНК-белковые комплексы — на границе раздела фаз. Таким образом, участки генома, ассоциированные с регуляторной активностью и свободные от нуклеосом (или с небольшим их количеством), находятся над границей раздела фаз в воде. Они могут быть извлечены оттуда, еще раз очищены от оставшихся белков с помощью фенол-хлороформа и [[Спиртовое осаждение|переосаждены]]. Последующая обработка РНКазой А позволит избавится от РНК, оставшихся в полученном растворе. В качестве контроля используется образец ДНК, полученный из той же культуры ткани с помощью тех же процедур, но без фиксации формальдегидом.


== Применение ==
== Применение ==
Строка 24: Строка 26:
* Идентификация индуцируемых регуляторных участков генома
* Идентификация индуцируемых регуляторных участков генома
* Поиск целевых [[Промотор|промоторов]] опухолевых факторов
* Поиск целевых [[Промотор|промоторов]] опухолевых факторов
* Обнаружение и проверка потенциальных участков свободного, не связанного с нуклеосомами, хроматина
* Обнаружение и проверка потенциальных участков свободного, не связанного с нуклеосомами, хроматина <ref>{{Cite pmid|23656909}}</ref>
* Оценка вариабильности нуклеотидного состава регуляторных участков в различных популяциях
* Оценка вариабильности нуклеотидного состава регуляторных участков в различных популяциях


Версия от 16:42, 9 мая 2014

FAIRE-Seq (англ. Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements sequencing) — метод молекулярной биологии, используемый для определения регуляторных участков последовательности ДНК[1]. FAIRE-Seq является комбинацией метода выделения регуляторных элементов хроматина (FAIRE) и высокопроизводительного секвенирования.

Описание метода

FAIRE — один из методов картирования областей открытого хроматина наряду с определением участков, гиперчувствительных к ДНКазе I, (DNase-seq) и иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq, ChIP-on-chip). Идея была предложена в 2003 г. и заключалась в фракционировании хроматина Saccharomyces cerevisiae на 2 части: первая — участки, транскрибируемые РНК-полимеразой II, вторая — некодирующие последовательности и транскрибируемые РНК-полимеразами I или III. В основе разделения лежит разная степень сшивания формальдегидом отдельных регионов хроматина. В 2007 г. метод прошел валидацию для определения регионов, связанных с регуляторной активностью, в хроматине человека и получил свое название FAIRE. На сегодняшний день существует несколько вариантов протокола, предназначенных для тканей животных и растений[2]. При работе с растениями требуются более жесткие условия и продолжительное время фиксации формальдегидом из-за клеточной стенки, восковой кутикулы листьев и воздушных пространств в губчатом мезофилле. Кроме картирования регуляторных участков, позволяет сравнивать активные элементы в разных тканях (как опухолевых, так и здоровых)[3]. Эксперименты с использованием FAIRE-seq занимают в среднем около трех дней, не включая анализ и интерпретацию полученных данных.

Стадии

Схематичное представление метода FAIRE
  1. Фиксация клеток формальдегидом.
  2. Лизис клеток и ультразвуковая фрагментация хроматина на участки длинной в 300—400 пар оснований.
  3. Очистка лизата от клеточной массы.
  4. Экстракция ДНК фенол-хлороформом.
  5. Высаживание участков ДНК, содержащихся в водной фазе при экстракции фенол-хлороформом, с последующей обработкой рибонуклеазой А.
  6. Анализ фрагментов ДНК.

Далее в зависимости от метода анализа полученных участков ДНК выделяют FAIRE-seq (высокопроизводительное секвенирование фрагментов ДНК, например используя Illumina), FAIRE-chip (гибридизация флуоресцентномеченных фрагметов ДНК с ДНК-микрочипами), FAIRE-qPCR (количественный анализ участков ДНК с помощью ПЦР в реальном времени). Сейчас FAIRE-seq почти полностью вытеснил другие способы детекции экстрагированных фрагментов ДНК.

Для анализа данных секвенирования требуется выравнивать последовательности с референсным геномом, для чего используется, например, Bowtie. Затем производится поиск значимых участков (significant enrichment regions). Для этих целей рекомендуется[3] использование ZINBA.

Суть метода

Принцип метода FAIRE

В эукариотических клетках открытый хроматин наблюдается в активных регуляторных областях, поэтому выделение участков, небогатых нуклеосомами, позволило бы картировать регуляторные элементы генома вне зависимости от типа клеток. При добавлении формальдегида к культуре ткани образуются сшивки (crosslinking) между белками, белками и нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК и гистонами или между гистонами. При последующей экстракции фенол-хлороформом свободная от белков ДНК будет находится в водной фазе, а ковалентно связанные ДНК-белковые комплексы — на границе раздела фаз. Таким образом, участки генома, ассоциированные с регуляторной активностью и свободные от нуклеосом (или с небольшим их количеством), находятся над границей раздела фаз в воде. Они могут быть извлечены оттуда, еще раз очищены от оставшихся белков с помощью фенол-хлороформа и переосаждены. Последующая обработка РНКазой А позволит избавится от РНК, оставшихся в полученном растворе. В качестве контроля используется образец ДНК, полученный из той же культуры ткани с помощью тех же процедур, но без фиксации формальдегидом.

Применение

С помощью FAIRE-seq решаются следующие задачи:

  • Описание активных регуляторных элементов генома
  • Идентификация индуцируемых регуляторных участков генома
  • Поиск целевых промоторов опухолевых факторов
  • Обнаружение и проверка потенциальных участков свободного, не связанного с нуклеосомами, хроматина [4]
  • Оценка вариабильности нуклеотидного состава регуляторных участков в различных популяциях

Преимущества

  • Не требует предварительной обработки клеток; формальдегид добавляется в питательную среду или напрямую к ткани, быстро приводит к клеточной смерти, что позволяет получить хроматин в состоянии, предшествующем фиксации.
  • В отличие от DNase-seq, не зависит от используемого фермента, для которого необходимо каждый раз в зависимости от производителя подбирать подходящую концентрацию. В FAIRE разное время фиксации формальдегидом при одинаковой его концентрации дает одинаковый результат.
  • В отличие от ChIP, метод не зависит от свойств антител и не подразумевает использование ферментов. Меньшее количество подготовительных процедур делает метод менее вариабельным, более надежным и воспроизводимым.
  • Более высокая чувствительность[5].

Ограничения

  • Детекция промотеров осуществляется хуже, чем другими методами[5].
  • Метод позволяет детектировать мотивы транскрипционных факторов только неспецифически.
  • Низкое оношение сигнал/шум.
  • Эффективность фиксации тканей варьирует в зависимости от свойств ткани (чистота, проницаемость, плотность клеток). Поэтому возможно искажение результатов эксперимента.

Примечания

  1. ↑ Giresi P. G., Kim J., McDaniell R. M., Iyer V. R., Lieb J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. (англ.) // Genome research. — 2007. — Vol. 17, no. 6. — P. 877—885. — doi:10.1101/gr.5533506. — PMID 17179217. [исправить]
  2. ↑ Omidbakhshfard M. A., Winck F. V., Arvidsson S., Riaño-Pachón D. M., Mueller-Roeber B. A step-by-step protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements from Arabidopsis thaliana. (англ.) // Journal of integrative plant biology. — 2014. — Vol. 56, no. 6. — P. 527—538. — doi:10.1111/jipb.12151. — PMID 24373132. [исправить]
  3. ↑ 1 2 Simon J. M., Giresi P. G., Davis I. J., Lieb J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. (англ.) // Nature protocols. — 2012. — Vol. 7, no. 2. — P. 256—267. — doi:10.1038/nprot.2011.444. — PMID 22262007. [исправить]
  4. ↑ Yang C. C., Buck M. J., Chen M. H., Chen Y. F., Lan H. C., Chen J. J., Cheng C., Liu C. C. Discovering chromatin motifs using FAIRE sequencing and the human diploid genome. (англ.) // BMC genomics. — 2013. — Vol. 14. — P. 310. — doi:10.1186/1471-2164-14-310. — PMID 23656909. [исправить]
  5. ↑ 1 2 Song L., Zhang Z., Grasfeder L. L., Boyle A. P., Giresi P. G., Lee B. K., Sheffield N. C., Gräf S., Huss M., Keefe D., Liu Z., London D., McDaniell R. M., Shibata Y., Showers K. A., Simon J. M., Vales T., Wang T., Winter D., Zhang Z., Clarke N. D., Birney E., Iyer V. R., Crawford G. E., Lieb J. D., Furey T. S. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. (англ.) // Genome research. — 2011. — Vol. 21, no. 10. — P. 1757—1767. — doi:10.1101/gr.121541.111. — PMID 21750106. [исправить]
Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=FAIRE-Seq&oldid=62976499