Криобиология

Криобиоло́гия (от др.-греч. κρύος — «холод», βίος — «жизнь» и λόγος — «учение») — раздел биологии, предметом изучения которого является воздействие низких температур на различные биологические процессы, отдельные части живых организмов либо организмы в целом.

История

В 1662 год у Роберт Бойль, ирландский философ и ученый, публикует закон Бойля, описывающий обратную зависимость между давлением и объемом газа при постоянной температуре, что имеет значение для понимания поведения клеток при криоконсервации^[1].

В 1677 году было изобретено устройство, необходимое для понимания биологии на клеточном уровне – микроскоп Антони ван Левенгука, с помощью которого он наблюдал "анималькулей" в семенной жидкости^[1]. Лаззаро Спалланцани в 1776 году, используя микроскоп Левенгука, описал анималькулей в сперме различных животных и впервые задокументировал их реакцию на разные температуры, отметив выживаемость при низких температурах^[1]. В 1779 году Карл Шееле открыл глицерин, имеющий большое значение для криобиологии, фармацевтики и пищевой промышленности^[1].

В 1840 году Дж. Л. Превост и Дж.Б. Дюма независимо друг от друга обнаружили, что сперматозоиды образуются в семенниках, опровергнув теорию о паразитах, и показали, что для оплодотворения необходимы обе гаметы^[1]. Паоло Мантегацца в 1866 году предсказал будущее существование банков спермы и возможность искусственного оплодотворения замороженной спермой. В 1878 году Самуэль Леопольд Шенк проводит первую попытку ЭКО с яйцеклетками млекопитающих, работая с яйцеклетками кролика и морской свинки.^[1]

В 1930 год у Уолтон и Хаммонд публикуют исследования о хранении спермы кролика при 0°C и 10°C, демонстрируя сохранение фертильности спермы при 10°C более 100 часов и предвидя использование авиаперевозок для транспортировки спермы^[1]. В 1938 год у Базиль Люйе и Юджин Ходапп публикуют результаты экспериментов по витрификации спермы лягушки в жидком воздухе, демонстрируя защитный эффект дегидратации с помощью сахарозы перед заморозкой^[1]^[2]. В 1945 году Алан Паркс демонстрирует, что большие объемы человеческой спермы, замороженные в ампулах, имеют лучшую морозостойкость, чем меньшие количества, и что медленное замораживание менее вредно для клеток, чем быстрое^[1].

В 1949 году Кристофер Полдж, Одри Смит и Алан Паркс случайно открывают криопротекторные свойства глицерина при замораживании спермы петуха, что стало поворотным моментом в криобиологии, положив начало новой эре в сохранении клеток при низких температурах, однако сперма мыши изначально не поддавалась заморозке^[1].

В 1950-е годы использование глицерина исследуется для криоконсервации ооцитов мыши, овцы и оплодотворенных ооцитов кролика, но с ограниченным успехом. В 1953 год — первое рождение ребенка после использования криоконсервированной спермы человека. В 1954 год у Шерман и Бундж сообщают о первом случае использования замороженной/размороженной спермы умершего человека для оплодотворения его жены^[1].

В 1960-х годах были проведены исследования по физиологии движения воды в клетках и затвердевания жидкости при низких температурах, заложившие фундамент для будущей криобиологии^[2]. Параллельно развивалась витрификация, предложенная Базиль Люйе в 1937, и в 1985 году был разработан метод бескристаллической криоконсервации эмбрионов мыши^[2]. Конец 1960-х - начало 1970-х годов: Питер Мазур устанавливает механизм повреждения клеток при замораживании из-за образования кристаллов льда и определяет оптимальные скорости замораживания и оттаивания для разных типов клеток.

В 1972 году Д. Уиттингем, С. Лейбо и П. Мазур добиваются первой успешной криоконсервации эмбрионов мыши методом медленного замораживания^[1] В 1977 году Уиттингем применяет метод медленного замораживания с диметилсульфоксидом (DMSO) для криоконсервации зрелых ооцитов мыши, добиваясь хорошей выживаемости, нормального оплодотворения и рождения живого потомства^[2].

В 1985 году разработан метод бескристаллической криоконсервации (витрификации) эмбрионов мыши с использованием криопротекторного раствора, способного достигать стеклообразного состояния. В 1986 году Чен сообщает о первой беременности и рождении близнецов после медленного замораживания/быстрого оттаивания ооцитов человека с использованием DMSO ^[2].

В 1993 году в больнице Royal Women's Hospital в Мельбурне открыт первый в мире банк яйцеклеток^[2]. В 1997 году первый ребенок рождается после криоконсервации ооцитов с использованием метода PROH ^[2]. В 1999 году сообщается о первой беременности и рождении ребенка после витрификации ооцитов^[2].

2008 году широкое распространение витрификации ооцитов в связи с демонстрацией результатов, сравнимых с результатами использования свежих ооцитов^[2].

Настоящее время: криоконсервация ооцитов стала рутинной процедурой в программах донорства ооцитов и сохранения фертильности, с более чем 900 рожденными детьми и результатами, аналогичными результатам ЭКО со свежими ооцитами^[2].

Направления исследований

Научные основы криобиологии были заложены в конце XIX века П. И. Бахметьевым^[3] (1860—1913) — выдающимся русским учёным, изучавшим переохлаждение и анабиоз у насекомых и летучих мышей. Большой вклад в криобиологию внесли французский физиолог растений П. Беккерель^[вд](1879—1955) и австрийский учёный Г. Рам, которые установили, что многие микроорганизмы, беспозвоночные животные (например, тихоходки), а также споры и семена растений могут переносить охлаждение, близкое к абсолютному нулю. Также ими было показано, что и некоторые растения и высокоорганизованные животные (например, гусеницы) могут пережить такое охлаждение^[4].

Одной из задач современной криобиологии является изучение устойчивости микроорганизмов, растений и животных (как в целом, так и отдельных клеток, тканей и органов) к воздействию холода, переохлаждению и замерзанию (в частности — вопросы холодостойкости и морозостойкости растений) и разработка методов их защиты и адаптации (в том числе разработку методов закаливания растений)^[3].

Другие задачи криобиологии связаны с изучением механизмов спячки и анабиоза, установлением минимальных температур, при которых может существовать жизнь, а также разработкой методов криоконсервации^[3] клеток, тканей, гамет и эмбрионов животного и человеческого происхождения для длительного сохранения в медицинских целях (для этих целей требуются специальные вещества, защищающие клетки во время замораживания и размораживания, — криопротекторы). Среди других задач — сохранение органов в гипотермических условиях для трансплантации, лиофилизация фармацевтических препаратов.

Одним из перспективных направлений в криобиологии является криохирургия — отрасль медицины, основным метод лечения в которой является низкотемпературное воздействие на очаги болезни. Глубоко охлаждённые участки патологически изменённых тканей человеческого организма (например, злокачественные опухоли) подвергаются разрушению — криогенной деструкции^[5].

На практике, в рамках криобиологии занимаются исследованиями биологических объектов или систем при температурах ниже нормальных. Температурный рабочий диапазон в криобиологии начинается от умеренно низких (близких к 0 °C) и заканчивается температурами, близкими к абсолютному нулю^[3].

Проблемам криобиологии посвящены специальные журналы, регулярно организуются международные симпозиумы и конференции криобиологов^[4]. Результаты криобиологических исследований находят своё применение в решении задач по длительному сохранению растений, клеточных культур, эмбрионов при ЭКО, икры редких рыб и т. п.

Клеточная криобилогия

Клеточная криобиология представляет собой научную дисциплину, оценивающую влияние отрицательных (≤0^∘C) и сверхнизких (−80±5^∘C и ниже) температур на целостность и функциональность клеток. Системы сохранения клеточного материала классифицируют на три категории: консервация в жидком состоянии (гипотермия выше 0^∘C), хранение в замороженном состоянии при сверхнизких температурах (криохранение) и культивирование клеток в искусственной среде (нормотермическое хранение). Ключевой задачей криоконсервации является минимизация термических повреждений («криоповреждений»), которые возникают вследствие двух основных механизмов: «эффекта раствора» (обезвоживание и осмотический стресс при медленном охлаждении) и механического повреждения клеточных структур кристаллами льда (при быстром охлаждении). Оптимизированные протоколы стремятся к достижению витрификации — биофизического процесса перехода жидкости в аморфное стеклообразное состояние, исключающего кристаллизацию^[6].

Криопротекторы и механизмы защиты

Для предотвращения гибели клеток используют специфические криопротекторные агенты, которые делят на проникающие (внутриклеточные) и непроникающие (внеклеточные). К проникающим относятся глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО), действующие как акцепторы водородных связей. Глицерин (молярный объем 40,7 мл) проникает в клетки медленно, тогда как ДМСО обеспечивает быструю диффузию, но проявляет токсичность в высоких концентрациях. Непроникающие агенты, такие как гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) с молекулярной массой от 150 до 450 кДа и выше, работают преимущественно во внеклеточном пространстве, абсорбируя молекулы воды и способствуя витрификации. Эффективность криозащиты зависит от скорости охлаждения: контролируемое замораживание (обычно 1^∘C/мин) с компенсацией теплоты фазового перехода (2^∘C/мин) считается более результативным для сохранения жизнеспособности клеток по сравнению с неконтролируемым методом^[6].

Практическое применение криобиологии

Практическое применение методов криобиологии берет начало в 1949 году, когда была проведена успешная консервация сперматозоидов птиц с использованием глицерина. В дальнейшем технологии адаптировали для замораживания гемопоэтических клеток-предшественников и клеток крови человека. Сегодня клинические протоколы позволяют эффективно сохранять стволовые клетки, лимфоциты, гранулоциты и тромбоциты. Для защиты биологического материала применяют проникающие и непроникающие криопротекторы (диметилсульфоксид, глицерин, гидроксиэтилкрахмал), а хранение осуществляют в механических морозильниках при температуре -130 ± 10 °C или в жидком азоте при -196 °C^[6].

Ключевым достижением отрасли является внедрение процедур трансплантации стволовых клеток для лечения онкогематологических заболеваний (лейкозов, лимфом, множественной миеломы), апластической анемии и рассеянного склероза. Для подготовки пациентов используют режимы мобилизации клеток с введением гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 12–16 мкг/кг массы тела, а при недостаточном ответе добавляют препарат плериксафор (24–48 мг). Установлено, что успешное приживление трансплантата обеспечивается при получении количества CD34+ клеток в диапазоне 2–4 × 10⁶ на кг массы тела, предпочтительно ≥ 5 × 10⁶/кг. Сбор материала начинают при уровне циркулирующих клеток 20 × 10⁶/л и выше^[6].

В исследованиях определены оптимальные параметры криоконсервации, влияющие на восстановление кроветворения. Выявлено, что для сохранения более зрелых клеток-предшественников эффективна концентрация диметилсульфоксида 5%, тогда как для примитивных стволовых клеток, отвечающих за репопуляцию костного мозга, требуется концентрация 10%. При использовании протоколов контролируемого замораживания восстановление уровня нейтрофилов и тромбоцитов у пациентов происходит в среднем на 12-й день (диапазоны 6–26 и 5–44 дня соответственно). Для тромбоцитов наилучшие показатели сохранности достигнуты при использовании 6% криопротектора и скорости охлаждения 1 °C/мин^[6].